TIỂU LUẬN: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.

CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trịnh Xuân Thảo MSSV: 06126142 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 2 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU: 1. Giới thiệu về salmonella và phương pháp chuẩn doán: a.Đặc diểm hình thái của salmonella: b. Phân loại salmonella c. Các phương pháp chuẩn đoán salmonella 2. Mục tiêu nghiên cứu : 1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. Ưu điểm của PCR đa mồi: III. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu 2. Vật liệu 2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn 2.2. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong PCR 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân b. Xác định độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi 3.2. Độ đặc hiệ u của PCR đa mồi 3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR 4. Xử lý số liệu IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 3 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi V. BÀN LUẬN 1. Độ nhạy của PCR đa mồi 2. Xác định độ đặc hiệu của hệ thống PCR đa mồi VI. KẾT LUẬN - Độ nhạy - Độ đặc hiệu VII. Tài liệu tham khảo CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 4 KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY I. ĐẶT VẤN ĐỀ - Tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe toàn cầu, đặc biệt đối với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp), ở các nước đang phát triển, có ít nhất 1 tỷ tr ường hợp tiêu chảy hàng năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại Việt nam, một số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 - 6 lần. Tại các nước công nghiệp phát triển, tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em và người già. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, trong đó vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của trẻ. Salmonella là một vi khuẩn có phạm vi lây lan rộng, sống trong ruột của chim, loài bò sát và động vật có vú. Nó có thể lây sang người qua nhiều loại thức ăn từ động vật. Những bệnh do chúng gây ra (salmonellosis) tiêu biểu gồm sốt, tiêu chảy và đau bụng. Ở những người có sức khỏe kém hay hệ miễn dịch suy yếu, nó có thể xâm nhập vào máu và gây ra những bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm. Salmonella là một căn nguyên gây tiêu chảy đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Salmonella có thể gây bệnh cho người, động vật hoặc cả cho người và động vật. Một số loài Salmonella CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 5 hay gây bệnh thường gặp là S. typhi, chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn quan trọng nhất. S. paratyphi A, chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ ở nước ta đứng sau S. typhi. S. paratyphi B, chủ yếu gây bệnh ở người. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ vi khuẩn này cao hơn ở Việt Nam. S. paratyphi C, vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả nă ng gây viêm dạ dày-ruột và nhiễm khuẩn huyết. Thường gặp ở các nước Đông Nam Châu Á. S. typhimurium và S.enteritidis vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có khả năng gây bệnh cho động vật. Chúng là nguyên nhân chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do Salmonella. S. choleraesuis là căn nguyên thường gặp trong nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. II. Tổng quan tài liệu: 2. Giới thi ệu về salmonella và phương pháp chuẩn đoán: a.Đặc diểm hình thái của salmonella: Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 µm, có nhiều lông ở xung quanh thân, trừ S.gallinarum và S.pullorum (gây bệnh ở gà vịt). Salmonella được phân lập từ các đại thực bào nhiễm độc CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 6 Salmonella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc được dùng trong phân lập vi khuẩn này từ phân. - Trên môi trường lỏng: sau 5-6h nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18h môi trường đục đều. - Trên môi trường thạch thường: khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, không màu hoặc màu trắng xám. - Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạ c có màu hồng. Salmonella không lên men lactose, lên men đường Glucose thường sinh hơi. Sử dụng được citrat ở môi trường Simomons. Catalase (+), oxidase (-). Lysindecarboxylase (+), onPG (-), urease (-), RM (+), VP (-), H 2 S (-), indol (- ). Tuy nhiên không phải bất kỳ loài nào cũng có đầy đủ các tính chất trên. Những ngoại lệ đã được xác định cần phải biết là: S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi và citrat Simmon (-). Trong loài S.paratyphi A chỉ có Salmonella phát triển trên thạch máu Salmonella quan sát dưới kính hiển vi CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 7 một số chủng sinh H 2 S và ở loài này kết quả thử citrat Simmon (-), lysindecarboxylase (-). S.arizona lên men lactose (tuy có chậm) và onPG (-). Salmonella trên thạch McConkey Salmonella sp. sau 24h trên thạch XLD B. Phân loại: salmonella được phân loại theo 2 cách chính như sau: • Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào: - Giới : Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Salmonella lignieres 1900 - Loài: S. bongori & S. enterica • Về phân loại theo cấu trúc kháng nguyên: Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài và các typ huyết thanh. Lúc đầu, các Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. typhi và các S. paratyphi A, B, C (typhoid = bệ nh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột (murine =chuột). Về sau, người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 8 khác nhau. Vì những lý do đó, cuối cùng người ta gọi các loài mới phát hiện được theo tên địa phương ở đó nó được phân lập như S. teheran, S. congo, S.london. Đến nay, người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella. Bảng: kiểu kháng nguyên của một số vi khuẩn salmonella. Kháng nguyên H Vi khuẩn Nhóm kháng nguyên Kháng nguyên O Phase 1 Phase 2 S.paratyphy A 1, 2, 12 a (1, 5) S. typhimurium B 1, 4, 12 I 1, 2 S. typhi D 9, 12, (Vi) c 1, 2 S.enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7) S. gallinarum D 1, 9, 12 - - c. Các phương pháp chuẩn đóan salmonella: Salmonella có thể được chuẩn đoán theo các phương pháp sau: • Phương pháp phân lập • Phương pháp miễn dịch • Huyết thanh học • ELISA • Miễn dịch huỳnh quang CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 9 • Phương pháp phân tử • PCR • Realtime PCR • Multiplex PCR Phương pháp kinh điển xác định các Salmonella trong các trường hợp chúng gây bệnh tiêu chảy (đặc biệt trong thương hàn) là cấy máu và/hoặc cấy phân. Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu. Đã có một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuậ t sinh học phân tử như lai DNA, phản ứng khuyếch đại gen - Polymerase Chain Reaction (PCR). - PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm. Trong đó, một đoạn ADN được nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại theo một số chu kỳ được lặp đi lặp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi của đ oạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn oligonucleotid dưới tác động của enzym ADN polymerase. Các oligonucleotid được gọi là "mồi" (primer) này gắn vào hai sợi của đoạn ADN và được định hướng. Do vậy, đoạn ADN mới sẽ được tổng hợp giữa hai mồi này. Trong PCR, ADN đích được tăng lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm của PCR được phát hiện sau khi điện di trên agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọ c dưới ánh sáng đèn cực tím. CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 10 - Tuy nhiên cho tới nay, việc xác định trực tiếp Salmonella từ phân bằng PCR vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. - Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các Salmonella bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. 2. Mục tiêu nghiên cứu : 1. Xác đị nh độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. . PHÂN TỬ 4 KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY I. ĐẶT VẤN ĐỀ - Tiêu chảy là một trong những. TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: