Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa)

Phương pháp này thực hiện phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy và kiểm tra sản phẩm thu được gặp khó khăn và có khả năng nhầm lẫn các loại vi sinh vật với nhau.. Xuất phát từ tình hình

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành/ngành: Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH & CNTP

Khóa học : 2012-2016

Thái Nguyên - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

NGUYỄN KHẮC KHÁNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN

NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus

VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành/Ngành: Công nghệ Sinh học

Lớp : K44-CNSH

Khoa : CNSH & CNTP

Khóa học : 2012-2016

Giảng viên hướng dẫn: BS NGUYỄN THỊ HUYỀN

TS NGUYỄN VĂN DUY

Thái Nguyên, năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS Nguyễn Thị Huyền, Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên, KTV Nguyễn Thị Thủy, CN Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện

Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ,giúp đỡ tôi và đã cung cấp các chủng sinh vật để thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm thuộc khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Khắc Khánh

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 24 Bảng 4.1 Kết quả thử nghiệm phản ứng multilplex PCR trên các mẫu thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus 5 Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa 9 Hình 4.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số của các chủng S aureus (A) và các chủng P aeruginosa (B) 29 Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 31 Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện phản ứng khác nhau 33 Hình 4.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử dụng khuôn của chủng S aureus và P aeruginosa 35 Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR ở các nồng độ DNA pha loãng khác nhau 37 Hình 4.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khi sử dụng cáckhuôn khác nhau 38

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài: 2

1.3 Ý nghĩa đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1.Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa4 2.1.1 Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus 4

2.1.2 Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa 9

2.2 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa trong nước và trên thế giới 12

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus 12

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa 14

2.3 Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa 17

2.3.1 Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus 17

2.3.1.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 18

2.3.2 Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa 19

2.4.Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR 20

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22

3.2.1.Địa điểm nghiên cứu 22

3.2.2.Thời gian nghiên cứu 22

3.3 Vật liệu nghiên cứu 22

3.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 22

3.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài 23

3.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng trong qua trình thực hiện đề tài 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 24

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 25

3.5.2 Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa 26

3.5.3 Phương pháp xác định nồng độ tế bào 27

3.5.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR 27

3.5.4 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR 28

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 29

4.2 Kết quả xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời S aureus và P aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex PCR 30

4.2.1 Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 30

4.2.2 Kết quả xác định điều kiện chung của phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi riêng rẽ 32

4.2.3 Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại của phản ứng multiplex PCR

35

4.2.4 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR 36

4.2.5 Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR 38

4.3 Kết quả thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời S aureus và P aeruginosa từ mẫu thu thập tại bệnh viện 39

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

là 37.000 ca/năm [14] , còn tại Mỹ tỷ lệ này lên tới 99.000 ca/năm Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao hơn với các bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời các NKBV có thời gian nằm viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng gấp 2-4 lần so với các trường hợp không NKBV Chi phí phát sinh do NKBV tại Anh quốc là khoảng 1 tỷ USD còn tại Mỹ là 28-45 tỷ USD[11]

Staphylococcsu aureus và Pseudomonas aeruginosa đang là hai trong 6 tác

nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay Ngoài ra việc thực hiện

các quy trình phát hiện S aureus và P aeruginosa chủ yếu hiện nay bằng

phương pháp vi sinh Phương pháp này thực hiện phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy và kiểm tra sản phẩm thu được gặp khó khăn và có khả năng nhầm lẫn các loại vi sinh vật với nhau Trong khi đó việc xác định nhanh và chính xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan trong cộng đồng

Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại kéo theo đó con người ngày càng am hiểu hơn và giải thích rõ ràng các quan điểm và kỹ thuật về

sinh học phân tử Qua đây việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào các lĩnh vực của đời sống ngày càng rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử đã và đang được ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đoán chính xác và nhanh chóng xác định đúng vi sinh vật gây bệnh Một số kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi như : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex PCR, ELISA trong đó kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết quả nhanh chóng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Xuất phát từ tình hình thực tiễn và dựa trên điều kiện cơ sở vật chất của khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông

Lâm Thái Nguyên tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa).”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng

(Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)

bằng kỹ thuật multiplex PCR

1.2.2 Yêu cầu của đề tài:

- Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S aureus và P

1.3 Ý nghĩa đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng bộ kít phát hiện nhanh

và đồng thời tụ cầu vàng (S aureus) và trực trùng mủ xanh (P aeruginosa)

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng vào công việc chẩn đoán

nhanh sự nhiễm trùng S aureus và P aeruginosa trong lĩnh vực y tế

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa

2.1.1 Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus lần đầu tiên được Scotland Alexander Ogston đề

cập đến tại Hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức năm 1881

Staphylococcus aureus lần đầu tiên được phân lập và phát hiện bởi Robert

Koch năm 1878 từ mủ ung nhọt Đến năm 1926, Julius von Daranyi đã hiện

ra sự tương quan giữa khả năng gây bệnh của S aureus với sự có mặt của enzyme coagulase huyết tương của vi khuẩn [1]

2.1.1.1 Danh pháp, phân loại

Staphylococcus aureus thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus tên khoa học là Staphylococcus aureus [36]

ưStaphylococcus aureus được phân loại chủ yếu theo hai cách sau:

- Dựa vào kháng nguyên: dựa vào hiện tượng ngưng kết với huyết thanh,

các nhà khoa học đã chia S aureus thành 18 kiểu huyết thanh Ngoài ra, có

thể dựa vào phương pháp miễn dịch học để chia S aureus thành kháng

nguyên polysaccharide A ở vách và kháng nguyên protein ở ngoài vách

- Dựa vào sự xâm nhiễm đặc hiệu của phage, S aureus được chia thành

các nhóm sau: Nhóm I gồm các kiểu huyết thanh 29, 52, 52A, 79 và 80; nhóm

II gồm các kiểu huyết thanh 3A, 3B, 3C, 55và 71; Nhóm III: gồm các kiểu huyết thanh 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84 và 85; và nhóm IV chỉ có 1 kiểu huyết thanh 42D [37]

2.1.1.2 Hình thái và cấu tạo của Staphylococcus aureus

Staphylococcus là những vi khuẩn Gram dương hình cầu và không di

động với đường kính khoảng 0,5-1,5μm Tế bào Staphylococcus xếp hình

chùm nho không di động , vi khuẩn này có thành tế bào kháng với lysozyme

và khá nhạy với lysotaphin, ngoài ra vi khuẩn này không sinh bào tử và cư trú trên da và màng nhày của con người cũng như động vật máu nóng [37]

Hình 2.1 Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus

(Nguồn: Wikipedia (https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus))

Ngày nay các nhà khoa học đã thành công trong việc giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được ký hiệu như sau: Newman, COL, UMRSA252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 Steven cùng cộng sự

đã giải trình tự thành công bộ gen của chủng S.aureus COL với kích thước

2809422 bp, kết quả này đã được đăng ký trên Genbank với mã số : CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo kết quả này

thì bộ gen của S aureus có chứa ít các cặp G-C điều này đã làm nảy sinh mối

lo ngại về sự chuyển gen giữa tụ cầu vàng và các tác nhân gây bệnh gram

dương khác [41] Trong số các chủng S.aureus phân lập từ các mẫu thực

phẩm, tỷ lệ chủng có khả năng sản sinh nội độc tố enterotoxin do nhóm gen

SE mã hóa được ước tính chiếm khoảng 25% số chủng, tại Pháp trong số 332

chủng S.aureus được phân lập từ thức ăn có 57% chủng có chứa các gen mã hóa nội độc tố SEG, SEB, SEI, SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen nội độc tố SEA và SEE mà trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [32]

2.1.1.3 Đặc điểm sinh học của Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có

enzyme catalase phân giải hydro peroxid (H2O2), giải phóng oxy và nước theo

phản ứng sau:

H2O2 H2O + O2

Ngoài ra, S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase Có thể xem việc S aureus có phản ứng đông huyết tương là tính chất đặc trưng của S aureus, cũng là tiêu chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase: coagulase “cố định”

(“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free” coagulase) được phóng thích ra ngoài thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện kiểm tra coagulase là thử nghiệm trên lam kính và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” do phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase

“tự do” do phản ứng dán tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố

khác trong huyết tương [27] S.aureus còn phản ứng với DNase, phosphatase

dương tính, có thể lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả

các dòng S.aureus đều nhạy với Novobicine(kháng sinh có thành phần là

spiramycin), có thể tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl

[27].Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc của S.aureus có mầu đen

nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3) và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của enzyme lethinase) [27] Trên môi trường MSA (Manitol salt

Catalase

agar), khuẩn lạc của S.aureus tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng

đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường

manitol) [27]

2.1.1.4.Đặc tính và các yếu tố độc lực

Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme Coagulase, enzyme này gắn với prothrompin trong huyết tương và hoạt tính hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibinogen Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm( clumping) một enzyme vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của

nó Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ quan trongjvaf yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố

độc tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn như :

Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ tế bào vi

khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt có khả năng gắn với mảnh thụ thể (Fc) của các glubuline miễn dịch, chính nhờ hiện tượng này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh

Fc của các globuline miễn dịch có vai trò trong hiện tượng opsonin hóa chúng

là các receptor cho các đại thực bào Qúa trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh

tránh không bị thực bào

Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào , nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học

bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc

Các yếu tố độc lực ngoại bào, tụ cầu vàng còn sản sinh một số enzyme

quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này như:

Hyaluronidase: enzyme này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ

chức giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức

Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt

cũng như tế bào bạch cầu

Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì enzyme này gây tổn

thương da tạo các bọng nước

Năm độc tố ruột(Enterotoxine A, B, C, D, E) bền với nhiệt các độc tố

này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng

sốc nhiễm độc đay là một hội chứng sốc trầm trọng

2.1.1.5 Cơ chế gây bệnh

Đầu tiên, trong quá trình tiếp xúc giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao gồm: da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang

và tổ chức nội mô) Staphylococcus aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide Hơn nữa, S.aureus mới có khả năng

khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm

nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ Staphylococcus aureus

xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một vài enzyme như hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy thành phần tế bào vật chủ Hầu hết các

chủng S.aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A)

có khả năng gắn với mảnh Fc (thụ thể) của các globuline miễn dịch Dựa vào hịên tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa, chúng là các receptor cho các đại thực bào Dựa vào quá trình gắn trên

giúp S aureus tránh không bị đại thực bào

2.1.2 Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa

2.1.2.1 Danh pháp, phân loại

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn thuộc giới Vi khuẩn (Bacteria),

ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ

Pseudomonadaceae, chi Pseudomonas, loài Pseudomonas aeruginosa [38] 2.1.2.2 Hình thái và cấu tạo

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn gram âm hiếu khí với khả năng di

chuyển một cực và có hình que Ngoài khả năng gây bệnh cho người và động

vật thì P.aeruginosa còn có khả năng gây bệnh trên các loài thực vật

Pseudomonas aeruginosa có vẻ ngoài được mô tả óng ánh và có mùi giông

như nho khi được nuôi cấy in vitro.Ngoài ra, P.aeruginosa có khả năng sinh

trưởng trong môi trường thiếu một phần hay hoàn toàn khí oxy [39]

Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa

(Nguồn:wikipedia(https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa) 2.1.2.3 Đặc điểm sinh học

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm hiếu khí, là trực khuẩn

với hai đầu tròn không có vỏ và nha bào, có lông roi ở một đầu nên di động

nhanh Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường thông

thường với nhiệt độ thích hợp là 37°C , pH = 7,2 - 7,5 Ở môi trường lỏng P

aeruginosa phát triển làm đục đều và trên bề mặt có váng, ở môi trường rắn

tạo nên khuẩn lạc dạng S tròn đều, to nhẵn, có loại khuẩn lạc nhỏ sù xì, dạng

R Một đặc điểm quan trọng là P aeruginosa khi nuôi cấy sinh sắc tố Có 2

loại sắc tố gồm loại xanh lam pyocianin ở môi trường có thể tan trong nước

và clorofooc và sắc tố huỳnh quang pyoverdin khi ta chiếu tia cực tím Vi

khuẩn tiết ra chất kimetylamin có mùi thơm đặc biệt [33]

Pseudomonas aeruginosa là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở

động vật và con người, nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên

da và các môi trường nhân tạo Vi khuẩn này không những sống trong môi trường không khí mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, vì vậy

nó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo, vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các chất hữu cơ Vì cơ chế thích ứng dễ dàng nó có thể sống và gây bệnh cho các mô, tế bào của người suy giảm miễn dịch, triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm tại vị trí xâm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, thận sẽ gây ra những tử vong cao bởi vi khuẩn này phát triển tốt trên bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể Bên cạnh đó vi khuẩn này phát triển tốt trên các dụng cụ y khoa gây ra viêm

nhiễm và lây lan vi khuẩn trong bệnh viện

2.1.2.4 Cơ chế gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương hở (nhất là vết thương do bỏng) Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ( mủ thường có màu xanh) nếu như cơ thể vật chủ suy giảm sức

đề kháng P.aeruginosa xâm nhập và gây viêm các phủ tạng (xương, đường

tiết niệu, tai giữa, phế quản ) hoặc có thể gây bệnh toàn thân Về sinh bênh học ,có giả thuyết cho rằng các sản phẩm ngoại tiết như sắc tế, độc tố tan máu, độc tố ruột, ngoại độc tố A (độc tố gây chết) có vai trò chính.Vi khuẩn

có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ

- Protease: gần 90% các chủng P.aeruginosacó khả năng phân giải protein P aeruginosatiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase

Nhiều chủng tiết ra collagenase Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu

đa nhân trung tính Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn dịch

- Hemolysine có 2 loại gồm: Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không

có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc Glycolipide đóng vai trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C và Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipide và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương

- Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân

trung tính và các tế bào lympho

- Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động

và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme

- Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể

là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non Khi gây nhiễm qua

da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch

2.2 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas

aeruginosa trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus

2.2.1.1 Trong nước

Ở Việt Nam tình hình nhiễm S.aureus là rất đáng lo ngại.Tỷ lệ dương tính với tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và tụ cầu vàng kháng Methicillin (MRSA) cũng giảm rõ rệt ở năm 2014 so với năm 2013: 4,14% vs 14,88% và 2,76% vs 6,61% Chủ yếu gặp ở các bệnh phẩm mủ được gởi từ Phòng mổ tại bệnh viện Đa khoa Tỉnh Bình Định tỷ lệ gặp của tụ cầu vàng năm 2012 là 6,2% Một điểm nổi bật chúng tôi nhận thấy trong năm 2013 có

13 ca cấy mủ của các bệnh phẩm ở các cơ quan khác nhau của những bệnh nhân khác nhau từ Phòng mổ đều cho kết quả dương tính với tụ cầu vàng

và kết quả kháng sinh đồ cũng giống hệt nhau về độ nhạy cảm Theo một báo cáo của TS.BS Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự khi khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa hồi sức tích cực và chống độc Bệnh Viện Trưng Vương cho thấy khi khảo sát các mẫu bệnh phẩm dương tính, chúng tôi nhận thấy 5 vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viên là

Acinetobacter baumannii (32,3%), S.aureu 15,4%, Klebsiellaspp (13,8%),

E.coli (9,7%), P aeruginosa (7,7%) Trong đó Acinetobacter baumannii

được phân lập chủyếu tại bệnh phẩm đàm (39,3%), và cũng là nguyên nhân gây bệnh tại phổi nhiều nhất Staphylococcus aureus chủ yếu được phân lập trong máu (40%) và Enterococcus spp được phân lập chủ y ếu trong nước tiểu (35%)

Ngoài ra, S aureus còn nhiễm vào trong thực phẩm với tính chất khá nghiêm trọng, vào năm 1974 tỷ lệ nhiễm S aureus là 12% trong tổng số các

vụ ngộ độc thực phẩm thì đến năm 1995 con số này đã tăng lên 22%, năm

2004 lên đến 63%.Theo báo cáo của bộ y tế năm 2006 đã sảy ra tổng cộng 35

vụ ngộ độc thức ăn trong cả nước Trong tổng số 25 vụ ngộ độc tập thể thì có

11 vụ xảy ra trong các trường học, trong dó có đến 9 thủ phạm do nhiễm

S.aureus Đặc biệt cũng trong năm 2006 đã xảy ra 1 vụ nhiễm S aureus ở trẻ

em, điều tra cho thấy 2/6 trẻ bị sốc vacxin có nhiễm S Aureus [4] Trong năm

2007 nước ta có 2 vụ ngộ độc thực phẩm tập thể và thủ phạm là S aureus

Vào tháng 9 năm 2007 ở tỉnh Phú Thọ xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể với gần

100 học sinh tại trường mầm non Vĩnh Lại bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm t

aureus Vào tháng 12 năm 2007 tại thành phố Hồ Chí Minh xảy ra 2 vụ ngộ

độc thực phẩm tập thể, điều chú ý là 2 vụ ngộ độc này đều xảy ra trong trường

học do nhiễm S aureus.Trong đó, có 31 em tại trường tiểu học Âu Cơ và 44

em tại trường mầm non Vường Hồng[4] Trong năm 2009 trên cả nước có

tổng cộng 116 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 6 vụ do nhiễm S aureus

Đáng chú ý vào tháng 7 năm 2009 tại Hải Dương đã xảy ra 1 vụ ngộ độc do

nhiễm S aureus và số người bị ngộ độc trong vụ này lên tới 258 người Từ

năm 2010 đến nay cả nước có 67 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5 vụ là

do S.aureus gây nên[4]

2.2.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Staphylococcus aureus

Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng

70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm Ở các nước châu Á S aureus là nguyên

nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc Tại châu Mỹ tiêu biểu là Hoa Kỳ những

vụ ngộ độc thực phẩm chủ yếu đều do S.aureus gây ra, theo thống kê cho thấy

từ 1972-1976 ngộ độc S aureus chiếm 21,4% trong tổng số các vụ ngộ độc

Từ năm 1983-1987 con số này thấp hơn với chỉ 5,2% Theo một thống kê mới nhất thì đến tháng 9 năm 2009 Hoa Kỳ có 32 vụ ngộ độc thực phẩm có

thủ phạm chính là aureus chiếm 10,3% trong tổng số các vụ ngộ độc[4].Các

đánh giá gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000 người tử

vong vì S aureus Ước tính có khoảng 19000 người mĩ tử vong vì S aureus

trong năm 2005, Ở châu Á các vụ nhiễm S aureus chủ yếu ở các nước Nhật

Bản, Trung Quốc và trong và trong khu vực Đông Nam Á [4] Tại Trung Quốc trong năm 2008 đã sảy ra một vụ ngộ độc ở trẻ em vì uống sữa có chứa

S.aureus Còn ở Nhật Bản cũng đã có 2 vụ ngộ độc S.aureus lớn vào tháng 8

năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo vào tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai Nguyên

nhân của hai vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có chứa S.aureus của tập đoàn Snow[4] Tại khu vực Đông Nam Á 2 quốc gia có tỉ lệ ngộ độc S

aureus cao là Indonesia và philippines Việt Nam cũng là một trong những

nước có tỉ lệ nhiễm S.aureus cao ở trong khu vực Châu Á Còn ở châu Âu

S.aureus chủ yếu lây nhiễm cho người từ các bệnh viện, tỷ lệ nhiễm S.aureus

chiếm 7% trong các vụ nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện Ở các vụ nhiễm

khuẩn huyết ở Anh thì nhiễm khuẩn do S.aureus chiếm đến 96%

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa

2.2.2.1 Trong nước

Hầu hết khả năng gây bệnh và tính đề kháng kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm do nhiễm trùng vết thương Quá trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng sự trên các tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô

hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P.aeruginosa là tác nhân chính gây

nhiễm khuẩn Ngoài ra, hầu hết trong số 374 chủng trực trùng mủ xanh phân lập được có 16 chủng phân lập từ mẫu máu (16 mẫu), 47chủng từ mẫu nước tiểu và 331 mẫu phân lập từ đờm kháng lại nhiều loại kháng sinh Báo cáo về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện đa khoa (BVĐK) tỉnh Quảng

Ngãi và bệnh viện đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004 cho thấy P

aeruginosa sếp thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, chủ yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với

amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon Kết quả mẫu nước y tế tại 2 bệnh

viện cho kết quả: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có

vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm

trẻ em sơ sinh lấy từ sô đựng nước của cả 2 bệnh viện đều bị nhiễm P

aeruginosa và P.aeruginosa kháng thuốc Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong

mẫu nước chủ yếu là P aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram

âm (28,6%) [8] Trong một báo cáo của Lê Bảo Huy và cộng sự, tác nhân gây bệnh viêm phổi bệnh viện đa phần là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15%, trong

đó P aeruginosa chiếm 41,15% Vi khuẩn này có sức đề kháng khá cao đối

với những kháng sinh chuyên dùng để trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%) [5] Ngoài ra theo một báo cáo Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự (2014) thì riêng với vi khuẩn Pseudomonas spp và P aeruginosa tỷ lệ gặp ở năm 2014 cao hơn so với năm 2013, tính chung cho cả hai loại là 7,59% vs 4,96% Chủ yếu gặp ở bệnh phẩm đàm từ Khoa Hồi Sức Cấp Cứu và Phòng mổ Tại BV Đa khoa Tỉnh Bình Định tỷ lệ gặp chung cho Pseudomonas năm 2012 là 9,6%( theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự)

Riêng đối với VK Pseudomonas, nếu công tác vệ sinh bệnh phòng không tuân thủ, đặc biệt tải lau nhà không được giặt sạch và phơi khô thì cũng góp phần vào việc làm lây lan VK Pseudomonas trong bệnh viện Nội dung này cần được Khoa KSNK giám sát và nhắc nhở thường xuyên cho đơn vị vệ sinh bệnh viện

2.2.2.2 Trên thế giới

Lateef A (2005), đã khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các

mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P aeruginosa đã có mặt

trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,

nước giếng và nước máy) Kết quả: 3,46% P.aeruginosa phân lập từ đất đề

kháng với 5 loại kháng sinh Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin) Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid,

ofloxacin, nitrofurantoin) Trong nước, 6,7% P.aeruginosa kháng lại 4 loại

kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole)[21] Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh của

P.aeruginosa khá cao Gales A C (1997-1999), 6631 chủng P.aeruginosa

được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường hô hấp tại 3 vùng khác

nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin) Trong đó 218 mẫu P aeruginosa

đã kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng (piperacillin, ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ là 8,2% ở Châu Mỹ Latin, 0,9% ở Cannada[17]

Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2 (2004), nghiên cứu P.aeruginosa trên các bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P.aeruginosa xâm nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy P.aeruginosa xuất

hiện nhiều hơn trên các bệnh nhân là trẻ em và người già Khảo sát tính nhạy

cảm kháng sinh của 20 chủng P aeruginosa phân lập được cho thấy tính

nhạy cảm của vi khuẩn này với một số kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%), gentamicin (75%), streptomycin (30%), và tetracycline (10%)[25] Theo

nhiều nhà khoa học, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu hiệu trong điều trị các nhiễm trùng do P.aeruginosa gây ra Đặc biệt, fosfomycin có hiệu quả

khá tốt khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin[24] Theo báo cáo N.B Hirulkar và Bhavna Soni (2011) trong nghiên cứu phân lập

P.aeruginosa trong nước uống thì có tổng số 22 mẫu được phát hiện nhiễm P.aeruginosa khi được phân lập cho thấy kháng 55% là Ciprofloxacin, tiếp

theo là Gentamicin (51%), Nitrofurantoin (51%), Erythromycin (50%), Cotrimoxazole (50%), Ofloxacin ( 50%), tetracycline (46%), Norfloxacin (46%), Cephalexin (46%), Metronidazole (46%), Ampicillin (41%), Penicillin (41%) và Amoxycillin (41%)[20]

2.3 Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa

2.3.1 Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus

2.3.1.1 Phương pháp vi sinh

Staphylococcus aureus có thể được phát hiện thông qua cá mẫu bệnh

phẩm của bệnh nhân, thông qua phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn, cấy chuyển, kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh quy trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định tính chất hóa

sinh[12]

- Ưu điểm của phương pháp: thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu

tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền

- Nhược điểm của phương pháp: độ nhạy không cao, thời gian để phát

hiện là vi khuẩn gây bệnh do S.aureus khá dài, tốn nhiều nhân công, cần có

nhân viên có kỹ thuật có kinh nghiệm về vi sinh vật, yêu cầu kỹ năng thao tác của người thực hiện Ngoài ra khả năng nhầm giữa vi khuẩn gây bệnh khác

với S.aureus là khá cao

2.3.1.2.Phương pháp miễn dịch

Phương pháp dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng

nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm S.aureus

- Ưu điểm của phương pháp: Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10 pg Thời gian cho kết quả ngắn hơn tất cả các

phương pháp xét nghiệm truyền thống

- Nhược điểm: nhược điểm của phương pháp này chủ yếu về mặt con người, vì cần có cán bộ chuyên môn được đào tạo và kỹ năng vững vàng Tuy nhiên phương pháp miễn dịch vẫn cho tỉ lệ kết quả dương tính giả cao.Theo nghiên cứu của Berke A và cộng sự (1986) cho biết tỉ lệ dương

tính giả khi xác định S.aureus qua phương pháp miễn dịch là 10,3% và họ

khuyến cáo sử dụng phương pháp miễn dịch như là biện pháp thông thường

để xác định Staphylococcus aureus[13]

2.3.1.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

Nguyên lý của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài Đây là phương pháp nhân số lượng bản sao gen của độc tố

vi khuẩn trong mẫu vật lên hàng triệu lần đến mức có thể phát hiện được chúng[9]

- Ưu điểm của phương pháp: Có thể phát hiện S aureus trong thời gian

tương đối ngắn với lượng mẫu nhỏ, những tế bào đã chết vẫn có thể phát hiện,

phát hiện nhanh, nhạy và chuyên biệt

Nhược điểm của phương pháp: Chỉ có thể xác định có sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố mà không thể xác định được có tạo độc tố hay không cũng như việc định lượng độc tố có trong bẹnh phẩm Ngoài ra có thể kể đến một phương pháp PCR cải tiến là Kỹ thuật Realtime PCR: Nguyên lý của phương pháp này là cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang qua đó định lượng nồng độ vi sinh vật trong mẫu vật Năm 2007 Malorny B và cộng sự

đã sử dụng kỹ thuật realtime PCR để phát hiện vi khuẩn Salmonella

enteritidis trong thịt gia cầm và trứng Trong đó Gen Prot6e nằm trên S enteritidis đã được sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò Độ nhạy và độ đặc

hiệu của quy trình đạt tuyệt đối lên tới 100%[22] Phương pháp này có ưu điểm là cho kết quả nhanh và xác định chính xác lượng sản phẩm tạo ra qua từng phản ứng hơn nữa độ đặc hiệu của phương pháp rất cao và không cần điện di kiểm tra sản phẩm Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là chi phí đầu tư khá cao yêu cầu người thực hiện có khả năng đọc kết quả và thao

tác vững vàng

2.3.1.4.Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme – ELISA

Phương pháp ELISA thường gặp nhất là phương pháp sandwich Nguyên lý của phương pháp này là kháng thể được gắn với mẫu chưa biết, sau đó phức hợp kháng thể - độc tố được gắn với cộng hợp enzyme – kháng

thể[16]

Ưu điểm của phương pháp này là nhanh và đặc hiệu xác định được lượng độc

tố có trong mẫu vật

Nhược điểm là yêu cầu con thao tác có chuyên môn qua đào tạo

2.3.2 Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa

2.3.2.1 Phương pháp vi sinh

Cũng như phương pháp phát hiện S.aureus bằng phương pháp vi sinh thì để phát hiện P aeruginosa bằng phương pháp này người ta cũng phải nuôi cấy và phân lập P aeruginosa trên môi trường chuyên biệt qua cấy chuyển và

đánh giá vầ mặt hóa sinh cũng như quan sát mẫu vi khuẩn nuôi cấy có thể

phát hiện ra P aeruginosa Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là tốn thời gian và có thể nhầm lẫn với vi sinh khác không phải P aeruginosa yêu

cầu người làm thí nghiệm có trình độ chuyên môn Nhưng phương pháp này

lại yêu cầu ít chi phí vào đầu tư đễ làm