Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật siRNA hướng gen mục tiêu KSP và VEGF trên một số dòng tế bào ung thư gan người

1 GIỚI THIỆU CHUNG Ung thư gan (UTG) loại ung thư phổ biến toàn giới, chiếm 6,26% tổng số ung thư người, với 500.000 trường hợp phát năm Tại Việt Nam, UTG loại ung thư phổ biến đứng thứ nam nữ Tỷ lệ người mắc bệnh UTG Việt Nam đứng thứ hai giới, cao gấp 10 lần so với Hoa Kỳ Hiện nay, việc điều trị UTG chủ yếu dựa ba phương pháp bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị xạ trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) hóa trị (sử dụng hóa chất gây độc để tiêu diệt tế bào ung thư) Đa số phương pháp điều trị truyền thống chưa mang đến kết mong đợi Hạn chế lớn đối phương pháp gây tổn thương cho tế bào lành tính hoạt động bình thường Gần đây, với tiến lĩnh vực sinh học phân tử tế bào, chiến lược tác động trúng đích điều trị UTG đề xuất phát triển, bao gồm kỹ thuật RNA can thiệp (RNA interference – RNAi) RNAi chế điều hòa biểu gen chuyên biệt hoạt hóa phân tử nhỏ siRNA (small-interfering RNA) với kích thước khoảng 19-23 nucleotide RNAi có vai trò ức chế biểu gen mục tiêu thông qua việc phân hủy trình tự mRNA tương ứng hay ức chế trình dịch mã Tác động có tính chọn lọc đặc hiệu RNAi lên gen giúp cho RNAi trở thành công cụ hiệu nghiên cứu biểu gen in vitro in vivo Hơn nữa, RNAi tác động ức chế đồng thời biểu nhiều gen khác liên quan đến ung thư Ngoài ra, RNAi dễ dàng tổng hợp (siRNA) hay dòng hóa vào vector (shRNA) Hiệu tác động RNAi lên gen đích dễ dàng phát thời gian ngắn Do vậy, việc sử dụng kỹ thuật RNAi bất hoạt gen giữ vai trò quan trọng đường truyền tín hiệu tế bào ung thư hướng đầy hứa hẹn điều trị UTG Sự hình thành phát triển ung thư phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Thứ nhất, tăng trưởng mức tế bào việc kiểm soát cân trình sống chết tế bào Thứ hai, kháng lại trình tế bào chết theo chương trình (apoptosis) rối loạn chức kiểm soát chu trình tế bào Thứ ba, hóa tế bào hoạt tính telomerase tăng cường hay tái tạo đoạn telomere Thứ tư, lẩn tránh khỏi hệ thống miễn dịch biến đổi mặt di truyền tế bào ung thư Cuối cùng, tạo mạch khối u thúc đẩy biểu mức nhân tố kích thích tạo mạch Đây điểm khác biệt thường thấy mô bình thường mô ung thư Tương tự loại ung thư khác, tiến trình phát triển UTG phụ thuộc vào tăng sinh mức tế bào Trong đó, nguyên phân bước quan trọng trình tăng sinh tế bào Protein cấu trúc thoi vô sắc Kinesin (Kinesin spindle protein – KSP), thành viên họ protein vận động Kinesin, đóng vai trò chủ đạo trình nguyên phân KSP tham gia vào trình phân chia tế bào cách gián tiếp phân tách trung thể xếp thoi vô sắc hai cực nhân tế bào Do vậy, kìm hãm hoạt động KSP dẫn đến thất bại việc phân tách trung thể, ngăn chặn hình thành thoi vô sắc lưỡng cực, ức chế trình nguyên phân, cảm ứng apoptosis cuối dẫn đến gây chết tế bào phân chia Gen KSP thường biểu thấp không biểu tế bào mô không tăng sinh, biểu mạnh tế bào tăng sinh hay tế bào chuyển dạng Mức độ biểu KSP mô ung thư vú, ung thư phổi,… thường cao so với mô bình thường nằm gần khối u Sự biểu mức KSP gây ổn định di truyền hình thành khối u chuột Ngoài ra, biểu KSP thường phát thấy mô UTG có mối tương quan chặt chẽ với tiến trình phát triển UTG Do vậy, KSP trở thành đích trị liệu đầy hứa hẹn điều trị UTG Bên cạnh phương pháp điều trị sử dụng thuốc ức chế KSP, việc sử dụng kỹ thuật RNAi tác động trực tiếp lên gen KSP hướng điều trị UTG Bên cạnh tăng sinh mức tế bào, hình thành phát triển hệ thống mạch máu khối u đặc điểm đặc trưng UTG Trong đó, tạo mạch đóng vai trò tiến trình phát triển bệnh Sự hình thành mạch máu bên xung quanh khối u làm tăng khả cung cấp oxy chất dinh dưỡng, đồng thời loại bỏ bớt chất thải cho khối u Sự tạo mạch tạo thuận lợi cho di cư tế bào khối u tới vùng xa thể, hình thành di hay xâm lấn tế bào UTG Vì vậy, chiến lược ức chế tạo mạch khối u hướng trị liệu tiềm dạng u ác tính, kể khối u đặc Nhân tố tăng sinh nội mô thành mạch (Vascular endothelial growth factor – VEGF) nhân tố điều hòa quan trọng trình hình thành mạch khối u Gen VEGF thường biểu mô UTG Sự gia tăng mức độ biểu VEGF tương ứng với gia tăng kích thước khối u gan VEGF, chủ yếu VEGF-A, tiết nhiều tế bào khối u gan VEGF tác động lên nhiều loại tế bào khác tế bào nội mô, tế bào tiền thân nội mô, tế bào gan vệ tinh, tế bào u máu theo chế cận tiết hay tự hoạt hóa tế bào khối u thông qua chế tự tiết nhằm kích hoạt thay đổi mạch khối u gan VEGF có khả gắn kết với thụ thể VEGFR-1 VEGFR-2 Đây thụ thể biểu hầu hết bề mặt tế bào tế bào nội mô, tế bào gan vệ tinh tế bào UTG Sự tương tác VEGF với thụ thể VEGFR kích hoạt đường truyền tín hiệu thúc đẩy trình sinh học tăng sinh, biệt hóa, di căn, đáp ứng thuốc,…và kéo dài sống tế bào ung thư Ngoài ra, mức độ biểu VEGF có tương quan với giai đoạn phát triển bệnh UTG Những ảnh hưởng cho thấy VEGF thực yếu tố quan trọng chiến lược điều trị UTG Sự hình thành mạch khối u bị ức chế thông qua việc ức chế hoạt động VEGF gắn kết với thụ thể VEGFR kháng thể kháng VEGF (Bevacizumab, Avastin) hay thụ thể VEGFR hòa tan Tuy nhiên, bất lợi lớn phương pháp tiếp cận VEGF luân chuyển tuần hoàn phải bị bắt giữ vô hiệu hóa hoàn toàn để ngăn chặn tác động diễn sau VEGF Ngoài ra, việc sử dụng kháng thể kháng VEGF hay chất ức chế khác gây tác dụng phụ không mong muốn gây chảy máu hay đông tụ huyết Do vậy, việc giảm lượng VEGF tiết từ khối u gan thông qua việc ức chế biểu VEGF kỹ thuật RNAi cách tiếp cận thích hợp Hơn nữa, hiệu ức chế biểu VEGF siRNA chứng minh nhiều mô hình tế bào ung thư khác Sự hình thành phát triển UTG liên quan tới đột biến di truyền xảy đồng thời nhiều gen khác Các chiến lược điều trị dựa ức chế biểu riêng biệt gen không đủ để kìm hãm tiến trình phát triển bệnh Do vậy, việc ức chế đồng thời biểu nhiều gen hi vọng mang lại hiệu điều trị tốt Ngoài ra, việc kết hợp liệu pháp tác động trúng đích (siRNA) với liệu pháp truyền thống (hóa trị liệu) phương thức tiếp cận phù hợp điều trị ung thư, đặc biệt loại ung thư có mức độ đáp ứng thuốc thấp UTG Trong định hướng phát triển liệu pháp điều trị UTG siRNA, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật siRNA hướng gen mục tiêu KSP VEGF số dòng tế bào ung thư gan người” thực với mục tiêu: Lựa chọn trình tự siRNA hướng gen KSP gen VEGF có hiệu ức chế cao Đánh giá ảnh hưởng siRNA lên số dòng tế bào UTG người Đánh giá hiệu phối hợp siRNA thuốc kháng ung thư việc tiêu diệt tế bào UTG in vitro Đề tài triển khai hướng nghiên cứu hoàn toàn điều trị ung thư Việt Nam Sự thành công nghiên cứu hi vọng mở hướng việc tiếp cận phát triển thuốc dựa kỹ thuật RNAi nhằm điều trị UTG số bệnh khác tương lai đơn vị tác giả công tác 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu 2.1.1 Các dòng tế bào sử dụng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành dòng tế bào UTG, gồm Hep3B, HepG2, Huh-7, tế bào gan THLE-3 tế bào nội mô HUVEC Các dòng tế bào cung cấp viện nuôi cấy tế bào Hoa Kỳ (American Type Culture Collection-ATCC) công ty cung cấp tế bào Đức (Cell Line Service-CLS) 2.1.2 Trình tự siRNA sử dụng nghiên cứu Các trình tự siRNA hướng gen mục tiêu VEGF (VEGF-siRNA) hay KSP (KSP-siRNA) trình tự siRNA không tác động lên gen mục tiêu dùng làm đối chứng (CONT-siRNA) cung cấp ngân hàng siRNA thuộc phòng nghiên cứu phát triển sản phẩm (RD), công ty TNHH CNSH Dược Nanogen (Bảng 2.1) Các siRNA biến đổi (gắn đuôi dTdT) tổng hợp công ty Bioneer (Daejeon, Hàn Quốc) Ngoài ra, trình tự siRNA đối chứng gắn chất huỳnh quang FITC (FITC-CONT-siRNA, sc-36869) mua từ công ty Santa Cruz Biotechnology (Hoa Kỳ) Bảng 2.1 Trình tự siRNA sử dụng nghiên cứu Vị trí bắt cặp Tên Trình tự (5’–3’) Mạch mang mã: GCACAUAGGAGAGAUGAGCdTdT VEGF-siRNA#1 1383-1401 Mạch đối mã: GCUCAUCUCUCCUAUGUGCdTdT Mạch mang mã: UGAAGUUCAUGGAUGUCUAdTdT VEGF-siRNA#2 1160-1178 Mạch đối mã: UAGACAUCCAUGAACUUCAdTdT Mạch mang mã: GCCUUGCCUUGCUGCUCUAdTdT VEGF-siRNA#3 1070-1088 Mạch đối mã: UAGAGCAGCAAGGCAAGGCdTdT Mạch mang mã: CUGAAGACCUGAAGACAAUdTdT KSP-siRNA #1 2431-2449 Mạch đối mã: AUUGUCUUCAGGUCUUCAGdTdT Mạch mang mã: UCGAGAAUCUAAACUAACUdTdT KSP-siRNA #2 1241-1259 Mạch đối mã: AGUUAGUUUAGAUUCUCGAdTdT Mạch mang mã: CUGGAUCGUAAGAAGGCAGdTdT KSP-siRNA #3 1857-1875 Mạch đối mã: CUGCCUUCUUACGAUCCAGdTdT Mạch mang mã: GCGGAGAGGCUUAGGUGUAdTdT CONT-siRNA Mạch đối mã: UACACCUAAGCCUCUCCGCdTdT Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng kháng thể, trình tự mồi (primer), kit, môi trường nuôi cấy tế bào số hóa chất cho thí nghiệm cụ thể (tham khảo luận án) 2.2 Quy trình nghiên cứu Nghiên cứu chia làm ba giai đoạn Mỗi giai đoạn tương ứng với mục tiêu nghiên cứu 2.2.1 Quy trình nghiên cứu giai đoạn Nghiên cứu thiết kế thí nghiệm để lựa chọn trình tự siRNA tốt từ trình tự siRNA ban đầu Trước tiên, nghiên cứu đánh giá mức độ biểu gen VEGF KSP tế bào UTG tế bào gan phương pháp real-time qRT-PCR, Western blot ELISA Dựa kết này, nghiên cứu lựa chọn dòng tế bào UTG để tối ưu quy trình chuyển siRNA vào tế bào Để đánh tối ưu quy trình chuyển siRNA vào tế bào, CONT-siRNA hay FITC-CONT-siRNA chuyển vào dòng tế bào UTG lựa chọn Quy trình chuyển siRNA đánh giá thông qua: mức độ gây độc siRNA tế bào hiệu chuyển siRNA vào tế bào Mức độ gây độc tế bào siRNA theo nồng độ đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào sống chết phương pháp WST-1 Hiệu chuyển siRNA vào tế bào theo nồng độ thời gian đánh giá thông qua tín hiệu huỳnh quang FITC kỹ thuật FACS Với kết đạt được, nghiên cứu lựa chọn nồng độ thời gian phù hợp để đánh giá hiệu ức chế gen đích siRNA tế bào UTG Sau có quy trình tối ưu, nghiên cứu đánh giá hiệu ức chế gen đích trình tự siRNA khác thông qua giảm mức độ biểu mRNA gen Dựa kết này, nghiên cứu lựa chọn trình tự siRNA có hiệu ức chế gen đích tốt Sau đó, hiệu ức chế gen đích theo thời gian trình tự siRNA lựa chọn tiếp tục kiểm tra Thời gian đánh giá dựa vào thời gian chuyển tối ưu FITC-CONT-siRNA vào tế bào Sự thay đổi biểu gen VEGF KSP tế bào sau chuyển siRNA thời điểm đánh giá mức độ mRNA phương pháp real-time qRT-PCR protein phương pháp Western blot ELISA 2.2.2 Quy trình nghiên cứu giai đoạn Các thí nghiệm thiết kế nhằm đánh giá hiệu tác động trình tự siRNA lựa chọn lên dòng tế bào khác Trước tiên, siRNA chuyển riêng biệt hay đồng thời (phối hợp VEGF-siRNA hay KSP-siRNA theo tỉ lệ 1:1, gọi cocktail siRNA) vào dòng tế bào UTG tế bào gan Hiệu ức chế riêng biệt hay đồng thời biểu gen VEGF KSP siRNA đánh giá hai mức độ mRNA protein Sau đánh giá hiệu ức chế gen mục tiêu siRNA dòng tế bào, nghiên cứu đánh giá tác động siRNA lên số đặc tính sinh học tế bào UTG tế bào thường: khả tăng sinh khả cảm ứng apoptosis Hiệu ức chế tăng sinh tế bào siRNA đánh giá qua phương pháp tăng sinh tế bào WST-1 Hiệu cảm ứng apoptosis tế bào đánh giá thông qua phương pháp nhuộm tế bào đồng thời với protein Annexin V có gắn chất phát huỳnh quang FITC (Annexin V-FITC) thuốc nhuộm nhân PI Tỉ lệ tế bào cảm ứng apoptosis xác định kỹ thuật FACS Sau đó, nghiên cứu đánh giá thay đổi biểu số nhân tố kiểm soát trình tăng sinh apoptosis tế bào, bao gồm nhân tố kháng apoptosis (BCL-2, Survivin) nhân tố cảm ứng apoptosis (Caspase-3/-7) Sự thay đổi biểu nhân tố đánh giá hai mức độ mRNA protein Bên cạnh đó, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng siRNA lên số đặc tính sinh học tế bào UTG như: khả di cư (mô hình lành hóa vết rạch), khả di (mô hình đĩa chuyển màng), khả sống (sự thành bào lạc tế bào đơn) khả kích thích tạo mạch (mô hình kích thích tế bào nội mô hình thành mạch) Các đánh giá tác động siRNA lên số đặc tính sinh học tế bào thay đổi biểu số nhân tố kiểm soát trình sở để chứng minh hiệu ức chế gen đích siRNA tế bào UTG 2.2.3 Quy trình nghiên cứu giai đoạn Nghiên cứu thiết kế thí nghiệm để đánh giá hiệu phối hợp siRNA thuốc kháng ung thư việc tiêu diệt tế bào UTG in vitro Trước tiên, nghiên cứu đánh giá mức độ đáp ứng thuốc tế bào UTG với Doxorubicin theo nồng độ thời gian Mức độ đáp ứng thuốc tế bào đánh giá thông qua ức chế tăng sinh tế bào phương pháp WST-1 Kết làm sở đánh giá đáp ứng thuốc tế bào hiệu tiêu diệt tế bào UTG Doxorubicin Sau đó, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc tế bào UTG với Doxorubicin Sự ức chế tăng sinh tế bào Doxorubicin phối hợp với siRNA theo dõi thời điểm khác Tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào xác định phương pháp WST-1 Kết làm sở đánh giá hiệu ức chế tăng sinh hay tiêu diệt tế bào UTG in vitro phối hợp Doxorubicin với siRNA Bên cạnh đó, nghiên cứu đánh giá thay đổi biểu số nhân tố ảnh hưởng tới mức độ đáp ứng thuốc tế bào, bao gồm BCL-2, Survivin Caspase-3/-7 Sự thay đổi biểu nhân tố đánh giá mức độ mRNA protein KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết lựa chọn trình tự VEGF-siRNA KSP-siRNA 3.1.1 Sự biểu gen VEGF KSP dòng tế bào ung thư gan tế bào gan Trong nghiên cứu này, biểu gen VEGF KSP dòng tế bào UTG Hep3B, HepG2, Huh-7 dòng tế bào gan THLE-3 xác định mức độ mRNA protein RNA tổng số, protein tổng số dịch nuôi cấy tế bào thu nhận từ dòng tế bào khác Hình 3.1 Sự biểu mRNA VEGF mRNA KSP dòng tế bào khác Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA VEGF (a) mRNA KSP (b) tế bào THLE-3 (sử dụng làm chuẩn), Hep3B, HepG2 Huh-7 xác định phương pháp real-time qRT-PCR Gen β-actin sử dụng làm chứng nội dùng để chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với tế bào đối chứng THLE-3) Hình 3.2 Sự biểu protein VEGF protein KSP dòng tế bào khác Mức độ biểu protein VEGF protein KSP tế bào THLE-3 (sử dụng làm chuẩn), Hep3B, HepG2 Huh-7 xác định phương pháp Western blot (a) Đồ thị biểu diễn kết bán định lượng protein VEGF protein KSP dòng tế bào khác xác định phần mềm Image J (b, c) β-actin sử dụng làm chứng nội dùng để chuẩn hóa kết Đồ thị biểu diễn kết định lượng protein tiết VEGF phương pháp ELISA (d) Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với tế bào đối chứng THLE-3) Kết phân tích real-time qRT-PCR cho thấy mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào gan THLE-3 thấp Do vậy, mức độ biểu sử dụng làm chuẩn (giá trị 1) so sánh với mức độ biểu mRNA tế bào UTG Kết cho thấy mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào UTG cao so với tế bào gan (p < 0,01; Hình 3.1) Mức độ biểu mRNA phù hợp với mức độ biểu protein tương ứng gen mục tiêu phân tích phương pháp Western blot (đối với protein VEGF protein KSP) phương pháp ELISA (đối với protein VEGF) Mức độ biểu protein VEGF protein KSP tế bào UTG cao so sánh với tế bào gan (p < 0,01; Hình 3.2) Ngoài ra, kết phân tích cho thấy mức độ biểu gen VEGF KSP dòng tế bào UTG khác Trong đó, dòng tế bào Hep3B Huh-7 biểu gen mạnh so với dòng tế bào HepG2 Dựa kết này, nghiên cứu lựa chọn dòng tế bào Hep3B làm mô hình nghiên cứu đánh giá hiệu chuyển siRNA vào tế bào UTG 3.1.2 Hiệu chuyển siRNA dòng tế bào ung thư gan Hep3B Để đánh giá mức độ gây độc cho tế bào chuyển, CONT-siRNA FITC – CONTsiRNA chuyển vào tế bào Hep3B nồng độ khác gồm: 0, 10, 25, 50, 100, 200 nM Sau 24 chuyển siRNA, tỉ lệ tế bào sống xác định phương pháp WST-1 Kết cho thấy nồng độ 10 nM, 25 nM 50 nM CONT-siRNA, tỉ lệ tế bào sống tương đương cao Ngược lại, nồng độ siRNA cao hơn, tỉ lệ tế bào sống giảm mạnh Kết tương tự đạt chuyển FITC – CONT-siRNA Tỉ lệ tế bào sống cao nồng độ 10 nM, 25 nM, 50 nM giảm dần tăng nồng độ FITC – CONT-siRNA (Hình 3.3) Kết cho thấy siRNA ảnh hưởng tới tế bào chuyển nồng độ 10 nM, 25 nM 50 nM Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ siRNA lên khả sống tế bào Hep3B chuyển CONT-siRNA FITC – CONT-siRNA Khả sống tế bào Hep3B sau chuyển siRNA xác định phương pháp WST-1 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ tế bào sống chuyển CONT-siRNA (a) FITC – CONTsiRNA (b) sau 24 Tế bào xử lý với lipofectamine (0 nM siRNA) sử dụng làm chuẩn chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với tế bào chuyển siRNA với nồng độ 200 nM) Để đánh giá lượng siRNA chuyển vào tế bào, FITC – CONT-siRNA chuyển vào tế bào Hep3B nồng độ khác nhau: 0, 10, 25, 50, 100, 200 nM 24 Hiệu chuyển đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang kỹ thuật FACS Kết phân tích cho thấy tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang cao đạt chuyển FITC – CONT-siRNA với nồng độ 25 nM Như vậy, nghiên cứu lựa chọn nồng độ siRNA tối ưu 25 nM Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá lượng siRNA chuyển vào tế bào theo thời gian (khoảng 120 giờ) Hiệu chuyển đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang kỹ thuật FACS Kết cho thấy tín hiệu huỳnh quang phát thấy tế bào sau giờ, tăng mạnh trì khoảng 24-72 (Hình 3.4) Hình 3.4 Hiệu chuyển siRNA vào tế bào Hep3B theo nồng độ thời gian chuyển Đồ thị biểu diễn tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang phát phương pháp FACS sau chuyển FITC – CONT-siRNA theo nồng độ khác (a) thời điểm khác (b) Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với tế bào chuyển 200 nM siRNA (a) tế bào chuyển siRNA sau 120 (b) Ngoài ra, quan sát kính hiển vi huỳnh quang, tế bào phát tín hiệu huỳnh quang phát thấy sau chuyển siRNA Cường độ huỳnh quang tăng dần tới 72 giảm dần sau 96 chuyển siRNA (Hình 3.5) Như vậy, nghiên cứu lựa chọn nồng độ chuyển siRNA 25 nM thời gian đánh giá hiệu siRNA 24-72 cho nghiên cứu Hình 3.5 Hiệu chuyển FITC – CONT-siRNA vào tế bào Hep3B theo thời gian Mức độ phát huỳnh quang tế bào sau chuyển siRNA quan sát kính hiển vi huỳnh quang thời điểm 3.1.3 Hiệu ức chế biểu VEGF hay KSP siRNA tế bào Hep3B Các trình tự siRNA ban đầu chuyển vào tế bào Hep3B Mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP sau 72 đánh giá phương pháp real-time qRT-PCR Hình 3.6 Ảnh hưởng siRNA khác lên biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA VEGF (a) mRNA KSP (b) tế bào sau chuyển siRNA xác định phương pháp real-time qRT-PCR Gen β-actin sử dụng làm chứng nội chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng) Theo Hình 3.6, siRNA làm giảm mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào Hep3B so sánh với đối chứng (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.6) Ngoài ra, kết cho thấy khác biệt mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào đối chứng tế bào chuyển CONT-siRNA (p > 0,05; Hình 3.6) Trong số siRNA, VEGF- siRNA#1 KSP-siRNA#2 ức chế biểu VEGF KSP hiệu Do vậy, trình tự siRNA lựa chọn cho nghiên cứu với tên gọi VEGF-siRNA KSP-siRNA Hình 3.7 Ảnh hưởng siRNA lên biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào Hep3B theo thời gian Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA VEGF (a) mRNA KSP (b) tế bào thời điểm xác định phương pháp real-time qRT-PCR Gen β-actin sử dụng làm chứng nội chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng) Hình 3.8 Ảnh hưởng siRNA lên biểu protein VEGF protein KSP tế bào Hep3B theo thời gian Mức độ biểu protein VEGF protein KSP tế bào thời điểm sau chuyển siRNA xác định phương pháp Western blot (a) Đồ thị biểu diễn kết bán định lượng protein VEGF protein KSP tế bào xác định phần mềm Image J (b, c) β-actin sử dụng làm chứng nội dùng để chuẩn hóa kết Đồ thị biểu diễn kết định lượng protein tiết VEGF xác định phương pháp ELISA (d) Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng) Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá hiệu ức chế biểu gen đích theo thời gian siRNA lựa chọn Thời gian khảo sát dựa kết đánh giá hiệu chuyển siRNA vào tế bào Hep3B theo thời gian (24-72 giờ) Đối với gen VEGF, kết phân tích real-time qRT-PCR cho thấy mức độ biểu mRNAVEGF tế bào giảm mạnh thời điểm 48 72 sau chuyển VEGF-siRNA so với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.7) Trong đó, mức độ biểu mRNAVEGF thay đổi không đáng kể tế bào chuyển CONT-siRNA sau 72 (p > 0,05; Hình 3.7) Ảnh hưởng ức chế VEGF-siRNA lên biểu protein VEGF tế bào cho kết tương tự xác định phương pháp Western blot ELISA (p < 0,01; Hình 3.8) Tương tự với gen KSP, mức độ biểu mRNA KSP tế bào bắt đầu thay đổi sau 24 giảm mạnh sau 48, 72 so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.7) Ảnh hưởng KSP-siRNA lên biểu protein KSP tế bào cho kết tương tự phân tích phương pháp Western blot (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.8) Như vậy, kết cho thấy hiệu ức chế biểu VEGF KSP tế bào Hep3B VEGF-siRNA KSP-siRNA tăng mạnh sau 48-72 chuyển siRNA 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng siRNA lên tế bào ung thư gan người 3.2.1 Hiệu ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP siRNA tế bào ung thư gan tế bào gan người Để làm rõ hiệu ức chế biểu gen mục tiêu siRNA, nghiên cứu đánh giá hiệu ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP dòng tế bào UTG khác gồm Hep3B, HepG2, Huh-7 dòng tế bào gan THLE-3 Sự thay đổi biểu gen đích xác định mức độ mRNA protein sau 72 chuyển siRNA Theo Hình 3.9, so sánh với đối chứng, mức độ biểu mRNA VEGF tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển VEGF-siRNA 24,68 ± 3,03%; 54,99 ± 1,94% 20,29 ± 1,35% (p < 0,01; Hình 3.9) Hiệu ức chế biểu protein VEGF VEGFsiRNA dòng tế bào UTG cho kết tương tự phân tích phương pháp Western blot (p < 0,01; Hình 3.10) ELISA (Hình 3.11) Tuy nhiên, hiệu ức chế biểu gen VEGF VEGF-siRNA tế bào HepG2 thấp so sánh với tế bào Hep3B Huh-7 Ngoài ra, hiệu ức chế biểu mRNA VEGF tế bào THLE-3 VEGFsiRNA gần không phát so sánh với đối chứng (p > 0,05; Hình 3.9) Nghiên cứu phát thấy điểm thú vị dòng tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển VEGFsiRNA Bên cạnh biểu VEGF bị ức chế VEGF-siRNA, biểu KSP bị ức chế phần VEGF-siRNA Tuy nhiên, tác động ức chế VEGF-siRNA lên biểu KSP không giống dòng tế bào UTG Khi so sánh với đối chứng, mức độ biểu mRNA KSP tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển VEGF-siRNA 59,34 ± 2,96%; 76,74 ± 4,37% 62,17 ± 2,65% (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.9) Mức độ ức chế biểu protein KSP dòng tế bào VEGF-siRNA cho kết tương tự phân tích phương pháp Western blot (Hình 3.10) ELISA (Hình 3.11) Tương tự, biểu gen KSP tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 bị ức chế mạnh KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.9 Hình 3.10) Trong đó, KSP-siRNA ức chế phần nhỏ biểu mRNA KSP tế bào THLE-3 Mức độ biểu mRNA KSP tế bào THLE3 sau chuyển KSP-siRNA 89,72 ± 2,01% (p > 0,05; Hình 3.9) Ngoài ra, kết kiểm tra mức độ mRNA protein VEGF cho thấy KSP-siRNA không ảnh hưởng tới biểu gen VEGF ba dòng tế bào UTG sử dụng nghiên cứu Bên cạnh đó, kết cho thấy hiệu ức chế đồng thời biểu gen đích cocktail siRNA tế bào UTG Mức độ biểu mRNA VEGF khác biệt cocktail siRNA VEGF-siRNA dòng tế bào (Hình 3.9) Kết phù hợp với kết định lượng protein VEGF phương pháp Western blot ELISA (Hình 3.10 Hình 3.11) Ngược lại, cocktail siRNA ức chế biểu KSP mạnh KSP-siRNA dòng tế bào Hep3B Huh-7 (p < 0,05; Hình 3.9 Hình 3.10) Tuy nhiên, kết không lặp lại dòng tế bào HepG2 (p > 0,05; Hình 3.9 Hình 3.10) Hình 3.9 Ảnh hưởng siRNA lên biểu mRNA VEGF mRNA KSP dòng tế bào gan khác Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA VEGF mRNA KSP tế bào Hep3B (a), HepG2 (b), Huh-7(c) THLE-3 (d) sau chuyển siRNA xác định phương pháp real-time qRT-PCR Gen β-actin sử dụng làm chứng nội dùng để chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) 10 3.12) Điều chứng tỏ giảm điều hòa biểu VEGF ức chế đáng kể tăng sinh tế bào Kết đạt tương tự với KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.12) Trong đó, giá trị OD tế bào chuyển cocktail siRNA thấp so sánh với giá trị OD tế bào chuyển VEGF-siRNA hay KSP-siRNA thời điểm 48 72 (p < 0,05; Hình 3.12) Điều cho thấy cocktail siRNA ức chế tăng sinh tế bào hiệu Tuy nhiên, kết có khác biệt lặp lại thí nghiệm tế bào HepG2 THLE-3 Với tế bào HepG2, KSP-siRNA ức chế tăng sinh tế bào thời điểm 48 72 sau so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.12) Ngược lại, hiệu ức chế tăng sinh tế bào VEGF-siRNA thấp quan sát thấy sau 72 chuyển siRNA (p < 0,05; Hình 3.12) Với tế bào THLE-3, VEGF-siRNA KSPsiRNA không ảnh hưởng tới tăng sinh tế bào gan (p > 0,05; Hình 3.12) Như vậy, việc chuyển đồng thời hay riêng biệt VEGF-siRNA KSP-siRNA ức chế tăng sinh tế bào UTG mức độ khác Trong đó, việc chuyển đồng thời siRNA có hiệu ức chế tăng sinh tế bào cao Tuy nhiên, siRNA không ảnh hưởng tới tăng sinh tế bào gan Kết đánh giá ảnh hưởng siRNA lên tăng sinh tế bào phù hợp với kết đánh giá hiệu ức chế biểu VEGF KSP dòng tế bào khác 3.2.3 Ảnh hưởng siRNA lên cảm ứng apoptosis tế bào ung thư gan tế bào gan Sự ức chế biểu gen đích siRNA làm giảm tăng sinh tế bào Sự ức chế tăng sinh tế bào liên quan tới cảm ứng apoptosis tế bào sau chuyển siRNA Do vậy, để đánh giá cảm ứng apoptosis siRNA dòng tế bào, tế bào nhuộm đồng thời với protein Annexin-V-FITC chất nhuộm nhân huỳnh quang PI Tỉ lệ tế bào apoptosis xác định kỹ thuật FACS hệ thống flow cytometry Kết nghiên cứu cho thấy hiệu ức chế biểu VEGF KSP siRNA tế bào Hep3B theo thời gian Do vậy, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng siRNA lên cảm ứng apoptosis tế bào Hep3B theo thời gian Kết cho thấy tỉ lệ apoptosis tế bào chuyển VEGF-siRNA bắt đầu thay đổi sau 24 giờ, tăng mạnh sau 48 (14,02 ± 1,97%) 72 (23,32 ± 2,36%) so sánh với đối chứng (4,15 ± 1,59%) (p < 0,01; Hình 3.13) Tương tự vậy, mức độ cảm ứng apoptosis tế bào Hep3B tăng dần theo thời gian sau chuyển KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.13) Như vậy, VEGF-siRNA KSP-siRNA cảm ứng apoptosis tế bào Hep3B tỉ lệ apoptosis tăng dần theo thời gian so sánh với đối chứng Kết phù hợp với kết đánh giá giảm điều hòa biểu VEGF KSP tế bào Hep3B siRNA theo thời gian Hình 3.13 Ảnh hưởng siRNA lên cảm ứng apoptosis tế bào Hep3B theo thời gian Đồ thị biểu diễn tỉ lệ apoptosis tế bào Hep3B sau chuyển VEGF-siRNA (a) hay KSP-siRNA (b) thời điểm khác Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với đối chứng) 13 Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá cảm ứng apoptosis chuyển đồng thời hay riêng biệt siRNA tế bào UTG tế bào gan Kết phân tích FACS cho thấy siRNA làm tăng tỉ lệ apoptosis tế bào Hep3B (21,89 ± 1,50% với VEGF-siRNA; 17,66 ± 2,53% với KSP-siRNA 30,87 ± 1,65% với cocktail siRNA) so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.14) Trong đó, cocktail siRNA làm tăng tỉ lệ apoptosis cao (p < 0,05; Hình 3.14) Kết đạt tương tự tế bào Huh-7 (p < 0,01; Hình 3.14) Tuy nhiên, với tế bào HepG2, VEGF-siRNA làm tăng tỉ lệ tế bào apoptosis (10,91 ± 0,75%) thấp so với KSP-siRNA (20,57 ± 0,89%) cocktail siRNA (19,30 ± 2,23%), tỉ lệ cao so sánh với đối chứng (p < 0,05 p < 0,01; Hình 3.14) Kết cho thấy khác biệt tỉ lệ apoptosis tế bào HepG2 tế bào chuyển KSP-siRNA cocktail siRNA (p > 0,05; Hình 3.14) Ngược lại, siRNA không ảnh hưởng đến cảm ứng apoptosis tế bào gan THLE-3 (p > 0,05; Hình 3.14) Hình 3.14 Ảnh hưởng siRNA lên cảm ứng apoptosis dòng tế bào khác Đồ thị biểu diễn tỉ lệ apoptosis tế bào Hep3B, HepG2, Huh-7 THLE-3 sau chuyển siRNA Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng, #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) Như vậy, giảm điều hòa biểu đồng thời hay riêng biệt gen đích siRNA cảm ứng apoptosis tế bào UTG Hơn nữa, mức độ cảm ứng apoptosis việc ức chế đồng thời biểu VEGF KSP tế bào UTG cao so với ức chế riêng biệt gen Tuy nhiên, ảnh hưởng có khác biệt dòng tế bào Các kết phù hợp với kết đánh giá ảnh hưởng siRNA lên tăng sinh tế bào UTG tế bào gan 3.2.4 Sự thay đổi biểu nhân tố ảnh hưởng đến tăng sinh cảm ứng apoptosis tế bào sau chuyển siRNA Ở cấp độ tế bào, ức chế biểu gen VEGF KSP ảnh hưởng mạnh tới tăng sinh cảm ứng apoptosis tế bào UTG Ở cấp độ phân tử, siRNA ảnh hưởng tới biểu số nhân tố kiểm soát trình apoptosis – tăng sinh tế bào Vì vậy, nghiên cứu đánh giá thay đổi biểu số gen ảnh hưởng tới trình apoptosis tế bào, bao gồm gen kháng apoptosis (BCL-2, Survivin) gen cảm ứng apoptosis (Caspase-3, Caspase-7) Sự thay đổi biểu gen tế bào Hep3B sau 72 chuyển siRNA đánh giá mức độ mRNA protein Kết nghiên cứu cho thấy mức độ biểu mRNA BCL-2 mRNA Survivin tế bào Hep3B xử lý với VEGF-siRNA, KSP-siRNA cocktail siRNA 52,43 ± 2,21%; 56,22 ± 4,16%; 39,26 ± 5,20% (với mRNA BCL-2) 42,36 ± 4,05%; 53,25 ± 5,03%; 29,88 ± 4,26% (với mRNA Survivin) Điều chứng tỏ siRNA ức chế biểu mRNA BCL-2 mRNA Survivin tế bào Hep3B so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.15) Trong đó, cocktail siRNA cho hiệu ức chế biểu cao Tuy nhiên, khác biệt 14 mức độ biểu mRNA BCL-2 Survivin CONT-siRNA đối chứng (p > 0,05; Hình 3.15) Kết lặp lại tương tự kiểm tra mức độ biểu protein BCL-2 protein Survivin tế bào Hep3B phương pháp Western blot (Hình 3.15) Hình 3.15 Ảnh hưởng siRNA lên biểu BCL-2 Survivin tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA BCL-2 (a) mRNA Survivin (b) tế bào xác định phương pháp real-time qRT-PCR Sự biểu protein xác định phương pháp Western blot (c) Đồ thị biểu diễn kết bán định lượng protein BCL-2 (d) protein Survivin (e) phần mềm Image J Gen β-actin sử dụng làm chứng nội chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với đối chứng #p < 0,05 ##p < 0,01 so sánh với cocktail siRNA) Bên cạnh đó, biểu gen cảm ứng apoptosis Caspase-3/-7 kiểm tra theo sau giảm biểu VEGF KSP tế bào Hep3B Kết cho thấy so sánh với đối chứng, mức độ biểu mRNA tế bào xử lý với VEGF-siRNA, KSP-siRNA cocktail siRNA cao gấp 1,71 ± 0,08 lần; 1,55 ± 0,13 lần; 1,99 ± 0,07 lần Caspase-3 1,34 ± 0,07 lần; 1,41 ± 0,09 lần; 1,66 ± 0,07 lần Caspase-7 Điều chứng tỏ siRNA làm tăng mức độ biểu mRNA Caspase-3/-7 tế bào Hep3B Trong đó, cocktail siRNA làm tăng biểu mRNA Caspase-3/-7 cao (p < 0,05 p < 0,01; Hình 3.16) Ngoài ra, thay đổi protein Caspase-3/-7 cho kết tương tự kiểm tra hoạt tính tương đối Caspase-3/-7 tế bào Hep3B (p < 0,05; Hình 3.16) Tuy nhiên, khác biệt hoạt tính Caspase-3/-7 tế bào chuyển cocktail siRNA tế bào chuyển VEGFsiRNA hay KSP-siRNA (p > 0,05; Hình 3.16) 15 Hình 3.16 Ảnh hưởng siRNA biểu Caspase-3/-7 tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA Caspase-3 (a) mRNA Caspase-7 (b) tế bào xác định phương pháp real-time qRT-PCR Đồ thị biểu diễn kết định lượng hoạt tính tương đối protein Caspase-3/-7 tế bào xác định phương pháp đo cường độ quang (c) Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng, #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) Như vậy, ức chế biểu VEGF hay KSP làm tăng mức độ biểu Caspase-3 Caspase-7 Đây yếu tố dẫn tới làm tăng tỉ lệ apoptosis gây chết tế bào Hep3B sau chuyển siRNA 3.2.5 Ảnh hưởng siRNA lên số đặc tính khác tế bào ung thư gan người 3.2.5.1 Ảnh hưởng siRNA lên khả sống tế bào ung thư gan người Bên cạnh hiệu ức chế tăng sinh cảm ứng apoptosis tế bào UTG siRNA, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng siRNA lên số đặc tính sinh học khác tế bào ung thư khả sống, khả di cư, di khả kích thích tế bào nội mô tạo mạch Hiệu ức chế khả sống tế bào sau chuyển siRNA kiểm tra thử nghiệm hình thành bào lạc từ tế bào đơn nuôi cấy mật độ thấp So với đối chứng, khả hình thành bào lạc tế bào UTG giảm đáng kể ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP (p < 0,05 p < 0,01, Hình 3.17) Tuy nhiên, số lượng bào lạc hình thành từ tế bào ức chế đồng thời VEGF KSP thấp so với tế bào ức chế riêng biệt gen quan sát thấy tế bào Hep3B Huh-7 (p < 0,05; Hình 3.17) Như vậy, hiệu ức chế khả sống tế bào tương đồng với hiệu ức chế biểu gen mục tiêu ức chế tăng sinh tế bào siRNA tế bào UTG Hình 3.17 Ảnh hưởng siRNA lên hình thành bào lạc dòng tế bào UTG Biểu đồ biểu diễn số lượng bào lạc hình thành từ tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển siRNA xác định phương pháp pha loãng tới hạn Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng, #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) 16 3.2.5.2 Ảnh hưởng siRNA lên khả di cư, di in vitro tế bào ung thư gan Khả di cư, di đặc tính sinh học đặc trưng tế bào ung thư Đặc tính phụ thuộc vào yếu tố khả sống tăng sinh tế bào, tương tác tế bào với tế bào tế bào với môi trường ngoại bào… Do vậy, ức chế khả sống tăng sinh tế bào siRNA ảnh hưởng tới di cư, di tế bào UTG Sự di tế bào UTG sau chuyển siRNA đánh giá thông qua thử nghiệm di in vitro mô hình đĩa nuôi cấy có hai khoang ngăn cách cấu trúc màng nhân tạo (transwell plate) Theo Hình 3.18, dòng tế bào Hep3B Huh-7 chuyển đồng thời hay riêng biệt siRNA có số lượng tế bào di thấp so với tế bào đối chứng (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.18) Trong đó, số lượng tế bào di thấp nhóm tế bào chuyển đồng thời VEGFsiRNA KSP-siRNA Kết chứng tỏ việc ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP làm giảm khả di in vitro tế bào Hep3B Huh-7 Tuy nhiên, kết không lặp lại thử nghiệm dòng tế bào HepG2 Kết cho thấy KSP-siRNA làm giảm di in vitro tế bào HepG2 so sánh với đối chứng (p < 0,05; Hình 3.18) Điều làm rõ so sánh số lượng tế bào HepG2 di nhóm tế bào xử lý với cocktail siRNA KSP-siRNA Ngoài ra, CONT-siRNA không ảnh hưởng tới số lượng tế bào di ba dòng tế bào UTG Hình 3.18 Ảnh hưởng siRNA lên di in vitro tế bào UTG Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào di tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển siRNA xác định phương pháp đếm số lượng tế bào Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng, #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) Bên cạnh việc đánh giá di in vitro tế bào, nghiên cứu đánh giá di cư in vitro tế bào sau chuyển siRNA dựa mô hình liền hóa vết rạch Mức độ di cư tế bào xác định thông qua khoảng cách di chuyển tế bào từ vị trí biên đến vị trị trung tâm vết rạch Theo Hình 3.19, với thử nghiệm tế bào Hep3B, khoảng cách di chuyển tế bào chuyển VEGF-siRNA, KSP-siRNA hay cocktail siRNA sau 48 72 ngắn so với đối chứng tế bào chuyển CONT-siRNA Trong đó, tế bào xử lý với cocktail siRNA có khoảng cách di chuyển thấp (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.19) Kết chứng tỏ siRNA ức chế di cư tế bào Hep3B sau 48-72 Hơn nữa, cocktail siRNA làm giảm khả di cư tế bào cao so sánh với VEGF-siRNA hay KSP-siRNA Tương tự vậy, kết lặp lại thử nghiêm dòng tế bào Huh-7 Tuy nhiên, có khác biệt lặp lại thí nghiệm dòng tế bào HepG2 KSP-siRNA cocktail siRNA có ảnh hưởng định lên di cư tế bào sau 48-72 Ngược lại, ảnh hưởng VEGF-siRNA lên di cư tế bào HepG2 quan sát thấy sau 72 (p < 0,05; Hình 3.19) Ngoài ra, kết cho thấy khác biệt mức độ ức chế khả di cư tế bào HepG2 KSP-siRNA cocktail siRNA 17 Hình 3.19 Ảnh hưởng siRNA lên di cư in vitro dòng tế bào UTG Đồ thị biểu diễn khoảng cách di cư tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau chuyển siRNA xác định phương pháp đo khoảng cách di chuyển tương đối tế bào Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng, ##p < 0,01 #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA) Như vậy, siRNA có ảnh hưởng tới di cư di in vitro tế bào, ảnh hưởng có khác biệt dòng tế bào UTG Kết đánh giá ảnh hưởng siRNA lên đặc tính di cư di in vitro tế bào phù hợp với kết đánh giá hiệu ức chế biểu gen đích dòng tế bào UTG 3.2.5.3 Ảnh hưởng siRNA lên hình thành mạch in vitro tế bào nội mô HUVEC Khả kích thích tế bào nội mô hình thành mạch đặc tính sinh học tế bào ung thư, đặc biệt tế bào biểu mạnh VEGF tế bào UTG Do vậy, nghiên cứu tiến hành cảm ứng tế bào nội mô HUVEC với môi trường nuôi cấy tế bào Hep3B xử lý với siRNA Hiệu kích thích tế bào nội mô hình thành mạch đánh giá thông qua số lượng điểm nhánh (ngã ba) hình thành tế bào nội mô nuôi cấy môi trường bán rắn Kết nghiên cứu cho thấy so sánh với đối chứng, hình thành cấu trúc mạch in vitro tế bào nội mô HUVEC gel matrix giảm tế bào nuôi cấy dịch nuôi cấy từ tế bào Hep3B xử lý với VEGF-siRNA cocktail siRNA (p < 0,05; Hình 3.20) Tuy nhiên, hiệu ức khác biệt cocktail siRNA VEGF-siRNA (p > 0,05; Hình 3.20) Ngược lại, khả hình thành mạch tế bào HUVEC cảm ứng dịch nuôi cấy từ tế bào Hep3B xử lý với KSP-siRNA hay CONT-siRNA tương đương với đối chứng (p > 0,05; Hình 3.20) Điều chứng tỏ có VEGF-siRNA ức chế khả hình thành mạch tế bào HUVEC thông qua ức chế biểu gen VEGF giảm lượng VEGF tiết môi trường nuôi cấy Ngược lại, KSP-siRNA không ảnh hưởng tới tạo mạch tế bào HUVEC 18 Hình 3.20 Sự ức chế hình thành cấu trúc mạch siRNA phát mô hình tế bào nội mô HUVEC Đồ thị biểu diễn số lượng điểm nhánh (ngã ba) ghi nhận nghiệm thức Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm *p < 0,05 so sánh với đối chứng Để làm rõ tác động VEGF tiết từ tế bào Hep3B ảnh hưởng lên hình thành mạch tế bào HUVEC, biểu protein thụ thể VEGF (VEGFR2) kiểm tra tế bào UTG tế bào HUVEC Ngoài ra, biểu ANG2 tế bào HUVEC đánh giá hai mức độ mRNA protein Kết phân tích Western lot cho thấy tế bào UTG tế bào HUVEC biểu VEGFR2 (Hình 3.21) Điều chứng tỏ VEGF tiết tế bào UTG tác động lên tế bào nội mô tế bào UTG thông qua tương tác VEGF VEGFR2 Hình 3.21 Sự biểu protein VEGFR2 dòng tế bào ảnh hưởng siRNA lên biểu ANG2 tế bào HUVEC Sự biểu protein VEGFR2 ANG2 xác định phương pháp Western blot (a, c) Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA ANG2 xác định phương pháp real-time qRT-PCR (b) Đồ thị biểu diễn kết bán định lượng protein ANG2 phần mềm Image J (d) Gen β-actin sử dụng làm chứng nội dùng để chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm **p < 0,01 so sánh với đối chứng) 19 Ngoài ra, VEGF-siRNA hay cocktail siRNA ức chế biểu ANG2 tế bào HUVEC Cụ thể, mức độ biểu ANG2 tế bào HUVEC nuôi cấy môi trường thông thường VEGF (đối chứng âm) thấp so với nuôi cấy dịch nuôi cấy tế bào Hep3B đối chứng Trong đó, nuôi cấy với dịch môi trường tế bào chuyển VEGFsiRNA, mức độ biểu ANG2 tế bào giảm đáng kể so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.21) Kết đạt tương tự nuôi cấy tế bào HUVEC với dịch nuôi cấy tế bào Hep3B xử lý với cocktail siRNA Ngược lại, dịch nuôi cấy tế bào Hep3B xử lý với KSP-siRNA hay CONT-siRNA không ảnh hưởng tới biểu ANG2 tế bào HUVEC (p > 0,05; Hình 3.21) Như vậy, VEGF-siRNA hay cocktail siRNA ức chế biểu ANG2 tế bào HUVEC thông qua việc tác động lên protein tiết VEGF tế bào UTG, dẫn tới ức chế hình thành cấu trúc mạch tế bào nội mô 3.3 Kết đánh giá hiệu ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan người in vitro phối hợp siRNA với Doxorubicin 3.3.1 Mức độ đáp ứng thuốc tế bào ung thư gan với Doxorubicin Để đánh giá mức độ đáp ứng thuốc tế bào, tế bào UTG xử lý với Doxorubicin nồng độ khác (0, 1, µg/ml) theo thời gian (5 ngày) Mức độ đáp ứng thuốc tế bào đánh giá thông qua ức chế tăng sinh tế bào Doxorubicin phương pháp WST-1 Theo Hình 3.22, Doxorubicin không ảnh hưởng tới tăng sinh tế bào UTG tế bào xử lý với thuốc nồng độ thấp (1 µg/ml) thời gian ngắn (1-2 ngày) Tuy nhiên, nồng độ cao (4 µg/ml), ức chế tăng sinh tế bào Doxorubicin quan sát thấy sau 1-2 ngày Mức độ ức chế tăng sinh tế bào tăng dần tăng thời gian xử lý với thuốc (3-5 ngày) Điều chứng tỏ hiệu ức chế tăng sinh tế bào UTG Doxorubicin phụ thuộc vào nồng độ thời gian xử lý (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.22) Ngoài ra, kết cho thấy Doxorubicin ức chế tăng sinh tế bào Huh-7 hiệu so với tế bào HepG2 Hep3B Hình 3.22 Ảnh hưởng Doxorubicin lên khả tăng sinh tế bào UTG Đồ thị biểu diễn tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 xử lý với Doxorubicin nồng độ khác theo thời gian xác định phương pháp WST-1 Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng) Như vậy, mức độ đáp ứng thuốc tế bào UTG với Doxorubicin phụ thuộc vào nồng độ thời gian xử lý thuốc Ngoài ra, mức độ đáp ứng với thuốc có khác biệt tế vào UTG Trong đó, tế bào HepG2 Hep3B có mức độ đáp ứng với thuốc so với tế bào Huh-7 3.3.2 Ảnh hưởng siRNA lên đáp ứng thuốc tế bào Hep3B với Doxorubicin Dựa kết đánh giá hiệu ức chế biểu VEGF KSP siRNA mức độ đáp ứng thuốc dòng tế bào UTG, nghiên cứu tiếp tục sử dụng mô hình tế bào Hep3B để tìm hiểu sơ ảnh hưởng VEGF-siRNA hay KSP-siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc tế bào UTG với Doxorubicin Tế bào Hep3B sau chuyển VEGF-siRNA hay KSP-siRNA xử lý với Doxorubicin nồng độ khác theo thời gian 20 Hình 3.23 Ảnh hưởng siRNA Doxorubicin lên khả tăng sinh tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào Hep3B xử lý với KSP-siRNA kết hợp với Doxorubicin (a) hay VEGF-siRNA kết hợp với Doxorubicin (b) nồng độ khác theo thời gian xác định phương pháp WST-1 Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng) Kết cho thấy Doxorubicin ức chế tăng sinh tế bào xử lý kết hợp với KSPsiRNA Theo Hình 3.23, sau ngày xử lý với thuốc, KSP-siRNA kết hợp với µg/ml Doxorubicin làm tăng tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào so sánh với KSP-siRNA hay Doxorubicin (p < 0,01; Hình 3.23) Tuy nhiên, ức chế tăng sinh tế bào khác biệt tế bào xử lý với CONT-siRNA bổ sung µg/ml Doxorubicin tế bào xử lý với Doxorubicin (p > 0,05; Hình 3.23) Để xác định rõ hiệu làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào với Doxorubicin KSP-siRNA, tế bào xử lý với Doxorubicin nồng độ cao (2 µg/ml) Sau ngày, với nhóm tế bào xử lý với KSP-siRNA bổ sung µg/ml hay µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào 82,64 ± 2,87% 90,91 ± 3,98% Với nhóm tế bào xử lý với CONT-siRNA bổ sung µg/ml hay µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào thấp 29,75 ± 2,57% 56,20 ± 3,47% Trong đó, nhóm tế bào xử lý với µg/ml hay µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào tương đương nhóm xử lý CONT-siRNA (Hình 3.23) Kết đạt tương tự kết hợp VEGF-siRNA với Doxorubicin Như vậy, siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B với Doxorubicin, chí tế bào xử lý với thuốc nồng độ thấp Hơn nữa, phối hợp siRNA Doxorubicin cho thấy hiệu ức chế tăng sinh tế bào tốt so với việc sử dụng Doxorubicin 3.3.3 Ảnh hưởng siRNA lên đáp ứng thuốc tế bào ung thư gan với Doxorubicin Các siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B Việc ức chế đồng thời biểu gen đích có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào cao so với việc ức chế riêng biệt gen hay không? Do vậy, tế bào sau chuyển siRNA xử lý với Doxorubicin (1 µg/ml) Việc ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP ảnh hưởng lên mức độ đáp ứng thuốc tế bào kiểm tra so sánh thông qua ức chế tế bào tăng sinh 21 Hình 3.24 Ảnh hưởng siRNA Doxorubicin lên khả tăng sinh tế bào UTG Đồ thị biểu diễn tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào Hep3B, HepG2 Huh-7 sau xử lý riêng biệt hay kết hợp siRNA với Doxorubicin theo thời gian xác định phương pháp WST-1 Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng; #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox) Kết cho thấy Doxorubicin kết hợp với siRNA làm giảm đáng kể khả tăng sinh tế bào Hep3B Huh-7 so sánh với đối chứng (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.24) Trong đó, Doxorubicin đạt hiệu ức chế tăng sinh mạnh tế bào Hep3B Huh-7 xử lý với cocktail siRNA Tác động quan sát thấy rõ sau 2-5 ngày xử lý với thuốc Tuy nhiên, kết tương tự không lặp lại thử nghiệm dòng tế bào HepG2 Kết cho thấy so sánh với đối chứng, Doxorubicin ức chế mạnh tăng sinh tế bào HepG2 phối hợp với KSPsiRNA cocktail siRNA (p < 0,01; Hình 3.24) Ngoài ra, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào HepG2 khác biệt so sánh Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA Doxorubicin kết hợp với KSP-siRNA (p > 0,05; Hình 3.24) Như vậy, siRNA làm tăng đáng kể mức độ đáp ứng thuốc dòng tế bào UTG với Doxorubicin Trong đó, Doxorubicin phối hợp với cocktail siRNA cho hiệu ức chế cao Tuy nhiên, ảnh hưởng có khác biệt dòng tế bào UTG 3.3.4 Sự thay đổi biểu nhân tố ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc tế bào ung thư gan Các siRNA làm tăng hiệu ức chế tăng sinh tế bào Doxorubicin Tác động liên quan tới trình apoptosis tế bào Do vậy, nghiên cứu kiểm tra thay đổi biểu gen kiểm soát trình apoptosis tế bào sau xử lý với siRNA Doxorubicin 3.3.4.1 Sự điều hòa biểu nhân tố kháng apoptosis Để đánh giá siRNA có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B với Doxorubicin thông qua việc điều hòa biểu BCL-2 Survivin hay không, tế bào sau chuyển siRNA xử lý với Doxorubicin Sự biểu gen xác định mức độ mRNA protein Kết nghiên cứu cho thấy Doxorubicin làm giảm nhẹ mức độ biểu BCL-2 so sánh với đối chứng (p < 0,05; Hình 3.25) Mức độ biểu BCL-2 giảm mạnh phối hợp Doxorubicin với VEGF-siRNA hay KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.25) Trong đó, Doxorubicin kết 22 hợp VEGF-siRNA ức chế biểu BCL-2 mạnh so với VEGF-siRNA Kết đạt tương tự kết hợp Doxorubicin với KSP-siRNA Ngoài ra, Doxorubicin kết hợp cocktail siRNA ức chế biểu BCL-2 cao so sánh với Doxorubicin kết hợp VEGF-siRNA hay KSP-siRNA Tuy nhiên, mức độ giảm biểu BCL-2 khác biệt nhóm tế bào xử lý với cocktail siRNA có kết hợp với Doxorubicin (p > 0,05; Hình 3.25) Hình 3.25 Ảnh hưởng siRNA Doxorubicin lên biểu BCL-2 Survivin tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA BCL-2 (a) mRNA Survivin (b) tế bào xác định phương pháp real-time qRT-PCR Sự biểu protein xác định phương pháp Western blot (c) Đồ thị biểu diễn kết bán định lượng protein BCL-2 (d) protein Survivin (e) phần mềm Image J Gen β-actin sử dụng làm chứng nội chuẩn hóa kết Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng hay Dox; ##p < 0,01 #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; ++p < 0,01 +p < 0,05 so sánh với tế bào xử lý với siRNA tương ứng) Trái ngược với BCL-2, Doxorubicin làm tăng nhẹ mức độ biểu Survivin so sánh với đối chứng Ngược lại, mức độ biểu Survivin giảm phối hợp Doxorubicin với VEGFsiRNA (p < 0,01 p < 0,05; Hình 3.25) Kết đạt tương tự với nhóm tế bào xử lý với Doxorubicin phối hợp với KSP-siRNA Hơn nữa, so sánh với cocktail siRNA nhóm lại, Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA ức chế Survivin mạnh (p < 0,05; Hình 3.25) 23 Như vậy, ức chế biểu BCL-2 Survivin siRNA yếu tố góp phần làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B với Doxorubicin 3.3.4.2 Sự điều hòa biểu nhân tố cảm ứng apoptosis Để đánh giá có hay không siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B thông qua việc hoạt hóa đường Caspase, dẫn tới cảm ứng trình apoptosis, biểu Caspase-3 Caspase-7 kiểm tra tế bào sau xử lý với siRNA Doxorubicin Hình 3.26 Ảnh hưởng siRNA Doxorubicin lên biểu Caspase-3 Caspase-7 tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn mức độ biểu mRNA Caspase-3 (a) mRNA Caspase-7 (b) tế bào xác định phương pháp real-time qRT-PCR Đồ thị biểu diễn kết định lượng hoạt tính tương đối protein Caspase-3/-7 tế bào xác định phương pháp đo cường độ quang (c) Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 *p < 0,05 so sánh với đối chứng hay Dox; #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; +p < 0,05 so sánh với tế bào xử lý với siRNA tương ứng) Theo Hình 3.26, Doxorubicin không ảnh hưởng đến mức độ biểu Caspase-3 Caspase-7 tế bào Hep3B so sánh với đối chứng (p > 0,05; Hình 3.26) Ngược lại, mức độ biểu mRNA Caspase-3 Caspase-7 tăng lên phối hợp Doxorubicin với siRNA Khi so sánh với đối chứng, mức độ biểu mRNA Caspase-3 mRNA Caspase-7 cao gấp 1,94 ± 0,11 lần 1,58 ± 0,09 lần Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA; 1,76 ± 0,10 lần 1,46 ± 0,12 lần Doxorubicin kết hợp với KSP-siRNA; 2,25 ± 0,09 lần 1,71 ± 0,05 lần Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA P < 0,01 p < 0,05; Hình 3.26) Kết đạt tương tự kiểm tra mức độ biểu protein Caspase-3/-7 thông qua hoạt tính tương đối Caspase3/-7 Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA hay cocktail siRNA làm tăng hoạt tính tương đối Caspase-3/-7 cao so với VEGF-siRNA hay cocktail siRNA (p < 0,05; Hình 3.26) Các kết chứng tỏ ức chế biểu VEGF KSP làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào với Doxorubicin thông qua việc hoạt hóa gen Caspase-3 Caspase-7 Đây yếu tố góp phần làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào 3.3.4.3 Sự cảm ứng apoptosis tế bào Sự ức chế biểu gen đích làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào thông qua ức chế biểu gen kháng apoptosis, đồng thời tăng điều hòa biểu gen cảm ứng apoptosis Sự thay đổi biểu gen ảnh hưởng tới cảm ứng apoptosis tế bào Do vậy, để đánh giá siRNA có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào Hep3B với Doxorubicin thông qua việc thúc đẩy trình apoptosis hay không, tế bào sau xử lý nhuộm đồng thời với Annexin V-FITC PI Tỉ lệ tế bào apoptosis xác định kỹ thuật FACS Theo Hình 3.27, so với đối chứng, Doxorubicin không ảnh hưởng tới cảm ứng apoptosis tế bào Tuy nhiên, Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA làm tăng tỉ lệ tế bào apoptosis so 24 sánh với VEGF-siRNA Doxorubicin (p < 0,01; Hình 3.27) Tương tự, Doxorubicin kết hợp với KSP-siRNA có tỉ lệ tế bào apoptosis cao so sánh với KSP-siRNA Doxorubicin (p < 0,01; Hình 3.27) Ngoài ra, Doxorubicin phối hợp với cocktail siRNA cảm ứng apoptosis hiệu Tuy nhiên, kết không lặp lại phối hợp CONT-siRNA với Doxorubicin Hình 3.27 Ảnh hưởng siRNA Doxorubicin lên cảm ứng apoptosis tế bào Hep3B Đồ thị biểu diễn tỉ lệ apoptosis tế bào xử lý với siRNA Doxorubicin Kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 so sánh với đối chứng hay Dox; #p < 0,05 so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; ++p < 0,01 so sánh với tế bào xử lý với siRNA tương ứng) Như vậy, việc ức chế riêng biệt hay đồng thời biểu VEGF KSP siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào thông qua việc gia tăng tỉ lệ tế bào cảm ứng apoptosis KẾT LUẬN Với kết đạt được, nghiên cứu đưa kết luận tương ứng với nội dung nghiên cứu: Với nồng độ (25 nM) thời gian chuyển siRNA (24-72 giờ) tối ưu, trình tự siRNA ức chế thành công biểu gen VEGF KSP tế bào UTG Trong đó, trình tự VEGFsiRNA#1 KSP-siRNA#2 ức chế biểu gen đích hiệu VEGF-siRNA ức chế biểu VEGF, đồng thời ức chế phần biểu KSP Ngược lại, KSP-siRNA ức chế biểu KSP ba dòng tế bào UTG Ngoài ra, việc chuyển đồng thời VEGF-siRNA KSP-siRNA cho hiệu ức chế biểu KSP cao Tuy nhiên, hiệu khác biệt dòng tế bào UTG Việc ức chế đồng thời hay riêng biệt biểu VEGF KSP siRNA làm giảm khả sống, tăng sinh, di cư cảm ứng apoptosis tế bào UTG Hơn nữa, giảm điều hòa biểu đồng thời VEGF KSP cho hiệu tác động cao nhất, tác động có khác biệt dòng tế bào Ngược lại, siRNA không ảnh hưởng tới tế bào gan THLE-3 Ngoài ra, giảm điều hòa biểu VEGF tế bào Hep3B dẫn đến ức chế biểu ANG2 hình thành mạch in vitro tế bào nội mô HUVEC cảm ứng với dịch nuôi cấy tế bào Hep3B Các siRNA ức chế tăng sinh cảm ứng apoptosis tế bào UTG thông qua giảm điều hòa biểu số nhân tố kháng apoptosis BCL-2, Survivin hoạt hóa nhân tố cảm ứng apoptosis Caspase-3 Caspase -7 Mức độ đáp ứng thuốc dòng tế bào UTG với Doxorubicin khác phụ thuộc vào nồng độ thời gian xử lý thuốc Mức độ đáp ứng thuốc tế bào UTG tăng mạnh xử lý 25 với VEGF-siRNA hay KSP-siRNA Hơn nữa, việc ức chế đồng thời biểu VEGF KSP làm tăng đáng kể mức độ đáp ứng với thuốc tế bào Hep3B Huh-7 so với việc ức chế riêng biệt gen Ngoài ra, kết hợp siRNA Doxorubicin làm tăng hiệu tiêu diệt tế bào UTG in vitro so sánh với phương pháp riêng biệt Sự gia tăng mức độ đáp ứng thuốc tế bào siRNA thông qua ức chế gen kháng apoptosis BCL-2, Survivin hoạt hóa gen cảm ứng apoptosis Caspase-3, Caspase-7, dẫn tới gia tăng mức độ cảm ứng apoptosis Đây đường phân tử quan trọng làm tăng độ nhạy với thuốc tế bào UTG Ở phạm vi nước, đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật siRNA ức chế biểu gen mục tiêu VEGF KSP dòng tế bào UTG người Ngoài ra, phạm vi giới, nghiên cứu đạt số kết so sánh với nghiên cứu trước (các công trình nghiên cứu tham khảo đến thời điểm tháng 9/2015), bao gồm: Hiệu ức chế biểu gen đích siRNA có khác biệt dòng tế bào UTG Việc ức chế đồng thời biểu VEGF KSP cho hiệu tốt so với viêc ức chế riêng biệt gen Hiệu kiểm tra mức độ tế bào (thông qua ảnh hưởng siRNA lên khả tăng sinh, di cư, di cảm ứng apoptosis tế bào UTG) mức độ phân tử (thông qua ảnh hưởng siRNA lên thay đổi biểu nhân tố kháng apoptosis BCL-2, Survivin nhân tố cảm ứng apoptosis Caspase 3/7) VEGF-siRNA ức chế biểu VEGF, đồng thời ức chế phần biểu hiên KSP Do vậy, VEGF nhân tố điều hòa gen KSP Các siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc (độ nhạy với thuốc) dòng tế bào UTG với Doxorubicin Trong đó, việc phối hợp hai trình tự VEGF-siRNA KSP-siRNA (được gọi cocktail siRNA) cho hiệu tác động tốt 26 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN TỚI ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Doan Chinh Chung, Le Thanh Long, Hoang Nghia Son, Do Minh Si, Le Van Dong (2014) Simultaneous silencing of VEGF and KSP by siRNA cocktail inhibits proliferation and induces apoptosis of hepatocellular carcinoma Hep3B cells Biological Research, 2014, 47: 70 Doan Chinh Chung, Le Thanh Long, Hoang Nghia Son, Le Tri Bao, Do Minh Si, Le Van Dong (2015) Downregulation of VEGF Enhances Chemosensitivity by Induction of Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Cells Cell Journal (Yakhteh), 2015, 17(2): 273-287 Chinh Chung Doan, Ngoc Trung Doan, Quang Huy Nguyen, Minh Hoa Nguyen, Minh Si Do, Van Dong Le (2015) Downregulation of Kinesin Spindle Protein Inhibits Proliferation, Induces Apoptosis and Increases Chemosensitivity in Hepatocellular Carcinoma Cells Iranian Biomedical Journal, 2015, 19(1): 1-16 27 [...]... gây chết tế bào Hep3B sau khi chuyển các siRNA 3.2.5 Ảnh hưởng của các siRNA lên một số đặc tính khác của các tế bào ung thư gan người 3.2.5.1 Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng sống của tế bào ung thư gan người Bên cạnh hiệu quả ức chế tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên các tế bào UTG bởi siRNA, nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên một số đặc tính sinh học khác của tế bào ung thư như... Ảnh hưởng của siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư gan và tế bào gan Sự ức chế biểu hiện gen đích bởi các siRNA làm giảm sự tăng sinh của tế bào Sự ức chế tăng sinh của tế bào có thể liên quan tới sự cảm ứng apoptosis của tế bào sau khi chuyển siRNA Do vậy, để đánh giá sự cảm ứng apoptosis của siRNA trên các dòng tế bào, tế bào được nhuộm đồng thời với protein Annexin-V-FITC và chất nhuộm... vitro của các tế bào ung thư gan Khả năng di cư, di căn là một trong những đặc tính sinh học đặc trưng của tế bào ung thư Đặc tính này phụ thuộc vào các yếu tố như khả năng sống và tăng sinh của tế bào, sự tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoại bào Do vậy, sự ức chế khả năng sống và tăng sinh của tế bào bởi siRNA có thể ảnh hưởng tới sự di cư, di căn của tế bào UTG Sự di... Western lot cho thấy các tế bào UTG và tế bào HUVEC đều biểu hiện VEGFR2 (Hình 3.21) Điều này chứng tỏ VEGF tiết ra bởi tế bào UTG có thể tác động lên tế bào nội mô và chính tế bào UTG thông qua tương tác giữa VEGF và VEGFR2 Hình 3.21 Sự biểu hiện protein VEGFR2 trên các dòng tế bào và ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện của ANG2 trên tế bào HUVEC Sự biểu hiện protein VEGFR2 và ANG2 được xác định... sánh số lượng tế bào HepG2 di căn giữa các nhóm tế bào được xử lý với cocktail siRNA và KSP -siRNA Ngoài ra, CONT -siRNA không ảnh hưởng tới số lượng tế bào di căn ở cả ba dòng tế bào UTG Hình 3.18 Ảnh hưởng của các siRNA lên sự di căn in vitro của các tế bào UTG Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào di căn của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển siRNA được xác định bằng phương pháp đếm số lượng tế bào. .. nhiên, số lượng bào lạc hình thành từ tế bào ức chế đồng thời VEGF và KSP thấp hơn so với tế bào ức chế riêng biệt mỗi gen chỉ quan sát thấy trên tế bào Hep3B và Huh-7 (p < 0,05; Hình 3.17) Như vậy, hiệu quả ức chế khả năng sống của tế bào tương đồng với hiệu quả ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu và ức chế tăng sinh tế bào bởi siRNA trên các tế bào UTG Hình 3.17 Ảnh hưởng của siRNA lên sự hình thành bào. .. của VEGF và KSP bởi các siRNA và mức độ đáp ứng thuốc của các dòng tế bào UTG, nghiên cứu tiếp tục sử dụng mô hình tế bào Hep3B để tìm hiểu sơ bộ ảnh hưởng của VEGF -siRNA hay KSP -siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc của tế bào UTG với Doxorubicin Tế bào Hep3B sau khi chuyển VEGF -siRNA hay KSP -siRNA được xử lý với Doxorubicin ở các nồng độ khác nhau theo thời gian 20 Hình 3.23 Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin... mức độ cảm ứng apoptosis Đây có thể là một trong những con đường phân tử quan trọng làm tăng độ nhạy với thuốc của tế bào UTG Ở phạm vi trong nước, đề tài là nghiên cứu đầu tiên sử dụng kỹ thuật siRNA ức chế sự biểu hiện của các gen mục tiêu VEGF và KSP trên các dòng tế bào UTG người Ngoài ra, trên phạm vi thế giới, nghiên cứu cũng đạt được một số kết quả mới khi so sánh với các nghiên cứu trước đây... của tế bào phù hợp với kết quả đánh giá hiệu quả ức chế sự biểu hiện của gen đích trên mỗi dòng tế bào UTG 3.2.5.3 Ảnh hưởng của siRNA lên sự hình thành mạch in vitro của tế bào nội mô HUVEC Khả năng kích thích các tế bào nội mô hình thành mạch cũng là một đặc tính sinh học cơ bản của tế bào ung thư, đặc biệt là các tế bào biểu hiện mạnh VEGF như tế bào UTG Do vậy, nghiên cứu tiến hành cảm ứng tế bào. .. với các nội dung nghiên cứu: 1 Với nồng độ (25 nM) và thời gian chuyển siRNA (24-72 giờ) được tối ưu, các trình tự siRNA đều ức chế thành công sự biểu hiện của gen VEGF và KSP trên tế bào UTG Trong đó, trình tự VEGFsiRNA#1 và KSP -siRNA# 2 ức chế sự biểu hiện của gen đích hiệu quả nhất 2 VEGF -siRNA ức chế sự biểu hiện của VEGF, đồng thời ức chế một phần sự biểu hiện của KSP Ngược lại, KSP -siRNA chỉ ức ... điều trị UTG siRNA, đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật siRNA hướng gen mục tiêu KSP VEGF số dòng tế bào ung thư gan người thực với mục tiêu: Lựa chọn trình tự siRNA hướng gen KSP gen VEGF có hiệu... NGHIÊN CỨU 3.1 Kết lựa chọn trình tự VEGF -siRNA KSP -siRNA 3.1.1 Sự biểu gen VEGF KSP dòng tế bào ung thư gan tế bào gan Trong nghiên cứu này, biểu gen VEGF KSP dòng tế bào UTG Hep3B, HepG2, Huh-7 dòng. .. liệu sử dụng nghiên cứu 2.1.1 Các dòng tế bào sử dụng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành dòng tế bào UTG, gồm Hep3B, HepG2, Huh-7, tế bào gan THLE-3 tế bào nội mô HUVEC Các dòng tế bào cung cấp