Bài viết tiến hành nghiên cứu ứng dụng và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong phát hiện sán lá gan lớn fasciola gigantica ở ốc lymnaea viridis ở các giai đoạn ấu trùng khác nhau. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA GIGANTICA Ở ỐC LYMNAEA VIRIDIS Ở CÁC GIAI ĐOẠN ẤU TRÙNG KHÁC NHAU Bùi Thị Dung* TÓM TẮT Kỹ thuật PCR đa mồi sử dụng để phát mầm bệnh sán gan lớn (SLGL) Fasciola gigantica ốc Lymaeids vật chủ trung gian Việt Nam Trong nghiên cứu này, gây nhiễm thực nghiệm loài ốc Lymnaea viridis với SLGL F.giantica để sử dụng cho phản ứng PCR đa mồi Nhân lên mồi đặc hiệu Fasciola độ dài 124 bp, đó, mồi ốc nhân lên độ dài khoảng 500 - 600 bp Mẫu đối chứng dương sử dụng ADN sán, mẫu đối chứng âm sử dụng ADN ốc không nhiễm sán gan Kỹ thuật sử dụng để đánh giá xác lan truyền bệnh SLGL vật chủ trung gian ốc Việt Nam * Từ khóa: Fasciola gigantica; Ốc; PCR đa mồi, Lymnaea viridis Apply and develop multiplex PCR to detect Fasciola gigantica infection in Lymnaea viridis at different larval stages SUMMARY Multiplex PCR was used to detect Fasciola gigantica infection in Lymnaea viridis snail as intermediate host In this study, snail Lymnaea viridis was experimentally infected with F.gigantica and used for DNA template Fasciola specific primers was amplified a 124 bp fragment in multiplex PCR when the genomic DNA isolated from F.gigantica infected Lymnaea viridis snails was used as template and amplified a 500 - 600 bp fragment Genomic DNA of the parasite was used as a positive control, which also gave an amplification of the 124 bp fragment DNA isolated from noninfected snails was used as a negative control and no amplification of this sequence was observed The developed diagnostic multiplex PCR will be of use for assessment of transmission of fascioliasis in snail as intermediate host in Vietnam * Key words: Fasciola gigantica; Snail; Multiplex PCR; Lymnaea viridis ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sán gan lớn (Fascioliasis) bệnh ký sinh trùng gây hai loài sán Fasciola hepatica Fasciola gigantica, bệnh phổ biến người gia súc Trong vòng đời phát triển SLGL, ốc nước thuộc họ Lymnaeidae vật chủ trung gian truyền bệnh SLGL [9] Ở Việt Nam, có nhiều cơng trình cơng bố hai lồi ốc Lymnaea viridis Lymnaea swinhoei nhiễm SLGL [2, 3, 4, 6, 7] Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm SLGL ốc tác giả cơng bố hồn tồn trái ngược * Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS TS Lê Bách Quang 118 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Một số tác giả công bố tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán gan tương đối cao ốc, dao động từ 14 - 71% [4, 6, 7]; ngược lại, hầu hết tác giả công bố tỷ lệ nhiễm sán gan ốc thấp, dao động từ 0,06 - 4,75% [2, 3, 5] Các cơng trình cống bố tỷ lệ nhiễm, mà khơng đưa hình ảnh ấu trùng sán gan phát ốc, có Vũ Đức Hạnh (2009) [7] Phạm Ngọc Doanh CS (2012) [5] có đăng hình ảnh ấu trùng sán Tuy nhiên, hai hình ảnh hai tác giả hồn tồn khác thuộc hai giống sán khác Vũ Đức Hạnh (2009) đăng tải ảnh ấu trùng sán Fasciola mà thuộc giống Echinostoma Các tác giả trước sử dụng phương pháp kiểm tra ốc thường quy cách ép ốc hai kính kiểm tra ấu trùng sán kính núp Phương pháp đòi hỏi phải có kinh nghiệm nhận biết ấu trùng sán gan xác đưa kết xác tỷ lệ nhiễm Gần đây, Bùi Thị Dung CS (2011) [1] cơng bố cơng trình so sánh hai phương pháp PCR đa mồi phương pháp ép ốc, thấy: phương pháp PCR đa mồi cho kết xác tỷ lệ nhiễm SLGL ốc Tuy nhiên, tác giả phân tích mẫu ốc thu tự nhiên Nhằm xác định xem có khác biệt hay khơng sử dụng phương pháp PCR đa mồi để dò tìm ấu trùng SLGL ốc giai đoạn phát triển khác nhau, tiến hành nghiên cứu: Ứng dụng phát triển kỹ thuật PCR đa mồi ốc nhân nuôi gây nhiễm thực nghiệm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Ốc Lymnaea viridis ni gây nhiễm Fasciola gigantica phòng thí nghiệm Ốc sau gây nhiễm, kiểm tra giai đoạn khác nhau: sporocyst, redia, cercaria Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN: sử dụng phương pháp tách chiết ADN Chelex® (8) cho mẫu SLGL mẫu ốc sau xét nghiệm ốc theo phương pháp ép thường quy: nghiền nát mẫu ốc que nghiền (TrefLab) Sau đó, thêm 200 µl dung dịch Chelex® 5% (Bio Rad) ủ tiếng nhiệt độ 56°C, 30 phút 95°C máy MJ Research với chương trình Chelex Sau ủ, li tâm mẫu 13.000 vòng/7 phút Phần dịch chứa ADN lấy sang ống lưu trữ -20°C sử dụng * Điện di gel agarose: để kiểm tra độ tinh tách chiết ADN ốc, điện di agarose 2% dung dịch đệm 0.5 X TBE buffer - PCR đa mồi: PCR đa mồi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Fasciola sp có mã hiệu trình tự - Fsh1 (5’-GATCAATTCACCCA TTTCCGTTAGTCCTAC-3’); Fsh2 (5’-AACT GGGCTTAAACGGCGTCCTACGGGCA-3’), nhân đoạn trình tự ADN với cỡ đoạn 124 bp cặp mồi đặc hiệu cho trình tự rADN ITS-2 ốc vật chủ trung gian có mã hiệu trình tự - ITS-2 News2 (5’TGTGTCGATGAAGAACGCAG-3’) ITS2 Rixo (5’-TTCTATGCTTAAATTCAGGGG-3’), nhân đoạn ADN có cỡ đoạn > 500 bp (Bargue CS 2001) PCR đa mồi dùng 0,5 µl mồi đặc hiệu Fasciola sp 0,25 µl mồi đặc hiệu gen ITS-2 ốc µl ADN template hỗn hợp PCR thể tích 10 µl, sử dụng Kit Tap PCR Master Mix (Fermentas) có chứa MgCl2 (3 mM) 400 µM cho dNTP Nhân ADN thực máy PCR MJ Research theo chu trình nhiệt: bước biến tính nhiệt độ 95°C phút, 40 chu kỳ biến tính 95°C phút, ủ 56°C phút, kéo dài 72°C phút chu kỳ cuối 120 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 kéo dài 10 phút ë 72°C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% nhuộm với ethidium bromide KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ứng Multiplex PCR, nhân đoạn gen đặc hiệu SLGL có độ dài kích thước 124 bp với đoạn gen ốc có độ dài kích thước 500 - 600 bp khơng bị tạp nhiễm (hình 3) Sau gây nhiễm, định kỳ kiểm tra ốc kính hiển vi sau 5, 15, 30 42 ngày Kết hình thái cho thấy: SLGL phát triển giai đoạn ấu trùng khác ốc Hình 2: Điện di sản phẩm PCR (2%) kiểm tra độ tinh việc tách chiết AND từ mẫu ốc sử dụng mồi ITS (500 - 600 bp) Hình 1: Các giai đoạn ấu trùng SLGL phát triển vật chủ ốc Lymnaea viridis (a: sporocyst; b: redia; c: redia &cercaria; d: cercaria thải môi trường) Kết phản ứng PCR với mồi ITS2 mẫu ốc (tương ứng với giai đoạn ấu trùng khác nhau) cho thấy: độ tinh ADN tách chiết Cả mẫu cho đoạn ADN có độ dài kích thước khoảng 500 - 600 bp (hình 2) Sử dụng hai cặp mồi (ITS2 New & ITS2 Rixo Fsh1 & Fsh2) cho phản 121 Hình 3: Điện di sản phẩm PCR đa mồi mẫu ốc: mẫu (sporocyst), mẫu (redia), mẫu (cercaria), mẫu (thải cercaria mơi trường) BÀN LUẬN TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi việc phát SLGL ốc cho thấy độ đặc hiệu hiệu cao so với phương pháp ép ốc thường quy [1] Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR đa mồi khác biệt mẫu ốc có nhiễm ấu trùng SLGL giai đoạn khác Như vậy, kỹ thuật PCR đa mồi phát mầm bệnh SLGL ốc giai đoạn nhiễm phát triển thành sporocyst Kiểm tra có mặt ấu trùng SLGL ốc khía cạnh hình thái đòi hỏi phải có kinh nghiệm định cách nhận biết giai đoạn ấu trùng cách xác Điều khơng dễ dàng đạt Tuy nhiên, điều tra dịch tễ học mầm bệnh SLGL ốc, việc sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi đảm bảo độ xác cao, người làm khơng có kinh nghiệm việc nhận dạng hình thái ấu trùng SLGL Vì vậy, ứng dụng phát triển kỹ thuật đại nhằm dò tìm mầm bệnh SLGL ốc vật chủ trung gian cần thiết, nhằm điều tra dịch tễ học tìm biện pháp kiểm sốt lây lan mầm bệnh ngồi mơi trường cho người gia súc TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Thị Dung, Hoàng Văn Hiền Đánh giá, so sánh hiệu ứng dụng số phương pháp kỹ thuật việc phát mầm bệnh SLGL (Fascioliasis) ốc Lymnaea viridis Hội nghị Quốc gia Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 2011, tr.1459-1463 Đỗ Đức Ngái, Phạm Văn Lực, Nguyễn Văn Đức, Phạm Ngọc Doanh, Nguyễn Văn Hà, Nguyễn Thị Minh Tập quán chăn ni tình hình nhiễm bệnh sán gan trâu bò tỉnh Đắc Lắc Khoa học Kỹ thuật thú y 2006, tập XIII, số Hồ Thị Thuận, Nguyễn Ngọc Phương Kết điều tra bệnh sán gan trâu bò biện pháp phòng trừ Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp 1987, 2, tr.85-88 Nguyễn Trọng Kim Tình hình phân bố tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán gan vật chủ trung gian (ốc) vùng núi Bắc Thái Kết nghiên cứu khoa học - Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam Quyển V NXB Nông Nghiệp Hà Nội 1995 Phạm Ngọc Doanh, Hoàng Văn Hiền, Nguyễn Văn Đức, Đặng Thị Cẩm Thạch Dẫn liệu vật chủ trung gian SLGL (Fasciola) Việt Nam Tạp chí Sinh học 2012, 34 (2), tr.139-144 Phan Địch Lân Đặc tính sinh học Fasciola gigantica bệnh sán gan trâu phía Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp 1983, 12, tr.675-678 Vũ Đức Hạnh Tỷ lệ trâu bò tiêu chảy thiếu máu, vai trò sán Fasciola hội chứng tiêu chảy thiếu máu trâu bò huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang, biện pháp phòng trị Đại học Nơng Lâm, Thái Ngun Luận văn Thạc sỹ 2009 Caron Y, Righi S, Lempereur L, Saegerman C, Losson B An optimized DNA extraction and multiplex PCR for the detection of Fasciola sp In lymaeid snails Veterinary Parasitology 2011, 178 (1-2), pp.93-99 Dalton J.P Fasioliasis CABI Publishing 1998, pp.561 122 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 10/11/2012 Ngày giao thảo in: 6/12/2012 123 ... nghiên cứu: Ứng dụng phát triển kỹ thuật PCR đa mồi ốc nhân nuôi gây nhiễm thực nghiệm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Ốc Lymnaea viridis ni gây nhiễm Fasciola gigantica. .. SLGL ốc Tuy nhiên, tác giả phân tích mẫu ốc thu ngồi tự nhiên Nhằm xác định xem có khác biệt hay khơng sử dụng phương pháp PCR đa mồi để dò tìm ấu trùng SLGL ốc giai đoạn phát triển khác nhau, ... vậy, kỹ thuật PCR đa mồi phát mầm bệnh SLGL ốc giai đoạn nhiễm phát triển thành sporocyst Kiểm tra có mặt ấu trùng SLGL ốc khía cạnh hình thái đòi hỏi phải có kinh nghiệm định cách nhận biết giai