XÁC ĐỊNH độ NHẠY và độ đặc HIỆU của kỹ THUẬT GENOSCHOLAR•PZA TB II PHÁT HIỆN TÍNH KHÁNG THUỐC PYRAZINAMIDE tại BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG

BỘ Y TẾ BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ Tên đề tài XáC ĐịNH Độ NHạY Và Độ ĐặC HIệU CủA Kỹ THUậT GENOSCHOLARPZA-TB II PHáT HIệN TíNH KHáNG THUốC PYRAZINAMIDE TạI BệNH VIệN PHổI TRUNG ƯƠNG Tờn ch nhim ti: PGS.TS Nguyễn Văn Hưng Hà Nội, tháng 02 năm 2019 DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt MGIT Tiếng Anh Tiếng Việt Mycobacterium Môi trường lỏng nuôi cấy Growth Indicator Tube vi khuẩn lao Genoscholar·PZA-TB II PZA-LPA2 MTB Mycobacterium tuberculosis PZA Pyrazinamide WHO World Health Organzation Tổ chức y tế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .3 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .6 2.3 Thiết kế nghiên cứu 2.4 Các kỹ thuật, nguyên vật liệu sử dụng nghiên cứu 2.4.1 Các kỹ thuật 2.4.2 Nguyên vật liệu sử dụng 2.4.3 Trang thiết bị .7 2.4.4 Quy trình thực .7 2.5 Phương pháp thu thập số liệu phân tích thống kê 2.6 Nội dung nghiên cứu biến số đo lường kết 2.7 Kế hoạch nghiên cứu 2.8 Đạo đức nghiên cứu CHƯƠNG III: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10 3.1 Dự kiến độ nhạy độ đặc hiệu 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Gánh nặng lao quan tâm hàng đầu giới Năm 2016, ước tính có 6.3 triệu ca 1.3 triệu người chết lao [1] PZA thành phần quan trọng phác đồ điều trị lao, lao kháng thuốc phác đồ thử nghiệm thuốc lao [2] Theo nghiên cứu hệ thống toàn cầu ước tính tỉ lệ kháng PZA mắc 16,2% (95% CI) số tất thể lao; chiếm 41,3% số bệnh nhân có nguy cao mắc lao đa kháng; chiếm 60,5% số ca lao đa kháng thuốc Cũng theo nghiên cứu này, tồn giới ước tính có khoảng 1,4 triệu ca mắc lao kháng PZA năm; chiếm khoảng 270,000 số bệnh nhân lao đa kháng [3] Việt Nam số 30 quốc gia có gánh nặng lao cao Kháng thuốc mối quan tâm lớn quản lý điều trị lao Các nghiên cứu Việt Nam rằng, tỉ lệ M.tuberculosis kháng pyrazinamide bệnh nhân lao điều trị cao gấp lần so với bệnh nhân lao [4] Các chủng M tuberculosis kháng PZA kháng kết hợp thuốc chống lao hàng khác, đa số chủng kháng PZA kết hợp với đa kháng thuốc [5] Như vậy, thơng tin tình trạng kháng thuốc PZA cần thiết, đặc biệt có ý nghĩa với lao kháng thuốc Việc thực kháng sinh đồ kiểu hình PZA mơi trường lỏng cần trải qua q trình ni cấy có kết sau 3-4 tuần Nếu rút ngắn thời gian thực kháng sinh đồ PZA hỗ trợ đắc lực việc điều trị sớm cho bệnh nhân lao hạn chế tình trạng kháng thuốc lan rộng Điều đặt thách thức mặt thời gian độ xác kỹ thuật chẩn đoán GenoscholarPZA-TB II kit chẩn đoán tính kháng PZA tập đồn NIPRO Nhật Bản Với mục đích đánh giá hiệu kỹ thuật trước đưa vào triển khai Bệnh viện Phổi Trung ương cung cấp chứng khoa học cho việc áp dụng kỹ thuật Việt Nam, thực đề tài “Xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Genoscholar PZA-TB II phát tính kháng thuốc Pyrazinamide Bệnh viện Phổi trung ương” Mục tiêu đề tài Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật GenoscholarPZA-TB II việc phát tính kháng PZA Bệnh viện Phổi Trung ương 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN Bệnh lao mối quan tâm hàng đầu vấn đề sức khỏe toàn giới Trong năm 2016, ước tính có 10.4 triệu người mắc lao mới, 1.7 triệu người tử vong bệnh lao; bên cạnh đó, lao kháng thuốc vấn nạn đe dọa q trình điều trị kiếm sốt bệnh lao: có 490 000 ca lao đa kháng số bệnh nhân lao, 130 000 bệnh nhân lao đa kháng phát báo cáo [1] Pyrazinamide (PZA) thuốc thiết yếu sử dụng phác đồ điều trị lao hoạt động lao tiềm ẩn[6]; phác đồ điều trị lao kháng thuốc, PZA sử dụng giai đoạn cơng trì; PZA quan trọng điều trị bệnh nhân lao có HIV dương tính thuốc khơng có tương tác thuốc-thuốc liệu pháp antiretroviral [7]; PZA thành phần cần thiết phác đồ sử dụng thuốc lao thử nghiệm lâm sàng [2], PZA có tính kìm khuẩn diệt khuẩn với Mycobacterium tuberculosis rút ngắn thời gian điều trị Các nghiên cứu Việt Nam rằng, tỉ lệ M tuberculosis kháng pyrazinamide bệnh nhân lao điều trị cao gấp lần so với bệnh nhân lao [4] Các chủng M tuberculosis kháng PZA kháng kết hợp thuốc chống lao hàng khác, đa số chủng kháng PZA kết hợp với đa kháng thuốc [5] Việc phân chia lao đa kháng thành lao đa kháng nhạy PZA lao đa kháng kháng PZA giúp cải thiện q trình điều trị [8] Xác định tính kháng PZA Tổ chức Y tế giới khuyến cáo có hai phương pháp MGIT960 [9] Phương pháp MGIT960 sử dụng môi trường pH acid 5.9 canh thang Middlebrook 7H9 với nồng độ thuốc PZA 100mg/L để phát phát triển vi khuẩn qua việc sử dụng oxygen thị huỳnh quang gắn vào silicone đáy ống MGIT, so sánh với ống chứng khơng có thuốc PZA hệ thống tự động phân tích đưa kết nhạy kháng Theo báo cáo WHO 2017, dự kiến tương lai cân nhắc kết hợp kháng sinh đồ kiểu gen diễn giải kết theo đột biến để thay cho kháng sinh đồ kiểu hình PZA[1] Việc tìm nguyên nhân chủ yếu gây kháng PZA đột biến gene pncA mã hóa pyrazinamidase/ nicotinamidase giúp chuyển hóa PZA thành dạng hoạt động acid pyrazinoic [10] [11] tạo hội phát tính kháng PZA nhanh chóng kỹ thuật sinh học phân tử, khắc phục hạn chế kháng sinh đồ kiểu hình Khoảng 72-97% lao kháng PZA có đột biến pncA [12] [13], nhiên đột biến phân bố rải rác dọc chiều dài gene pncA gen có 700bp Genoscholar PZA-TB II dựa công nghệ LiPA phát tính kháng PZA dựa gene đích pncA Genoscholar PZA-TB II bao gồm Amplification solution, DNA polymerase cho trình khuếch đại Mycobacterium tuberculosis genomic DNA mẫu bệnh phẩm, màng lai PZA-TB2 (Màng lai PZA-TB2 có 48 mẫu dò phủ tồn vùng pncA, tạo độ nhạy cao để phát kháng PZA), streptavidin alkaline phosphatase, substrate, … để phát DNA khuếch đại DNA vi khuẩn lao chiết tách từ mẫu bệnh phẩm đờm chủng nuôi cấy Mỗi mẫu DNA lại nhân lên bước khuếch đại Các DNA sau khuếch đại lai với DNA đầu dò gắn sẵn màng lai PZA – TB2 Sau trình lai, dung dịch dung dịch liên kết thêm vào để hình thành màu sắc Sự màu sở để phát đột biến gen pncA vi khuẩn lao Kết strip đây: Chúng thực đề tài với mục đích đánh giá hiệu kỹ thuật Genoscholar PZA-TB II trước đưa vào triển khai Bệnh viện Phổi trung ương cung cấp chứng khoa học cho việc áp dụng kỹ thuật Việt Nam 6 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Chủng Mycobacterium tuberculosis (MTB) phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng lưu Khoa Vi sinh Labo lao chuẩn quốc gia 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm: Khoa Vi sinh Labo lao chuẩn quốc gia, bệnh viện Phổi Trung ương - Thời gian: từ tháng năm 2019 đến tháng năm 2019 2.3 Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang so sánh Sử dụng 200 chủng MTB để thực xét nghiệm Genoscholar PZA TB II Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng MGIT960 làm tiêu chuẩn vàng để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo dương tính, giá trị dự báo âm tính chung Genoscholar PZA TB II chẩn đoán lao kháng PZA; độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo dương tính, giá trị dự báo âm tính chủng MTB Các tiêu đánh giá so sánh đồng thời vói MGIT960 2.4 Các kỹ thuật, nguyên vật liệu sử dụng nghiên cứu 2.4.1 Các kỹ thuật - Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc PZA môi trường lỏng - GenoscholarPZA-TB II 2.4.2 Nguyên vật liệu sử dụng - Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc PZA môi trường lỏng: sinh phẩm nuôi cấy lỏng MGIT kháng sinh PZA kèm theo kit hãng - GenoscholarPZA-TB II  Bộ kit GenoscholarPZA-TB II (hãng NIPRO, Japan) gồm: Amplification Solution, DNA Polymerase, Test Strip, Denaturation Solution, Hybridization Solution, Concentrated Rinse Solution, Concentrated Conjugate, Conjugate Diluent, Concentrated Substrate Solution, Substrate Buffer 2.4.3 Trang thiết bị - Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc PZA môi trường lỏng: hệ thống máy BACTEC MGIT, tủ ấm, tủ an toàn sinh học, máy ly tâm, nồi hấp - GenoscholarPZA-TB II: máy MultiBlot NS-4800 (hãng NIPRO, Japan), tủ an toàn sinh học, máy ủ nhiệt khô, máy siêu ly tâm, tủ lạnh 2.4.4 Quy trình thực Từ chủng MTB, cấy truyền sang môi trường MGIT960 đến ngày báo dương thực kỹ thuật  Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc PZA môi trường lỏng: chuẩn bị ống MGIT 960 (1 ống chứng GC ống MGIT PZA) Thêm 0,8ml BACTEC MGIT 960 PZA Supplement vào tuýp Thêm 100µl dung dịch thuốc PZA vào tuýp MGIT PZA Cấy 0,5ml huyền dịch vi khuẩn tỉ lệ 1:10 vào tuýp chứng GC; cấy 0,5ml huyền dịch vi khuẩn tỉ lệ 1:5 vào tuýp MGIT PZA Xếp tuýp vào giá AST theo thứ tự GC, PZA nhập vào máy BACTEC MGIT Đọc kết vòng 4-13 ngày tuýp chứng GC có đủ 400 đơn vị sinh trưởng (Growth unit-GU) Ngưỡng kháng thuốc 100 GU Khi tuýp MGIT PZA có GU