NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu øng dơng kü tht Realtime PCR ®a måi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trỴ em Chun ngành: Vi sinh Mã số : 60720115 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy HÀ NỘI - 2018 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome BPS Phosphate-buffered saline Ct Chu kì ngưỡng phát dsRNA Double-stranded Ribonucleic acid (+) ssRNA Positive-sense single-stranded Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction TCC Tiêu chảy cấp VP NSP Viral protein (protein cấu trúc) Non-Structure protein (protein phi cấu trúc) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tình hình tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus 1.1.1 Tình hình giới 1.1.2 Tình hình Việt Nam .5 1.2 Đặc điểm tính chất hệ gen Rotavirus, Norovirus 1.2.1 Đặc điểm Rotavirus 1.2.2 Đặc điểm Norovirus 1.3 Các kỹ thuật phát Rotavirus, Norovirus .10 1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy 10 1.3.2 Phát Rotavirus, Norovirus kính hiển vi điện tử 11 1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch dùng để phát Rotavirus, Norovirus .13 1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử .16 1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Thời gian nghiên cứu 22 2.3 Đối tượng nghiên cứu 22 2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 23 2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị 23 2.4.2 Hóa chất 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: .26 2.5.2 Phương pháp realtime PCR đa mồi phát Norovirus Rotavirus.27 2.5.3 Phản ứng Realtime RT- PCR xác định Norovirus Rotavirus 29 2.5.4 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng Realtime PCR đa mồi với kit thương mại có chứng IVD 31 2.6 Xử lý số liệu .31 2.7 Đạo đức nghiên cứu 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 32 3.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 32 3.1.2 Kết phản ứng Realtime PCR .33 3.1.3 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 36 3.2 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 38 3.2.1 Tỉ lệ phát TCC Rotavirus, Norovirus 38 3.2.2 Phân bố tỉ lệ TCC Rotavirus, Norovirus theo giới 39 3.2.3 Phân bố tỉ lệ phát TCC Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi 40 3.2.4 So sánh số xét nghiệm máu, phân .43 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 46 4.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 46 4.1.2 Phản ứng RealTime PCR đa mồi .48 4.2 Một số đặc điểm dịch tễ Rotavirus, Norovirus 51 4.2.1 Tỉ lệ mắc tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus .51 4.2.2 Yếu tố giới bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus 53 4.2.3 Yếu tố tuổi bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus 54 4.2.4 Biến đổi xét nghiệm 56 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỉ lệ tử vong tiêu chảy cấp Rotavirus .4 Hình 1.2 Hình ảnh minh họa cấu trúc Rotavirus Hình 1.3 Hình ảnh minh họa cấu trúc Norovirus Hình 1.4 Hình ảnh Rotavirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Hình ảnh Norovirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.6 Nguyên lí phương pháp ELISA 14 Hình 1.7 Ngun lí kĩ thuật sắc kí miễn dịch 15 Hình 1.8 Biểu đồ quan hệ chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phản ứng realtime PCR .18 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động Taq Man Probe Realtime PCR 19 Hình 2.1 Nguyên lí hoạt động hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0 .28 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các đoạn gen Rotavirus Bảng 1.2 Cấu trúc protein Rotavirus Bảng 2.1 Trình tự Primer, Probe gen Rotavirus, Norovirus 25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng 30 Bảng 3.1 Nồng độ RNA sau tiền xử lý mẫu tách chiết nucleic acid 32 Bảng 3.2 Phân bố giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) kỹ thuật realtime PCR đơn mồi kỹ thuật cải tiến phát Norovirus Rotavirus .33 Bảng 3.3 Kêt giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) so sánh kỹ thuật realtime RT-PCR đa mồi kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 36 Bảng 3.4 Bảng phân bố nguyên Norovirus Rotavirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 38 Bảng 3.5 Bảng phân bố tỉ lệ giới nhóm TCC Rotavirus, TCC Norovirus, nhóm đồng nhiễm nhóm âm tính 39 Bảng 3.6 Tỉ lệ nhóm tuổi nhóm bệnh nhân TCC Rotavirus, TCC Norovirus, đồng nhiễm âm tính 40 Bảng 3.7 So sánh số xét nghiệm máu nhóm TCC Rotavirus nhóm âm tính .Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 So sánh số xét nghiệm nhóm TCC Norovirus nhóm âm tính .Error! Bookmark not defined Bảng 3.9 Kết soi phân nhóm TCC Rotavirus, nhóm TCC Norovirus nhóm âm tính 45 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ nguyên Rotavirus, Norovirus gây TCC trẻ em 39 Biểu đồ3.2 Tỉ lệ bệnh nhân mắc TCC Rotavirus theo giới tính Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.3 Phân bố tỉ lệ bệnh nhân TCC Norovirus theo giới tínhError! Bookmark not defined Biểu đồ 3.4 Phân bố tỉ lệ TCC Rotavirus theo nhóm tuổi .41 Biều đồ 3.5 Phân bố tỉ lệ tiêu chảy cấp Norovirus theo nhóm tuổi .42 Biểu đồ 3.6.So sánh thay đổi nồng độ Natri máu nhómTCC Rotavirus, nhóm TCC Norovirus nhóm âm tính 43 Biểu đồ 3.7 So sánh thay đổi nồng độ Kali máu nhóm TCC Rotavirus, nhóm TCC Norovirus nhóm âm tính .44 LỜI CẢM ƠN Với lòng người học trò, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy hướng dẫn tận tình, giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình học tập nghiên cứu để thực đề tài Sự hướng dẫn tận tình kiến thức quý báu thầy đóng vai trị vơ quan trọng trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cám ơn đến tất thầy cô hội đồng thông qua đề cương hội đồng chấm khóa luận dành thời gian đọc đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn chỉnh luận văn Em xin cám ơn toàn thể anh chị nhân viên, kỹ thuật viên khoa nghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện mặt q trình thu thập, xử lí bệnh phẩm, cho em lời khuyên bổ ích trình thực luận văn Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, chị kỹ thuật viên, bác sỹ nội trú vi sinh khóa 39, 40, 41 giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên em q trình học tập hồn thiện luận văn Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, phòng ban chức Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than gia đình bạn bè ln ủng hộ em suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo LỜI CAM ĐOAN Tôi Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin cam đoan điều trình bày hồn tồn trung thực xác Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo 58 KẾT LUẬN Hoàn thiện kỹ thuật RealTime PCR đa mồi phát Rotavirus, Norovirus - Cải tiến bước tiền xử lí mẫu ủ mẫu bệnh phẩm nhiệt độ 56°C 15 phút góp phần làm tăng nồng độ độ tinh acid nucleic - Với giá trị phát tác nhân định tính kỹ thuật Realtime PCR đa mồi có giá trị phát tương đương kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi - Với giá trị phát tác nhân định tính kỹ thuật Realtime PCR đa mồi có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại FTD viral gastroenteritis Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em - TCC Rotavirus chiếm tỉ lệ 29,4%, độ tuổi từ đến 24 tháng chiếm cao (24/35 trường hợp) số TCC dương tính với Rotavirus Tỉ lệ nam/ nữ 2,2:1 Tỉ lệ mắc bệnh TCC Rotavirus cao nhóm tuổi từ 13 đến 24 tháng (44,8 %) - TCC Norovirus chiếm tỉ lệ 16%, độ tuổi từ đến 12 tháng chiếm lớn (12/19 trường hợp) số TCC dương tính với Norovirus Tỉ lệ nam/ nữ xấp xỉ 2,2/1 Tỉ lệ TCC Norovirus cao nhóm tuổi từ đến12 tháng tháng (26,1%) - Tỉ lệ đồng nhiễm Rotavirus Norovirus chiếm 2,5% - Nhóm TCC Rotavirus có giá trị Natri máu, Kali máu phần lớn nằm giới hạn bình thường với tỉ lệ 94,3%, 80% 59 - Nhóm TCC Norovirus có giá trị Natri máu, Kali máu nằm giới hạn bình thường - Nhóm TCC Rotavirus khơng phát thấy hồng cầu phân, phần lớn bạch cầu phân (91,4%) - Nhóm TCC Norovirus phần lớn không phát thấy hồng cầu, bạch cầu phân với tỉ lệ 89,5%, 73,7% 60 KIẾN NGHỊ Với giá trị kết định tính, chúng tơi kiến nghị sử dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi thay cho kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi phát tác nhân Rotavirus, Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC I MẪU THU THẬP THÔNG TIN Họ tên bệnh nhân: Ngày sinh: Mã BN: Tuổi: Mã bệnh phẩm: Giới: Địa chỉ: Ngày vào viện: Điện thoại liên lạc: Chiều cao: Cân nặng tại: Kg Xét nghiệm máu: CRP: Hb: Hct: Bạch cầu: Bạch cầu trung tính: Bạch cầu lympho: Tiểu cầu: Na+ : K+ : Cl- : Xét nghiệm soi phân: Hồng cầu phân: Bạch cầu phân: PHỤ LỤC II Quy trình tách chiết acid nucleic máy tách chiết tự động MagNa Pure LC 2.0 - Chuẩn bị hóa chất: Protein K theo hướng dẫn, pha 6,4 ml dung dịch Protein K buffer vào lọ Protein K, lắc tan Lưu trữ 2-8°C vòng tháng, -15°C đến -20°C vòng năm Dung dịch bi từ lưu trữ nhiệt độ phòng, cần lắc trước sử dụng - Sử dụng máy tách chiết MagNa Pure LC 2.0: - Thực theo hướng dẫn vận hành máy MagNA Pure LC 2.0 - Vệ sinh máy: dùng giấy thấm cồn 70% lau khu vực bên máy - Mở nguồn máy, đăng nhập vào phần mềm - Thực việc bảo trì: bơi trơn đầu pippet - Mở hình Overview chọn Ordering, nhập thông tin mẫu chạy máy - Vào mục Purification protocol, chọn Protocol nhập thông tin Sample volume Elution volume, chọn next - Dựa hình Workplace stage Setup, lắp đặt vật dụng tiêu hao cần thiết cho máy - Đặt khay chứa mẫu bệnh phẩm vào ấn Start - Sau máy tách chiết xong, hút mẫu tách chiết sang ống 0,5 ml có ghi rõ mã nghiên cứu nắp thân ống - Vệ sinh máy chiếu đèn UV PHỤ LỤC III Quy trình đo độ quang phổ máy Nano Drop 1000 Bước 1: Khởi động máy tính, mở phần mềm Nano Drop 1000 máy tính Bước 2: Ấn chọn mục acid nucleic Bước 3: Mở cánh tay nhận mẫu, nhỏ µl dung dịch Elution buffer dùng Kit tách chiết MagNA Pure LC Total Nucleic acid Isolation Kit vào vị trí nhận mẫu – High Performance, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Blank Bước 4: Mở cánh tay nhận mẫu lau dung dịch vừa nhỏ bước Bước 5: Ấn chọn RNA mục type Bước 6: Nhỏ µl mẫu tách chiết RNA vào vị trí nhận mẫu, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Measure Sau việc đo quang phổ hoàn thành, phần mềm tự động tính tốn đưa giá trị nồng độ RNA, độ tinh acid nucleic Bước 7: Vệ sinh máy đóng cánh tay nhận mẫu PHỤ LỤC IV Quy trình chạy Realtime PCR đa mồi kit thương mại viral gastroenteritis FTD Thành phần hỗn hợp phản ứng: Kí hiệu Noro PP ARA PP GASTRO PC NC IC Enzyme Buffer Thành phần Hỗn hợp mồi/probe phát Noroviruses (NoroG1 NoroG2) IC Hỗn hợp mồi/probe phát Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Chứa chứng dương plasmid phát Noro G1/G2, Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Negative control Internal control 25x RT-PCR Enzyme mix (Fast-track mastermix) 2x RT-PCR buffer (Fast-track mastermix) CÁC BƯỚC THỰC HIỆN Tách chiết ADN/ARN tổng số: Tách theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Hút 2µL IC (lấy từ kit FTD viral gastroenteritis) vào khay mẫu - Tiếp tục hút 200µL mẫu chứng âm vào khay mẫu - Tiến hành tách chiết theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Thể tích Elution 100 µL Thực phản ứng Realtime PCR đa mồi FTD viral gastroenteritis a Trộn hỗn hợp hóa chất Có 02 cặp hỗn hợp mồi probe (PP) sử dụng là: Noro PP, ARA PP Chuẩn bị 02 ống ly tâm vô trùng 1,5ml để trộn riêng rẽ hỗn hợp hóa chất chứa cặp mồi probe Sau hút vào ống hóa chất theo cơng thức sau: Tên hóa chất PP Mix Thể tích cho 01 phản ứng 12.5 μL - Buffer 1.5 μL Enzyme μL Tổng số 15 μL b Chia hóa chất vào plate Realtime PCR 96 giếng Thiết kế sơ đồ chạy phản ứng Realtime PCR Chọn plate Realtime PCR tương thích với hệ thống máy Realtime PCR ( ABI 7500 ABI 7500 Fast) Hút 15 µL hỗn hợp phản ứng Noro PP vào giếng theo sơ đồ Hút 15 µL hỗn hợp phản ứng ARA PP vào giếng theo sơ đồ c Nhỏ mẫu chứng Chuyển plate Realtime PCR khu vực nhỏ mẫu Hút 10 µL mẫu, chứng âm, chứng dương vào plate theo sơ đồ Phủ phim lên plate, ly tâm nhanh Đặt plate vào máy Realtime PCR d Chọn chương trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR Cài đặt vị trí mẫu máy dye huỳnh quang sau: Hỗn hợp PP Tác nhân phát Dye Bước sóng phát (nm) Noro Norovirus G2 Xanh 520 ARA - - BMV (IC) Norovirus G1 Astrovirus Rotavirus Adenovirus Vàng Đỏ Xanh Vàng Đỏ 550 670 520 550 670 Chương trình nhiệt phản ứng Realtime PCR sau: 42°C 15 phút 94°C phút 40 chu kỳ của: 94°C giây, 60°C 34 giây(đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) e Điều kiện chấp nhận kết Tất chứng âm nằm chu kỳ ngưỡng Tất chứng dương có giá trị Ct