Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật nested RT-PCR trong xác định ARN của virut Rubella đã được công bố trước đây. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG XÁC ĐỊNH ARN RUBELLA Nguyễn Duy Bắc*; Dương Thuận Thiên *; Lê Thị Dung* Nguyễn Viết Trung*; Đặng Tiến Trường*; Trịnh Hải Tuấn TÓM TẮT Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” virut Rubella gây nên, bệnh thường nhẹ, biến chứng lại gây nhiều biến chứng thai nhi, đặc biệt tháng đầu thai kỳ Chẩn đoán nhiễm Rubella sớm giúp kiểm soát tốt dịch, hạn chế biến chứng, đặc biệt phụ nữ có thai Nghiên cứu nhằm đánh giá độ xác kỹ thuật nested RT-PCR công bố trước xác định ARN virut Kết cho thấy, kỹ thuật nested -6 RT-PCR có độ nhạy độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát thấp 10 ng/ul Kỹ thuật nested RT-PCR giúp chẩn đốn nhanh, xác Rubella kiểm sốt dịch hiệu Sử dụng kỹ thuật cho chẩn đoán trước sinh Rubella giúp hạn chế số ca nhiễm Rubella bẩm sinh * Từ khóa: Virut Rubella; Nested RT-PCR; ARN; Độ nhạy; Độ đặc hiệu SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF NESTED RT-PCR IN DETECTION OF RUBELLA RNA Summary Typhus rubella or "German measles" caused by Rubella virus is a mild disease with fewer complications but does more harm to fetus in pregnant women, especially in the first months of pregnancy Early diagnosis can control Rubella epidemic, limitation of losses, especially for pregnant women This study aimed to evaluate the accuracy of previously published nested RT-PCR technique in determining RNA viruses Results showed that nested RT-PCR technique -6 had high sensitivity and specificity (100%), a low detection threshold 10 ng/ul Thus, nested RT-PCR help diagnose Rubella rapidly and accurately and control the epidemic effectively Using this technique for prenatal diagnosis of Rubella will limit cases of congenital Rubella infection * Key words: Rubella virus; Nested RT-PCR, RNA; Sensitivity; Specificity ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” virút Rubella gây nên, hay gặp chủ yếu trẻ em, thiếu niên người trẻ tuổi [4] Bệnh thường nhẹ, biến chứng Tuy nhiên, phụ nữ mang thai nhiễm Rubella gây nhiều biến chứng như: sẩy thai, thai chết lưu, dị tật thai nhi… Thai phụ mang thai nhiễm Rubella, thai nhi có nguy bị nhiễm Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella Infection - CRI) bị hội chứng Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella Syndrome - CRS) [11] * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac-hvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 15/12/2013: Ngày phản biện đánh giá báo: 24/01/2014 Ngày báo đăng: 11/02/2014 16 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 Chẩn đoán Rubella lâm sàng khó xác Rubella số nhiều nguyên nhân gây sốt có phát ban khác virút sởi, dengue, parvovirus B19, Chikungunya [5] Chẩn đốn nhiễm Rubella cấp tính chủ yếu dựa vào phương pháp phát hiệu giá kháng thể IgM, chuyển đảo huyết từ IgG (-) sang IgG (+) Gần đây, số kỹ thuật ứng dụng để chẩn đoán virut Rubella kỹ thuật sinh học phân tử Chúng xây dựng kỹ thuật nested RT-PCR áp dụng nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân [1] Thời điểm đó, số lượng mẫu chứng mẫu bệnh chưa đủ lớn nên chưa đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu giới đánh giá kỹ thuật nested RTPCR có độ xác cao Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng chẩn đoán nhiễm Rubella trước sau sinh [5, 9, 10] Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật nested RT-PCR xác định ARN virut Rubella công bố trước ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 60 mẫu bệnh phẩm virut Rubella chẩn đoán xác định phương pháp phân lập virut 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm loại vi khuẩn virut khác gây triệu chứng phát ban Rubella gồm: 12 mẫu sởi (ARN), 20 mẫu dengue (ARN), mẫu parvovirus B19 (ADN), mẫu Chikungunya (ARN) 16 mẫu Coxsackie A (ARN), 01 mẫu adeno virut (ADN) Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Pasteur Nha Trang cung cấp Primer cho phản ứng nested RT-PCR Bảng 1: Trình tự primer phục vụ nhân ADN virut Rubella Ru1-F Ru1-R Ru2-F Ru2-R CAACACGCCGCACGGACAAC CCACAAGCCGCGAGCAGTCA CTCGAGGTCCAGGTCCYGCC GAATGGCGTTGGCAAACCGG 8807 ± 8826 8991 ± 8972 8826 ± 8845 8968 ± 8949 66 66 68 64 185bp 143bp Tách chiết ARN Tách ARN virut từ 140 μl dịch chứa tế bào nhiễm virut sau nuôi cấy kit Qiagen ARN mini, theo quy trình chuẩn nhà sản xuất (Qiagen, Đức), ARN tách chiết lưu trữ -80 C sử dụng Phản ứng khuếch đại gen nested RT-PCR - Phản ứng RT-PCR: Bảng 2: Thành phần phản ứng RT-PCR [1] TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 µl 10 QIAGEN OneStep RT-PCR enzyme Mix QIAGEN OneStep RT-PCR buffer 5X Q - Solution dNTP mix 10 mM R1-F R1-R ARN mẫu Nước 22 2 10 50 µl Tổng Chu trình nhiệt gồm giai đoạn sau: chuyển đổi ARN thành cADN 50°C 30 phút, sau biến tính 95°C 15 phút; thực 30 chu kỳ gồm giai đoạn: biến tính 94°C 30 giây, bám mồi 60°C 30 giây, kéo dài 72°C phút Cuối giai đoạn kéo dài 72°C 10 phút - Phản ứng nested PCR: Bảng 3: Thành phần phản ứng nested PCR [1] µl 2+ 10X Buffer (15 mM Mg ) Kapa Taq ADN polymerase (5U/µl) dNTP mix 25 mM R2-F R2-R Sản phẩm RT-PCR (µl) H2O Tổng kéo dài 72°C phút Cuối giai đoạn kéo dài 72°C 10 phút Thực phản ứng PCR máy PCR Ependoft AG Sau nhân ADN đích, điện di sản phẩm ADN agarose gel 2% phân tích kết Sản phẩm ADN phản ứng nested RT-PCR theo lý thuyết 143 bp Thiết bị nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y Hóa chất nghiên cứu gồm Qiagen ARN mini kít, Kit Qiagen onestep, primer Hãng Invitrogen tổng hợp, nước khử ion, agarose, thang ADN chuẩn Hãng Sigma cung cấp Phân tích kết chẩn đốn dựa vào bảng 2x2 để xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết xác định ARN Rubella phản ứng nested RT-PCR 200 bp 100 bp 143 bp 0,2 NC2 0,8 1 38 50 Chu trình nhiệt gồm giai đoạn sau: biến tính 95°C 15 phút; thực 30 chu kỳ gồm giai đoạn: duỗi xoắn 94°C 30 giây, bám mồi 61°C 30 giây, M NC1 M: marker 100; NC1: chứng âm NC phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; - băng sản phẩm phản ứng Ta 570C, 580C, 590C, 600C, 610C, 630C, 640C 20 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 Kết tối ưu hóa máy Eppendorf AG thể hình Từ kết lựa chọn nhiệt độ gắn primer phản ứng nested PCR 61oC Đánh giá độ xác kỹ thuật nested RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella * Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật: Bảng 4: Kết chẩn đoán 120 mẫu kỹ thuật nested RT-PCR Rubella + 60 60 Virut khác 60 60 Cộng 60 60 120 Chúng tơi tính độ nhạy (Se) độ đặc hiệu (Sp) kỹ thuật: - Độ nhạy kỹ thuật nested RT-PCR: Se = [60:(60 + 0)] x 100% = 100% - Độ đặc hiệu kỹ thuật nested RT-PCR: Sp = [60:(60 + 0)] x 100% = 100% Kết tính tốn cho thấy, độ nhạy 100% độ đặc hiệu kỹ thuật 100% Bên cạnh đó, cặp primer phản ứng nested RT-PCR khơng có phản ứng chéo với hệ gen loại virut khác gây triệu chứng phát ban Rubella N2 M N1 - 12 P C M 13 - 27 Hình 2: Kết chẩn đoán mẫu ARN Rubella nested RT-PCR M: marker 100; NC1: chứng âm phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; 1- 27 băng sản phẩm từ mẫu ARN Rubella 21 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 - 12 N2 N1 P M C M 13 - 27 Hình 3: Kết chẩn đốn mẫu nhiễm virut khơng phải Rubella M: marker 100; NC1: chứng âm phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; 27 băng sản phẩm từ mẫu nhiễm virut Rubella 1- * Xác định ngưỡng phát kỹ thuật nested RT-PCR: Đánh giá độ nhạy kỹ thuật ngưỡng phát kỹ thuật nested RT-PCR ARN virut Rubella Để xác định ngưỡng này, chúng tơi sử dụng quy trình nested RT-PCR tối ưu hóa chẩn đốn mẫu ARN Rubella Pha loãng mẫu theo hệ số 10 Sử dụng 01 mẫu chứng dương, tách chiết ARN, đo máy Nano drop Tiến hành pha loãng thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl Tiếp tục pha lỗng dần mẫu ARN virut Rubella có nồng độ 100 ng/µl (tương đương 105 pg/µl) theo cấp số nhân với hệ số 10-1 thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl, 10 ng/µl, ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 103 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl, 10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl 11 10 M NC Hình 4: Kết xác định ngưỡng phát kỹ thuật nested RT-PCR M: marker 100; NC: chứng âm NC phản ứng RT-PCR; 1-11 băng sản phẩm mẫu 100 ng/µl, 10 ng/µl, ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 10-3 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl, 10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl Kết hình cho thấy, thực kỹ thuật nested RT-PCR phát mẫu có chứa nồng độ mức 10-6 ng/µl, tương ứng 0,1 pg/µl Điều cho thấy ngưỡng phát kỹ thuật nested RTPCR thấp BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR nested PCR hiệu chỉnh lại máy Eppendorf AG nên có khác biệt so với chu trình 22 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 nhiệt tối ưu hóa máy ABI 9700 cơng bố trước Độ nhạy kỹ thuật Kết nghiên cứu cho thấy, kỹ thuật nested RT-PCR có độ nhạy 100% Độ nhạy kỹ thuật thể ngưỡng phát ARN virut thấp (10-6 ng/µl) Theo Thanapal AR CS (2008), phương pháp RT-PCR cho có độ nhạy ổn định so với phương pháp real time PCR [10] Cũng theo Bosma CS (1995), RT-PCR có độ nhạy tương đương với copies [6] Trong đó, nghiên cứu Kiyoko Okamoto CS (2011) khẳng định phương pháp real time PCR sử dụng kit Taqman chạy máy hãng ABI cho chẩn đốn dương tính có tối thiểu 10 copies ARN Rubella mẫu [8] Điều cho thấy kỹ thuật RT-PCR ưu so với kỹ thuật real time PCR độ nhạy Độ đặc hiệu Nghiên cứu cho thấy độ đặc hiệu kỹ thuật nested RT-PCR 100% Kết phân tích mẫu virut khác gây triệu chứng phát ban Rubella khơng có phản ứng chéo với loại virut Phản ứng chéo khơng xảy virut có chất ARN giống Rubella ADN không giống Rubella Các nghiên cứu khác giới cho thấy nested RT-PCR có độ đặc hiệu cao (100%) [6] Phạm vi áp dụng kỹ thuật nested RT-PCR chẩn đoán Rubella Nested RT-PCR chẩn đoán dựa sở xác định vật chất di truyền virut Rubella Kỹ thuật tiến hành nhiều loại mẫu khác nhau: mẫu máu, mẫu dịch họng, mẫu thủy tinh thể trẻ sơ sinh chẩn đoán sau sinh mẫu dịch ối chẩn đoán trước sinh Theo Bosma CS (1995), nested RTPCR phương pháp chẩn đoán nhanh, với độ nhạy độ đặc hiệu cao, xác định ARN Rubella nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác Kết xét nghiệm nhận vòng 24 kể từ nhận mẫu, ngược lại, phương pháp phân lập virut phải - tuần Như vậy, RTPCR ưu việt hẳn so với phương pháp phân lập virut thời gian, phức tạp hơn, đòi hỏi thiết bị đơn giản [6, 7] Ưu điểm giúp kỹ thuật áp dụng phạm vi rộng, nhiều địa phương Hơn nữa, phân lập virut gặp khó khăn nh- nồng độ virut thấp dễ dẫn tới âm tính giả Phương pháp huyết học phát IgM IgG kháng virut Rubella phát nhanh, dễ sử dụng, khơng đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ cao làm labo Nhưng kỹ thuật huyết học cần định thời gian, tránh tượng âm tính giả định sớm muộn (chẩn đốn IgM), dẫn tới bỏ sót người mắc bệnh Bên cạnh đó, kỹ thuật huyết học có nhiều nhược điểm áp dụng tuổi thai > 22 tuần, tỷ lệ âm tính giả cao nồng độ kháng thể thấp máu cuống rốn thai nhi bắt buộc phải lấy máu cuống rốn thai nhi, kỹ thuật phức tạp nên tiến hành số bệnh viện chuyên khoa sản khoa [6] Nested RT-PCR có nhiều ưu điểm so với phương pháp phân lập virut phương pháp huyết học độ xác, thời gian trả kết nhanh hơn, đặc biệt, áp dụng chẩn đốn trước sinh nhiễm Rubella bẩm sinh mẫu dịch ối Kỹ thuật có độ đặc hiệu cao độ nhạy tốt kỹ thuật RT-PCR [10] KẾT LUẬN Qua nghiªn cøu trªn 120 mÉu kết cho thấy kỹ thuật nested RT-PCR có độ nhạy độ đặc hiệu 100% Kỹ thuật sử dụng phục vụ kiểm sốt dịch Rubella mức độ phân tử 23 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Duy Bắc CS Nghiên cứu xác định ARN virut Rubella kỹ thuật nested RT-PCR Tạp chí Y học Việt Nam 2013, 470, tr.138-142 Nguyễn Văn Thường, Triệu Thị Thái, Phùng Nhã Hạnh, Nguyễn Văn Bàng Hội chứng Rubella bẩm sinh Hà Nội sau vụ dịch đầu năm 2011 Tạp chí Nghiên cứu Y học 2012 Nguyễn Vũ Trung Virut Rubella Vi sinh y học Nhà xuất Y học Hà Nội 2007, tr.304-307 Banatvala J E., Brown D W Rubella Lancet 2004, 363 (9415), pp.1127-37 Bosma T J, Corbett K M, Eckstein M B, O'Shea S, Vijayalakshmi P, Banatvala J E, Morton K, Best J M Use of PCR for prenatal and postnatal diagnosis of congenital rubella J Clin Microbiol 1995, 33 (11), pp.2881-2887 Cutts F T, Robertson S E, Diaz-Ortega J L, Samuel R Control of Rubella and congenital Rubella syndrome (CRS) in developing countries Part 1: Burden of disease from CRS Bull World Health Organ 1997, 75 (1), pp.55-68 Kiyoko O et al Development of a novel TaqMan RT-PCR assay for detecting rubella virus RNA Journal of Virological Methods 2011, 168, pp.267-271 Kazumi K, Kaneko M, Sameshima H et al Rubella outbreak on Tokunoshima Island in 2004: a population-based study of pregnant women J Obstet Gynaecol Res 2010, 36 (5), pp.938-943 10 Thanapal AR et al Laboratory confirmation of congenital Rubella syndrome in infants: An eye hospital based investigation Journal of Medical Virology 2008, 80, pp.536-546 11 WHO Controlling rubella and preventing congenital Rubella syndrome - global progress 2009 Wkly Epidemiol Rec 2010, 85 (42), pp.413-418 24 ... virut Rubella 1- * Xác định ngưỡng phát kỹ thuật nested RT-PCR: Đánh giá độ nhạy kỹ thuật ngưỡng phát kỹ thuật nested RT-PCR ARN virut Rubella Để xác định ngưỡng này, sử dụng quy trình nested RT-PCR. .. nhiệt độ gắn primer phản ứng nested PCR 61oC Đánh giá độ xác kỹ thuật nested RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rubella * Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật: Bảng 4: Kết chẩn đoán 120 mẫu kỹ thuật nested. .. tối thiểu 10 copies ARN Rubella mẫu [8] Điều cho thấy kỹ thuật RT-PCR ưu so với kỹ thuật real time PCR độ nhạy Độ đặc hiệu Nghiên cứu cho thấy độ đặc hiệu kỹ thuật nested RT-PCR 100% Kết phân