NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu øng dơng kü tht Realtime PCR ®a måi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trỴ em Chun ngành: Vi sinh Mã số : 60720115 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy hướng dẫn tận tình, giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình học tập nghiên cứu để thực đề tài Sự hướng dẫn tận tình kiến thức quý báu thầy đóng vai trò vơ quan trọng trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cám ơn đến tất thầy cô hội đồng thông qua đề cương hội đồng chấm khóa luận dành thời gian đọc đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn chỉnh luận văn Em xin cám ơn toàn thể anh chị nhân viên, kỹ thuật viên khoa nghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện mặt q trình thu thập, xử lí bệnh phẩm, cho em lời khuyên bổ ích trình thực luận văn Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, chị kỹ thuật viên, bác sỹ nội trú vi sinh khóa 39, 40, 41 giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên em q trình học tập hồn thiện luận văn Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, phòng ban chức Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than gia đình bạn bè ln ủng hộ em suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo LỜI CAM ĐOAN Tôi Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin cam đoan điều trình bày hồn tồn trung thực xác Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome BPS Phosphate-buffered saline Ct Chu kì ngưỡng phát dsRNA Double-stranded Ribonucleic acid (+) ssRNA Positive-sense single-stranded Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction TCC Tiêu chảy cấp VP NSP Viral protein (protein cấu trúc) Non-Structure protein (protein phi cấu trúc) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus 1.1.1 Tình hình giới .3 1.1.2 Tình hình Việt Nam 1.2 Đặc điểm tính chất hệ gen Rotavirus, Norovirus 1.2.1 Đặc điểm Rotavirus 1.2.2 Đặc điểm Norovirus 1.3 Các kỹ thuật phát Rotavirus, Norovirus .10 1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy 10 1.3.2 Kỹ thuật phát kính hiển vi điện tử 11 1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch 13 1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử 16 1.3.4.3 Kỹ thuật Realtime PCR đa mồi .20 1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Thời gian nghiên cứu 22 2.3 Đối tượng nghiên cứu 22 2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 23 2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị .23 2.4.2 Hóa chất 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: 26 2.5.2 Phương pháp Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus 27 2.5.3 Phản ứng Realtime PCR xác định Norovirus Rotavirus 29 2.5.4 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng Realtime PCR đa mồi với kit thương mại có chứng IVD 31 2.6 Xử lý số liệu .31 2.7 Đạo đức nghiên cứu 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 32 3.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 32 3.1.2 Kết phản ứng Realtime PCR 33 3.1.3 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 36 3.2 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 38 3.2.1 Tỉ lệ phát TCC Rotavirus, Norovirus 38 3.2.2 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo giới tính 39 3.2.3 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi 40 3.2.4 Một số số xét nghiệm máu, phân .43 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 46 4.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 46 4.1.2 Phản ứng Realtime PCR đa mồi .48 4.2 Một số đặc điểm dịch tễ Rotavirus, Norovirus 51 4.2.1 Tỉ lệ phát tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus .51 4.2.2 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo giới tính 53 4.2.3 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo tuổi .54 4.2.4 Một số số xét nghiệm máu, phân 56 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các đoạn gen Rotavirus Bảng 1.2 Cấu trúc protein Rotavirus .8 Bảng 2.1 Trình tự Primer, Probe gen GAPDH, Rotavirus, Norovirus .25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng gen GAPDH 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng 30 Bảng 3.1 Nồng độ RNA sau tiền xử lý mẫu tách chiết nucleic acid 32 Bảng 3.2 Phân bố giá trị Ct kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 33 Bảng 3.3 Kết phát Rotavirus kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 34 Bảng 3.4 Kết phát Norovirus kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 35 Bảng 3.5 Kết giá trị Ct so sánh kỹ thuật Realtime PCR đa mồi kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 36 Bảng 3.6 Kết phát Rotavirus kỹ thuật Realtime PCR đa mồi kit thương mại FTD .37 Bảng 3.7 Kết phát Norovirus kỹ thuật Realtime PCR đa mồi kit thương mại FTD .37 Bảng 3.8 Bảng phân bố nguyên Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 38 Bảng 3.9 Đặc điểm giới bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus .39 Bảng 3.10 Phân bố tuổi bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus .40 Bảng 3.11 Kết soi phân bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỉ lệ tử vong bệnh nhân tiêu chảy cấp Rotavirus Hình 1.2 Hình ảnh minh họa cấu trúc Rotavirus Hình 1.3 Hình ảnh minh họa cấu trúc Norovirus Hình 1.4 Hình ảnh Rotavirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Hình ảnh Norovirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.6 Ngun lí phương pháp ELISA 14 Hình 1.7 Ngun lí kỹ thuật sắc kí miễn dịch 15 Hình 1.8 Biểu đồ quan hệ chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phản ứng Realtime PCR 18 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động TaqMan Probe Realtime PCR 19 Hình 2.1 Ngun lí hoạt động hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0 28 57 nghiên cứu Rytlewska, Đỗ Phương Thảo cho thấy kali máu phần lớn nằm giới hạn bình thường Tỉ lệ hạ kali máu cuả tương đồng với kết nghiên cứu Đỗ Phương Thảo ; cao kết nghiên cứu Rytlewska Ở nhóm Norovirus chưa ghi nhận trường hợp có rối loạn điện giải Như TCC Norovirus gây biến đổi điện giải đồ so với TCC Rotavirus 4.2.4.2 Kết soi phân Theo nghiên cứu Đỗ Phương Thảo (năm 2016), tỉ lệ có hồng cầu phân bệnh nhân tiêu chảy cấp Rotavirus dao động từ 0%-8,3%, tỉ lệ bạch cầu phân dao động từ 15,8%-20,8% Nghiên cứu đưa tỉ lệ xuất hồng cầu phân nhóm TCC Rotavirus, nhóm TCC Norovirus 0%; 10,5% Tỉ lệ xuất bạch cầu phân nhóm TCC Rotavirus, nhóm TCC Norovirus 8,6%; 26,3%.Theo nghiên cứu chúng tôi, tỉ lệ hồng cầu bạch cầu phân nhóm TCC Rotavirus thấp so với kết nghiên cứu Đỗ Phương Thảo Sự khác biệt hạn chế cỡ mẫu nghiên cứu Chúng cho tỉ lệ phát hồng cầu, bạch cầu phân bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus thấp xuất phát từ chế bệnh sinh tiêu chảy virus khác với chế tiêu chảy tác nhân vi khuẩn E coli, Shigella, Cơ chế chủ yếu TCC Rotavirus, Norovirus tổn thương vi nhung mao niêm mạc ruột non, rối loạn vận động dày ruột, giảm tiết enzyme tiêu hóa từ gây rối loạn hấp thu chất dinh dưỡng, điện giải, nước KẾT LUẬN 58 Hoàn thiện kỹ thuật RealTime PCR đa mồi phát Rotavirus, Norovirus - Cải tiến bước tiền xử lí mẫu ủ mẫu bệnh phẩm nhiệt độ 56°C 15 phút góp phần làm tăng nồng độ độ tinh acid nucleic - Với giá trị phát tác nhân định tính kỹ thuật Realtime PCR đa mồi có giá trị phát tương đương kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi - Với giá trị phát tác nhân định tính kỹ thuật Realtime PCR đa mồi có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại FTD viral gastroenteritis Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em - TCC Rotavirus chiếm tỉ lệ 29,4%, độ tuổi từ đến 24 tháng chiếm cao (24/35 trường hợp) số TCC dương tính với Rotavirus Tỉ lệ nam/ nữ 2,2:1 Tỉ lệ mắc bệnh TCC Rotavirus cao nhóm tuổi từ 13 đến 24 tháng (44,8 %) - TCC Norovirus chiếm tỉ lệ 16%, độ tuổi từ đến 12 tháng chiếm lớn (12/19 trường hợp) số TCC dương tính với Norovirus Tỉ lệ nam/ nữ xấp xỉ 2,2/1 Tỉ lệ TCC Norovirus cao nhóm tuổi từ đến12 tháng tháng (26,1%) - Tỉ lệ đồng nhiễm Rotavirus Norovirus chiếm 2,5% - Nhóm TCC Rotavirus có giá trị Natri máu, Kali máu phần lớn nằm giới hạn bình thường với tỉ lệ 94,3%, 80% - Nhóm TCC Norovirus có giá trị Natri máu, Kali máu nằm giới hạn bình thường 59 - Nhóm TCC Rotavirus khơng phát thấy hồng cầu phân, phần lớn khơng có bạch cầu phân (91,4%) - Nhóm TCC Norovirus phần lớn không phát thấy hồng cầu, bạch cầu phân với tỉ lệ 89,5%, 73,7% 60 KIẾN NGHỊ Với giá trị kết định tính, chúng tơi kiến nghị sử dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi thay cho kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi phát tác nhân Rotavirus, Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC I MẪU THU THẬP THÔNG TIN Họ tên bệnh nhân: Ngày sinh: Mã BN: Tuổi: Mã bệnh phẩm: Giới: Địa chỉ: Ngày vào viện: Điện thoại liên lạc: Chiều cao: Cân nặng tại: Kg Xét nghiệm máu: CRP: Hb: Hct: Bạch cầu: Bạch cầu trung tính: Bạch cầu lympho: Tiểu cầu: Na+ : K+ : Cl- : Xét nghiệm soi phân: Hồng cầu phân: Bạch cầu phân: PHỤ LỤC II Quy trình tách chiết acid nucleic máy tách chiết tự động MagNa Pure LC 2.0 - Chuẩn bị hóa chất: Protein K theo hướng dẫn, pha 6,4 ml dung dịch Protein K buffer vào lọ Protein K, lắc tan Lưu trữ 2-8°C vòng tháng, -15°C đến -20°C vòng năm Dung dịch bi từ lưu trữ nhiệt độ phòng, cần lắc trước sử dụng - Sử dụng máy tách chiết MagNa Pure LC 2.0: - Thực theo hướng dẫn vận hành máy MagNA Pure LC 2.0 - Vệ sinh máy: dùng giấy thấm cồn 70% lau khu vực bên máy - Mở nguồn máy, đăng nhập vào phần mềm - Thực việc bảo trì: bơi trơn đầu pippet - Mở hình Overview chọn Ordering, nhập thông tin mẫu chạy máy - Vào mục Purification protocol, chọn Protocol nhập thông tin Sample volume Elution volume, chọn next - Dựa hình Workplace stage Setup, lắp đặt vật dụng tiêu hao cần thiết cho máy - Đặt khay chứa mẫu bệnh phẩm vào ấn Start - Sau máy tách chiết xong, hút mẫu tách chiết sang ống 0,5 ml có ghi rõ mã nghiên cứu nắp thân ống - Vệ sinh máy chiếu đèn UV PHỤ LỤC III Quy trình đo độ quang phổ máy Nano Drop 1000 Bước 1: Khởi động máy tính, mở phần mềm Nano Drop 1000 máy tính Bước 2: Ấn chọn mục acid nucleic Bước 3: Mở cánh tay nhận mẫu, nhỏ µl dung dịch Elution buffer dùng Kit tách chiết MagNA Pure LC Total Nucleic acid Isolation Kit vào vị trí nhận mẫu – High Performance, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Blank Bước 4: Mở cánh tay nhận mẫu lau dung dịch vừa nhỏ bước Bước 5: Ấn chọn RNA mục type Bước 6: Nhỏ µl mẫu tách chiết RNA vào vị trí nhận mẫu, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Measure Sau việc đo quang phổ hoàn thành, phần mềm tự động tính tốn đưa giá trị nồng độ RNA, độ tinh acid nucleic Bước 7: Vệ sinh máy đóng cánh tay nhận mẫu PHỤ LỤC IV Quy trình chạy Realtime PCR đa mồi kit thương mại viral gastroenteritis FTD Thành phần hỗn hợp phản ứng: Kí hiệu Noro PP ARA PP GASTRO PC NC IC Enzyme Buffer Thành phần Hỗn hợp mồi/probe phát Noroviruses (NoroG1 NoroG2) IC Hỗn hợp mồi/probe phát Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Chứa chứng dương plasmid phát Noro G1/G2, Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Negative control Internal control 25x RT-PCR Enzyme mix (Fast-track mastermix) 2x RT-PCR buffer (Fast-track mastermix) CÁC BƯỚC THỰC HIỆN Tách chiết ADN/ARN tổng số: Tách theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Hút 2µl IC (lấy từ kit FTD viral gastroenteritis) vào khay mẫu - Tiếp tục hút 200µL mẫu chứng âm vào khay mẫu - Tiến hành tách chiết theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Thể tích Elution 100 µl Thực phản ứng Realtime PCR đa mồi FTD viral gastroenteritis a Trộn hỗn hợp hóa chất Có 02 cặp hỗn hợp mồi probe (PP) sử dụng là: Noro PP, ARA PP Chuẩn bị 02 ống ly tâm vô trùng 1,5ml để trộn riêng rẽ hỗn hợp hóa chất chứa cặp mồi probe Sau hút vào ống hóa chất theo cơng thức sau: Tên hóa chất PP Mix Thể tích cho 01 phản ứng 12.5 μl - Buffer 1.5 μl Enzyme μl Tổng số 15 μl b Chia hóa chất vào plate Realtime PCR 96 giếng Thiết kế sơ đồ chạy phản ứng Realtime PCR Chọn plate Realtime PCR tương thích với hệ thống máy Realtime PCR ( ABI 7500 ABI 7500 Fast) Hút 15 µl hỗn hợp phản ứng Noro PP vào giếng theo sơ đồ Hút 15 µl hỗn hợp phản ứng ARA PP vào giếng theo sơ đồ c Nhỏ mẫu chứng Chuyển plate Realtime PCR khu vực nhỏ mẫu Hút 10 µl mẫu, chứng âm, chứng dương vào plate theo sơ đồ Phủ phim lên plate, ly tâm nhanh Đặt plate vào máy Realtime PCR d Chọn chương trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR Cài đặt vị trí mẫu máy dye huỳnh quang sau: Hỗn hợp PP Tác nhân phát Dye Bước sóng phát (nm) Noro Norovirus G2 Xanh 520 ARA - - BMV (IC) Norovirus G1 Astrovirus Rotavirus Adenovirus Vàng Đỏ Xanh Vàng Đỏ 550 670 520 550 670 Chương trình nhiệt phản ứng Realtime PCR sau: 42°C 15 phút 94°C phút 40 chu kỳ của: 94°C giây, 60°C 34 giây (đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) e Điều kiện chấp nhận kết Tất chứng âm nằm chu kỳ ngưỡng Tất chứng dương có giá trị Ct < 33 Tất IC phải dương, giá trị Ct < 33 f Đọc hiểu kết +Kết quả: Dương tính tín hiệu phát sinh Ct < 38 +Kết quả: Âm tính tín hiệu phát sinh Ct ≥ 38 BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 HO TEN BENH NHAN Le Ngoc D Nguyen Thi Phuong L Nguyen Duc T Lu Anh T Nguyen Hong P Hoang Minh T Do Nhat Quang A Tran Huu Thai A Nguyen Ngoc L Nguyen Huu Tung L Hoang Huyen M Dao Hoang P Nguyen Phuong M Tran Xuan Viet B Chu Ngoc A Duong Gia B Le Khanh L Nguyen Bao T Do Ngoc Huyen M Nguyen Thu N Tran Mai C Tran Trung H Vu Tung L Tran Duc S Dang Quang H Dang Bao K Nguyen Thi Thuy H Nguyen Le To U Do The V Nguyen Tien D Nguyen Nam D Tong Thi Huong T Pham Ha A Pham Gia H TUOI (THANG) GIOI 12 16 14 13 14 10 36 13 24 20 5 44 16 16 48 10 14 36 nu nu nam nu nam nam nam nam nam nam nu nam nu nam nu nam nu nu nu nu nam nam nam nam nam nu nu nu nam nam nam nu nu nam MA SO BENH NHAN 160463529 166044909 170021116 170019874 170083496 160494769 170086725 160529464 160291038 170061299 160502151 170058504 160291111 165323435 160420989 170048186 170144123 160398443 160226288 160520223 170050640 170125389 14028497 160315140 174004355 170043556 130207938 170174943 160405939 170071656 170071604 160266073 170514318 160517043 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Nguyen Duc Q Nguyen Bao A Nguyen Tien D Nguyen Dao Khanh H Tran Anh D Tong Ba T Nguyen Bao H Nguyen Gia H Hua Dinh P Ngo Bao N Nguyen Bao A Nguyen Ha An N Dang Kieu Khanh M Nguyen Thi Bao A Pham Nguyen Gia L Nguyen Hieu H Do Nguyen K Hoang Dang P Vu Quang M Tran Nhu Bao N Nguyen Thao M Nguyen Huu Gia B Nguyen Khac Minh D Kim Sung M Ngo Nhat A Nguyen Gia H Chu Quang H Nguyen Quang M Vu Duy K Pham Gia M Vu Nam P Doan Nhat N Nguyen Dinh Gia B Nguyen Tu A Pham H Vu Thanh P Le Vuong Gia H Pham Hoang P Nguyen Trung Bac L 14 27 36 11 22 25 13 15 22 22 11 11 22 22 36 8 12 48 12 10 24 11 12 18 10 nam nu nam nu nam nam nu nam nam nu nu nu nu nu nam nu nam nam nam nu nu nam nam nam nam nam nam nam nu nu nam nam nam nu nam nam nam nam nam 160102911 170448024 170151465 160555753 160146792 170046477 160503173 170102223 160376570 170147246 160422302 170353746 170343146 160243706 160291089 160438450 170257455 170070661 170049120 160212658 160305394 170281345 160107144 160450974 160337564 140048974 170275906 170217089 170018801 150054415 170333821 170236989 170226462 170253255 169252636 170337986 170370449 170472360 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 Ta Khanh H Bui Huy K Nguyen Bao N Tang Huy H Luong Tat T Phan Khanh D Nguyen Tuan D Vu Thuy Tuong V Nguyen Thi Bao N Nguyen Ngoc Thien A Le Trung H Bui Dan L Hoang Thanh L Nguyen Viet C Vu Linh C Doan Cong D Ngo Quoc L Do Tuan H Doan Tuan H Nguyen Cong Gia H Mai Bao M Duong Kieu A Truong Gia B Duong Ngoc L Cao Phan Han N Nguyen Bao H Tran Ngoc L Le Nhu Y Le Ngoc D Hoang Phuc L Bach Truong G Hoang Nam P Nguyen Thanh D Nguyen Gia H Ngo Duc A Tran Khoa N Kieu Ngoc Bao V Vu Nguyen Bao N Do Quoc H 11 10 15 36 7 12 24 4 11 24 26 27 15 13 12 22 41 12 37 17 nu nam nu nam nam nam nam nu nu nu nam nam nam nam nu nam nam nam nam nam nam nu nam nu nu nu nam nu nu nam nam nam nam nu nam nam nu nam nam 170444312 170133336 170511241 176625635 170451584 170457934 170503362 170315109 170544443 170491578 170555994 179069980 170069847 160298154 170179372 170401668 170447063 170529494 170519992 170481395 170529571 170502322 170519384 170486047 170169337 170500815 170516488 170549787 170500721 170543529 150151841 470498217 170298533 170522057 170548771 150486394 170525222 170520506 170518087 113 114 115 116 117 118 119 Pham Dinh T Chu Minh T Vu Duc D Le Trung K Pham Tung A Vu Nguyen Viet K Vu Hai D 27 15 47 13 nam nam nam nam nam nu nam 170031262 170500386 170500516 160462009 170451589 160469305 160532490 ... mục tiêu: Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ. .. trị Ct kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 33 Bảng 3.3 Kết phát Rotavirus kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 34 Bảng 3.4 Kết phát Norovirus. .. lâm sàng phát sớm nguyên gây bệnh Vì vậy, để ứng dụng sớm sàng lọc bệnh viện, thực đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em với