NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Mở đầu Ung thư bệnh gây tử vong hàng đầu Việt Nam Theo thống kê Hội Ung thư TP Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 bệnh nhân ung thư mắc với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong bệnh này, thường gặp ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dày nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung ung thư phổi nữ giới Phần lớn bệnh nhân phát giai đoạn muộn, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chi phí điều trị bệnh cao kéo dài Các thuốc ung thư hệ thường có giá thành cao nên bệnh nhân có điều kiện tiếp cận thuốc hoá trị liệu cổ điển có giá thành hạ nhiều tác dụng phụ Gossypol hợp chất polyphenol tìm thấy hạt lồi thuộc chi bơng Gossypium, họ Malvaceae Gossypol biết điến với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị tác dụng chống ơxy hố, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV chống ung thư Gần đây, gossypol thu hút ý nhà khoa học với vai trò chất “mimetic BH3” (bắt chước BH3) tự nhiên, có khả ức chế protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2 Các protein thường biểu mức số loại tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc nhạy cảm với thuốc hoá trị liệu Gossypol (cũng số thuốc thử nghiệm lâm sàng khác ABT-263, obatoclax (GX15070) có tác dụng ức chế protein anti-apoptosis từ giúp cho tế bào ung thư chết theo chương trình, giảm kháng thuốc giúp cho tế bào ung thư trở lên nhạy cảm với thuốc hố trị liệu Gossypol có đồng phân quang học (-)-gossypol (+)-gossypol, (-)-gossypol xem có nhiều hoạt tính sinh học mạnh (+)-gossypol tác dụng chống ung thư, tránh thai nam, chống HIV Hiện nay, (-)-gossypol thuốc sử dụng theo Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 đường uống tác dụng đến đích Bcl-2 thử nghiệm lâm sàng pha II Mỹ Ở nước ta, vải loại công nghiệp trồng phổ biến, chủ yếu để cung cấp xơ phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may Hiện nay, diện tích bơng vải trồng Việt Nam ước đạt 8.500 ha, dự kiến đến năm 2020 diện tích bơng vải Việt Nam lên đến 76.000 Mặc dù nguồn nguyên liệu dồi có nhiều tác dụng sinh dược học có giá trị gossypol từ hạt chưa quan tâm nghiên cứu nước ta đặc biệt từ loài Gossypium barbadense L, thường biết đến lồi có hàm lượng gossypol cao có chứa nhiều (-)gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh Xuất phát từ thực tế nêu thực đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BƠNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ” Đề tài thực với mục tiêu sau: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất tinh chế gossypol từ hạt Gossypium barbadense L - Nghiên cứu phương pháp tách đồng phân (-)-gossypol (+)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic - Nghiên cứu độc tính tế bào sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol phân lập dòng tế bào ung thư người Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Gossypium 1.1.1 Vài nét hải đảo (Gossypium barbadense L.) chi Gossypium Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) thuộc chi Gossypium, loại ưa sáng, thích hợp với điều kiện khơ hạn Cây bụi cao 2-3 m Thân cành có lơng, màu tím, điểm chấm đen Lá mọc so le hình tim rộng, 3-5 thuỳ hình trứng bầu dục, thuỳ dài, thuỳ bên to Hoa màu vàng nhạt, cuống hoa có màu đen, tiểu đài có bắc nhiều hơn, hình trứng rộng, đài hình chén, có tuyến, tràng dài tiểu đài Quả nang hình bầu dục, hạt hình trứng nhọn, màu vàng nhạt, sợi trắng dễ rụng Mùa hoa từ tháng đến tháng 10 [4] Hình 1.1 Bơng hải đảo (Gossypium barbadense L.) Chi Bơng, Gossypium thuộc họ Malvaceae, bao gồm 39-40 loài khác nhau, lồi có giá trị thương phẩm trồng phổ biến giới bao gồm: G hirsutum, G barbadense, G arboreum G herbaceum Ở Việt Nam, có lồi thuộc chi bơng G hirsutum, G barbadense, G arboreum G herbaceum G acuminatum [1] Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Cây loại tự nhiên sử dụng vừa làm thực phẩm, vừa để cung cấp sợi Cây trồng vùng nhiệt đới hay nhiệt đới khắp nơi giới Trong liên vụ 2003-2004, sản lượng sợi bơng tồn giới ước đạt 88 triệu kiện, đứng đầu Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ Pakistan chiếm xấp xỉ 3/4 sản lượng bơng tồn thể giới [71] Hạt loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa từ 1624% protein từ 13-24% dầu tổng khối lượng nhân hạt Cùng với sợi bơng dầu protein từ hạt hai sản phẩm chủ yếu từ Dầu ép từ hạt sau loại bỏ gossypol dùng làm dầu ăn, dùng công nghiệp đồ hộp làm xà phịng Dầu hạt bơng gồm acid béo không no (acid oleic 40-50%, linoleic 25-30%), acid béo no (acid palmatic, stearic 20-25%) Hiện nay, nhóm sản phẩm dầu từ hạt giới, dầu hạt bơng đứng vị trí thứ (50 triệu tấn) sau dầu đậu nành (242 triệu tấn) dầu hạt cải (52 triệu tấn) [72] Khô dầu hạt bơng có hàm lượng protein cao (40-42%) sử dụng làm thức ăn gia súc hay làm phân bón Trong hạt bơng cịn có flavonoid glucoside quercetol kaempferol chất màu gossypol [4] Ở Việt Nam, công nghiệp quan trọng nhà nước đưa vào chương trình phát triển chiến lược để hướng tới phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may Hiện nay, diện tích trồng bơng Việt Nam tập trung chủ yếu Tây Nguyên (42%), vùng duyên hải miền Trung (33%), miền Bắc (20%) Đơng Nam (5%) Diện tích trồng bơng vải nước ta liên vụ 2009-2010 ước đạt 8.500 ha, sản lượng hạt thu ước đạt 10.000 sản lượng xơ ước đạt 3.500-3.700 Tuy nhiên, với sản lượng xơ nêu đáp ứng khoảng 2% nhu cầu ngành công nghiệp diệt may Hiện nay, diện tích trồng bơng vải nước ta tiếp tục mở rộng, ước tính đến năm 2020 diện tích trồng bơng Việt Nam tăng lên 76.000 [72] Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 1.1.2 Sự tồn gossypol chi Gossypium Gossypol hợp chất polyphenol chứng minh có nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị tác dụng tránh thai, chống ung thư, chống virus , Trong hạt bông, gossypol tồn chủ yếu tuyến chất mầu bên nhân Hình 1.2 lát cắt ngang hạt cho thấy tuyến chất mầu phân bố dày đặc bên nhân hạt, kích thước tuyến khoảng 50-100 µm Gossypol chiếm 90% lượng sắc tố tuyến, chiến khoảng 39-50% tổng khối lượng tuyến thông thường chiếm khoảng 0,4-1,7% khối lượng nhân hạt [23] Hình 1.2 Lát cắt ngang hạt bơng với tuyến chất mầu Ngồi hạt bơng, gossypol cịn tìm thấy bên số phận khác vỏ rễ cây, lá, vỏ hạt hoa Mặt khác, hàm lượng gossypol dao động lớn, phụ thuộc vào lồi, giống bơng, điều kiện khí hậu, đất đai vùng, lượng nước phân bón sử dụng G barbadense biết đến lồi có hàm lượng gossypol cao, hàm lượng gossypol tổng số hạt loài khoảng 0,3-3,4% [42] Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Do có hoạt tính sinh dược học khác biệt nên tỷ lệ hai đồng phân quang học (+)- (-)-gossypol hạt lồi bơng khác nghiên cứu nhiều Tỷ lệ (+)-gossypol : (-)-gossypol báo cáo khác giống lồi bơng thương phẩm, dao động từ 95 : đến 31 : 69, thông thường tỷ lệ : G hirsutum G barbadense : Tỷ lệ (+)- (-)-gossypol G arboreum (77 : 23), G barbadense (44 : 56) G herbaceum (68 : 32) [25] Cass cộng báo cáo tỷ lệ (+)- (-)-gossypol G mustelinum (57 : 43 65 : 35), G herbaceum (63 : 37) giống lai G herbaceum G hirsutum (48 : 52) [11] Tỷ lệ (+)- (-)-gossypol giống định gần không thay đổi tác động môi trường Nghiên cứu số lượng lớn giống G hirsutum G barbadense thương mại cho thấy với giống trồng định, mơi trường có tác động đến lượng gossypol tổng số hạt không ảnh hưởng đến tỷ lệ (+)- (-)gossypol [52] Hơn nữa, tỷ lệ (+)- (-)-gossypol không đổi định bất chấp hạt lấy từ thu hái từ đầu hay cuối vụ hạt từ gốc hay đỉnh 1.2 Đặc tính gossypol 1.2.1 Đặc tính lý hố học gossypol Gossypol (1,1’6,6’,7,7’-hexahydroxy-5,5’-di-isopropyl-3,3’-dimethyl-(2,2’binaphthalene)-8,8’-dicarboxaldehyde) hợp chất polyphenol mầu vàng, tìm thấy chủ yếu lồi thuộc chi bơng Gossypium họ Malvaceae Ngồi ra, gossypol cịn tìm thấy vỏ hoa nhiệt đới Thespesia populinea, loại phổ biến Châu Phi, Châu Á đảo Thái Bình Dương Gossypol có cấu tạo gồm khung naphtalene đối xứng, khung chứa nhóm -OH nhóm -CHO (Hình 1.3) Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 CHO OH HO 2' HO OH OH OH CHO Gossypol Hình 1.3 Cấu tạo gossypol Do có chứa nhóm phân cực (6 nhóm hydroxyl nhóm aldehyde) nên gossypol tan nhiều dung môi hữu methanol, ethanol, isopropanol, dioxane, diethyl ether, acetone, ethyl acetate, chloroform, carbon tetrachloride, phenol, pyridine, naphthalene nóng chảy, dầu thực vật nóng Nó tan glycerine, cyclohexane, benzene, gasoline ete dầu Tuy nhiên có mặt nhóm dialkylnaphthalene làm cho khơng tan nước Điểm chảy tinh thể gossypol tinh phụ thuộc vào dung môi dùng để kết tinh Gossypol kết tinh diethyl ether có điểm chảy 184ºC, chloroform có điểm chảy 199ºC, ligroin có điểm chảy 214ºC [27] Gossypol tồn hai dạng đồng phân quang học R hay (-)-gossypol S hay (+)-gossypol giới hạn khả quay cầu liên kết 2, ’-binaphthyl (Hình 1.4) Cả hai dạng đồng phân có nhiều hạt bơng nhiên tỷ lệ chúng khác tùy theo giống loài Ví dụ giống bơng Gossypium barbadense, (-)-gossypol thường chiến ưu thế, đồng phân (+)-gossypol lại chiếm ưu Gossypium hirsutum Hình 1.4 Các dạng đồng phân quang học gossypol Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hoạt tính sinh dược học (-)-gossypol (+)-gossypol khác nên độ bền đồng phân quang học quan tâm nghiên cứu Jaroszewski tiến hành thí nghiệm racemic hố (+)-gossypol nhiệt độ, sử dụng hệ dung mơi nước : dioxane (1 : 3) Kết cho thấy khơng có q trình racemic hố xảy sau gia nhiệt kéo dài (15 giờ) 90ºC [25] Do (-)-gossypol trực tiếp phân lập từ nguồn nguyên liệu thực vật nên phương pháp phân lập (-)-gossypol tinh khiết quang học phát triển dựa phương pháp kết tinh [49] hay sắc ký hỗn hợp racemic gossypol sau tạo dẫn xuất diastereoisomer gossypol, đặc biệt dẫn xuất bazơ Schiff [26] Gossypol tồn dạng tautomeric khác là: aldehyde, ketone hemiacetal dung môi khác (Hình 1.5) Trong hệ dung mơi thơng dụng, gossypol tồn chủ yếu dạng ketone, loại dung môi trơ chloroform, acetone, dioxane hay điều kiện acid, gossypol tồn chủ yếu dạng aldehyde Trong dung môi phân cực dimethyl sulfoxide (DMSO) môi trường kiềm, gossypol tồn trạng thái cân dạng hemiacetal, dạng aldehyde dạng ketone Vì vậy, gossypol thường hịa tan DMSO nghiên cứu hoạt tính sinh học, dạng tautomeric gossypol đóng góp vào hoạt tính sinh học OH CHO OH HO OH OH HO CHO d¹ng aldehyde H HO HO HO HO OH O O H OH OH O OH OH HO H d¹ng hemiacetal O OH H d¹ng ketone Hình 1.5 Các dạng đồng phân tautomer gossypol OH Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Marchlewski, người phân lập gossypol acetic acid (G-AA) cho thấy gossypol dễ bị ơxy hố dung dịch kiềm, có mầu đỏ sáng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, mầu xanh đậm FeCl3 Tính chất hố học gossypol chủ yếu nhóm carbonyl, hydroxyl cấu trúc cồng kềnh khung binaphthlene định Gossypol phản ứng với hợp chất khác để tạo thành gossypol liên kết (bound gossypol) Một số nghiên cứu rằng, phần lớn gossypol tồn dạng basơ Schiff phản ứng nhóm aldehyde gossypol với nhóm amino protein q trình chế biến hạt bơng Bên cạnh đó, gossypol tạo phức cua với sắt sản phẩm từ hạt để tạo thành phức kim loại khơng tan, bị ơxy hóa tạo thành dạng gossypol polymer Các nhóm –OH phenol gossypol phản ứng với acid carboxylic phenol khác hạt để tạo thành este ether tương ứng [27] 1.2.2 Đặc tính sinh dược học gossypol 1.2.2.1 Tác dụng tránh thai cho nam Gossypol nghiên cứu sâu với vai trị thuốc tránh thai mơ hình in vivo bao gồm chuột cống, chuột nhắt, khỉ, chuột đồng, thỏ, bò người Khi cho uống G-AA với liều 5-10 mg/kg thể trọng vòng 12 tuần gây vơ sinh chuột đực Trên thỏ đực, với liều từ 1,25-10 mg/kg thể trọng/ngày vòng 5-14 tuần làm giảm khả di động tinh trùng không làm giảm số lượng tinh trùng Khi cho khỉ đực trưởng thành uống G-AA với liều hay 10 mg/kg thể trọng vòng tháng cho thấy nồng độ khả di động tinh trùng giảm, khơng có khác biệt nồng độ testosterone máu [49] Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính tránh thai manh (+)gossypol Sử dụng (+)-gossypol với liều 30 mg/kg theo đường uống vịng 14 ngày khơng khơng có hoạt tính tránh thai mà gây độc chuột cống Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 đực Trong đó, (-)-gossypol với liều 30 mg/kg thể trọng theo đường uống vòng ngày thể rõ hoạt tính tránh thai chuột cống đực [61] Thử nghiệm lâm sàng 10.000 người đàn ơng tình nguyện Trung Quốc vào năm 1978, liều 20 mg/ngày, 75 ngày, sau với liều trì 50 mg/tuần cho thấy có số trường hợp (0,75%) bị tăng kali huyết, 10% số đàn ông dùng gossypol năm khơng phục hồi q trình tạo tinh trùng Một thử nghiệm quốc tế khác 151 đàn ông Brazil, Nigeria, Kenya Trung Quốc cho thấy, dùng 15 mg gossypol/ngày 12 đến 16 tuần, sau dùng liều 7,5-10 mg/ngày vịng 40 tuần khơng gây triệu chứng tăng kali huyết trình tạo tinh trùng phục hồi sau dừng sử dụng gossypol [14] 1.2.2.2 Hoạt tính chống virus, vi sinh vật động vật nguyên sinh Lin cộng (1989) báo cáo gossypol ức chế trình tái virus HIV loại (HIV-1) ông nhận thấy (-)-gossypol (IC 50 = 5,2 µM) ức chế mạnh (+)-gossypol (IC50 = 50,7 µM) [33] Bên cạnh đó, gossypol cho thấy khả chống lại loại virus khác bao gồm virus herpes simplex loại (HSV-2), virus cúm, cúm [57] Đặc tính chống vi sinh vật gossypol nghiên cứu Gossypol có hoạt tính kháng nấm với giá trị LD50 khoảng từ 20-100 ppm có tác dụng ức chế mạnh vi sinh vật bao gồm bào tử không khí, lactobacilli số nấm Vadehra cộng (1985) nghiên cứu tác động gossypol lên sinh trưởng số loại vi khuẩn, hình thành nảy mầm bào tử Bacillus cereus Các tác giả nhận thấy gossypol có tác dụng kháng vi khuẩn gram dương (ví dụ: Streptococus spp, Bacillus spp, Staphylococus aureus) mạnh so với vi khuẩn gram âm Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Shigela spp Escherichia coli Nhóm nghiên cứu nhận thấy loại nấm Saccharomyces cereviseae, S uvarum, S diasticu nhạy cảm với gossypol, sinh trưởng chúng bị ức chế hoàn toàn nồng độ 50 ppm gossypol [55] 10 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 3.4.3 Tác dụng (±)-gossypol, (+)-gossypol (-)-gossypol dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (±)-Gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol thử dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 sau 72 h nồng độ tương ứng từ 0,5-30 µM (đối với (±)gossypol (-)-gossypol ) 0,5 đến 60 µM (đối với (+)-gossypol) thơng qua phép phân tích MTT (Hình 3.19) Kết chúng tơi cho thấy (±)-gossypol (-)-gossypol có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào phụ thuộc theo liều khoảng nồng độ thử với giá trị IC50 8,8 µM 4,5 µM Trong đó, khoảng nồng độ 0,5-10 µM, chúng tơi khơng quan sát thấy ức chế (+)-gossypol dòng tế bào Hep-G2 sau 72 h Ngược lại, khoảng nồng độ từ 10-60 µM, tác dụng ức chế (+)-gossypol phụ thuộc theo liều Giá trị IC 50 (+)-gossypol dòng tế bào Hep-G2 xác định 32,1 µM sau 72 h Hình 3.19 Tác dụng (±)-gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol dòng tế bào Hep-G2 sau 72 h 62 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đối chứng (±)-gossypol 10 µM (-)-gossypol 10 µM (+)-gossypol 10 µM Hình 3.20 Sự phát triển tế bào Hep-G2 không xử lý (đối chứng) xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol nồng độ 10 µM sau 72 h Nhận xét chung: Bảng 3.4 Giá trị IC50 (±)-, (+)- (-)-gossypol dòng tế bào ung thư người Dòng tế bào ung thư Chất nghiên cứu MCF-7 LU-1 Hep-G2 (±)-Gossypol 6,2 ± 1,2 µM 8,7 ± 1,3 µM 8,8 ± 1,1 µM (-)-Gossypol 4,0 ± 0,3 µM 4,3 ± 0.9 µM 4,5 ± 0,8 µM (+)-Gossyol 30,2 ± 1,9 µM 30,3 ± 2,7 µM 32,1 ± 3,2 µM Vincristine 80,4 ± 3,7 nM 93,1 ± nM 5,0 ± 1,2 nM Ghi chú: Các giá trị biểu thị dạng: giá trị trung bình ± sai số 63 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Kết phân tích MTT cho thấy (±)-gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào nghiên cứu MCF-7, LU-1 Hep-G2 Trong với giá trị IC50 > 30 µM, (+)-gossyol xem có tác dụng ức chế yếu dòng tế bào ung thư thử in vitro (-)-Gossypol ức chế manh phát triển dòng tế bào nghiên cứu, tác dụng gấp từ 1,5 đến lần so với (±)-gossypol gấp từ 7-7,5 lần so với (+)-gossypol Trên giới, tác dụng chống ung thư gossypol chứng minh nhiều dòng tế bào ung thư khác in vitro in vivo Trên dịng MCF-7, IC50 (±)-gossypol khoảng 3,4-24 µM [7, 24, 66] Trên dòng tế bào ung thư vú khác T47-D, Benz cộng cho thấy IC 50 (±)-gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol 5,3; 3,1 20 µM Như (-)-gossypol có tác dụng ức chế gấp khoảng 1,7 lần 6,6 lần so với (±)-gossypol (-)-gossypol Chưa thấy cơng trình nghiên cứu công bố tác dụng gossypol đồng phân quang học dịng tế bào ung thư phổi LU-1 Tuy nhiên, dòng tế bào ung thư phổi H69, Shelley cộng cho thấy (-)-gossypol có tác dụng ức chế phát triển tế bào gấp 1,5 lần so với (±)-gossypol 2,5 lần so với (+)-gossypol [50] Như vậy, tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư vú phổi sản phẩm gossypol mà phân lập phù hợp với công bố trước giới Trên dòng tế bào ung thư gan, chúng tơi khơng tìm thấy tài liệu công bố tác dụng gossypol loại tế bào ung thư Với kết này, cho rằng, (-)-gossypol đối tượng đáng nghiên cứu kỹ để phát triển thành thuốc chữa ung thư Việt Nam 64 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 KẾT LUẬN Chúng đạt số kết sau trình thực luận văn: Đã nghiên cứu thành công quy trình chiết xuất tinh chế gossypol từ hạt bơng Gossypol barbadense L., quy trình đơn giản, sử dụng dung mơi, sản phẩm có độ tinh khiết cao (>98%), đạt hiệu suất 0,32% giống HD139 HD208, 0,28% giống HD108 Đã tách thành công đồng phân quang học (-)-gossypol (+)-gossypol thông qua tạo bazơ Schiff (±)-gossypol với L-phenylalaninol sử dụng sắc ký cột Sản phẩm (-)-gossypol (+)-gossypol có độ tinh khiết cao, hiệu suất phân tách tương ứng 82,1% 66,7% Đánh giá tỷ lệ đồng phân (-)-gossypol/(+)-gossypol hạt bơng giống bơng thuộc lồi G barbadense L giống bơng thuộc lồi G hirsutum phương pháp HPLC, HD208 giống có tỷ lệ đồng phân (-)-gossypol/(+)-gossypol hạt cao (57,8: 42,2), VN01-2 giống có tỷ lệ thấp (39,7 : 60,3) Đã tiến hành thử độc tính tế bào phương pháp MTT (MTT assay) (±)-gossypol, (-)-gossypol (+)-gossypol dòng tế bào ung thư người Trong đó, đồng phân (-)-gossypol có tác dụng độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư ung thư vú (MCF-7, IC50 = 4,0 µM), ung thư phổi (LU1, IC50 = 4,3 µM) ung thư gan (Hep-G2, IC50 = 4,5 µM) 65 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu quy trình tách (-)-gossypol-L-phenylalalinol dienamine từ hỗn hợp (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine tinh chế (-)-gossypol sau trình thủy phân base Schiff tương ứng phương pháp kết tinh Nghiên cứu sử dụng đồng phân (+)-gossypol cách racemic hóa dẫn xuất Nghiên cứu tác dụng phối hợp (-)-gossypol với số thuốc hóa trị liệu sử dụng lâm sàng Nghiên cứu chế tác dụng sinh học (-)-gossypol Nghiên cứu tác dung chống ung thư (-)-gossypol in vivo, độc tính cấp độc tính bán trường diễn 66 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội Nguyễn Bá Đức (2003), Hóa chất điều trị bệnh ung thư Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Đăng Quân, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2002), “Khảo sát hoạt tính kháng phân bào hoạt chất gossypol plumbagin dòng tế bào ung thư số phương pháp thử nghiệm”, Tạp Chí Sinh Học, 24 (4), tr 43-47 Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà Nội TIẾNG ANH Adams M J., Cory S (2007), “Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential”, Curr Opin Immunol., 19, pp 448-496 Band V., Hoffer A P., Band H., Rhinehardt A E., Knapp R C., Matlin S A., Anderson D J (1989), “Antiproliferative effect of gossypol and its optical isomers on human reproductive cancer cell lines” Gynec Oncol., 32, pp 273–277 Benz C.C, Keniry M.A., Ford J M, Townsend A J., Cox S W, Palayoor S., Matlin S A., Hait W.N (1990), “Biochemical corrlerates of anti tumor and antimitochrondrial properties of gossypol enantiomer”, Mol Pharmacol., 37, pp 840- 847 67 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Brycki B., Brzezinski B., Marciniak B., and Paszyc S (1991), “1H and 13C NMR Studies of Tetrabutylammonium Salts of Gossypol in Chloroform Solution”, Spectrosc Lett., 24, pp 509–518 (1991) Carruth, F E (1918), “Contribution to the Chemistry of Gossypol, the Toxic Principle of Cottonseed”, JAOCS, 40, pp 647-663 10 Cass B Q., Bassi L A., Matlin A S (1999), “First direct resolution of gossypol enantiomers on a chiral high-performance liquid chromatography phase”, Chirality, 11, pp 46-49 11 Cass B Q., Tiritan E., Matlin A S Preire C E (1991), “Gossypol enantiomer Ratios in cotton seeds", Phytochem., 30 (8), pp 2655-2657 12 Cass B Q, Oliveira V R., De Pietro C A (2004), “Determination of gossypol enantiomer ratio in cotton plants by chiral highperformance liquid chromatography”, J Agric Food Chem., 52, pp 5822-5827 13 Chang J S., Hsu Y L., Kuo P L., Chiang L C., and Lin C C (2004) “Upregulation of Fas/Fas ligand-mediated apoptosis by gossypol in an immortalized human alveolar lung cancer cell line”, Clin Exp Pharmacol Physiol., 31, 716–722 14 Coutinho E M (2002), “Gossypol: A contraceptive for men”, Contraception, 65, pp 259-263 15 Dowd K M (2003), “Preparation of Enantiomeric Gossypol by Crystallization”, Chirality, 15, pp 486-493 16 Dowd K M., Pelitire M S (2001), “Recovery of G-AA from cottonseed soapstock”, Ind Crops Prod., 14, pp 113–123 17 Ergun A M., Konac E., Erbas D., Ekmekci A (2004), “Apoptosis and nitric oxide release induced by thalidomide, gossypol and dexamethasone in cultured human chronic myelogenous leukemic K-562 cells”, Cell Biol Internat., 28, pp 237-242 68 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 18 Fan X H., Wang X., Chen F., Galler D P., Wan P J (2008), “Engine performance test of cottonseed oil biodiesel”, Open Energy Fuels J , 1, pp 40-45 19 Flack M R , Pyle R G , Mullen N M , Lorenzo B., Wu Y W , Knazek R A., Nisula B C , Reidenberg M M.(1993), “Oral gossypol in the treatment of metastatic adrenal cancer” J Clin Endocrinol Metab.,, 76(4), pp 1019-1024 20 Gerez de Burgos N M., Burgos C., Montamat E E., Rovai L E., and Blanco, A (1984), “Inhibition by gossypol of oxidoreductases from Trypanosoma cruzi” Biochem Pharmacol., 33, pp 955–959 21 Guangfeng Jia Yonghua Zhan , Daocheng Wu, Yang Meng, Liang Xu (2009), “An Improved Ultrasound-Assisted Extraction Process of G-AA From Cottonseed Soapstock”, AIChE Journal, 55 (3), pp 797-806 22 Hron R J ,Kim L H., Calhoun C M., Fisher S G (1999), “Determination of (+)- (-)- and Total Gossypol in Cottonseed by High-Performance Liquid Chromatography”, JAOCS, 76 (11), pp 1351-1355 23 Hron R J., Koltun P S., Pominski J., Abraham G (1987), “The Potential Commercial Aspects of Gossypol”, JAOCS, 64 (9), pp 1315-1319 24 Jaroszewski J W., Kaplan O., Cohen J S (1990) “Action of gossypol and rhodamine 123 on wild type and mutidrug-resistant MCF-7 human cancer cell: 31P nuclear magneic resonance and toxicity studies”, Cancer Res., 50, pp 6936-6943 25 Jaroszewski J W., Strom-Hansen T., Hansen L L (1992), “Optical Stability of Gossypol”, Chirality, 4, pp 216-221 26 Jiang H., Cao X., Huang H., Jiang B (2007), “An expedient route for the practical preparation of optically active (-)-gossypol”, Asymmetry, 18, pp 2437-2441 69 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 27 Kenar A J (2006), “Reaction Chemistry of Gossypol and Its Derivatives”, JAOCS, 83 (4), pp 269-302 28 Laughton M J., Halliwell B., Evans P J., and Hoult, J R (1989), “Antioxidant and prooxidant actions of the plant phenolics quercetin, gossypol and myricetin Effects on lipid peroxidation, hydroxyl radical generation and bleomycin-dependent damage to DNA” Biochem Pharmacol., 38, pp 2859–2865 29 Le Blanc M., Russo J., Kudelka A P., Smith, J A (2002), “An in vitro study of inhibitory activity of gossypol, a cottonseed extract, in human carcinoma cell lines”, Pharmacol Res, 46, 551-555 30 Li A., Bandy B., Tsang S S., Davison A J (2000), “DNA-breaking versus DNA-protecting activity of four phenolic compounds in vitro” Free Rad., 33, pp 551-566 31 Li Z M., Jiang W Q., Zhu Z Y., Zhu X F., Zhou J M., Liu Z C., Yang D J., Guang Z Z (2008), “Synergistic cytotoxicity of Bcl-xL inhibitor, gossypol and chemotherapeutic gents in non-Hodgkin’s lymphoma cells”, Cancer Biol Ther., 7, pp 51-60 32 Ligueros M., Jeoung D., Tang B., Hochhauser D., Reidenberg M M., Sonenberg, M (1997), "Gossypol inhibition of mitosis, cyclin D1 and Rb protein in human mammary ancer cells and cyclin-D1 transfected human fibrosarcoma cells”, Br J Cancer, 76, pp 21-28 33 Lin T S., Schinazi R., Griffith B P., August E M., Eriksson B F H., Zheng D K., Huang L., Prusoff, W H (1989), “Selective inhibition of human immunodeficiency virus type replication by the (-) but not the (+) enantiomer of gossypol”, Antimicrob Agents Chemother., 33, pp 21492151 70 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 34 Macoska A J., Adsule S., Tantivejkul K., Tantivejkul K., Wang S., Pienta J K., Lee T C (2008), “(−)-Gossypol promotes the apoptosis of bladder cancer cells in vitro”, Pharmacol Res., 58, pp 323-331 35 Marzo I., Naval J (2008), “Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy”, Biochem Pharmacol , 76, pp 939-946 36 Matlin S A and Belenguer A., Tyson R G and Brookes A N.(1987), “Resolution of Gossypol: Analytical and Large-Scale Preparative HPLC on Non-Chiral Phases, Journal of High Resolution Chromatography & Chromatography”, Communications, 10, pp 86-91 37 Meng Y., Tang W., Dai Y., Wu X., Liu M., Ji Q., Ji M., Pienta K., Lawrence T., Xu L (2008) “Natural BH3 mimetic (-)-gossypol chemosensitizes human prostate cancer via Bcl-xL inhibition accompanied by increase of Puma and Noxa” Mol Cancer Ther., 7, pp 2192-2202 38 Moon D O., Kim M O., Lee J D., Kim G Y (2008), “Gossypol suppresses NF-kappaB activity and NF-kappaB-related gene expression in human leukemia U937 cells” Cancer Lett 264, pp.192-200 39 Nguyen Kim Phi Phung, Nguyen Ngoc Suong, Pham Dinh Hung, Huynh Huu Tri (1997), “Isolation and purification of gossypol in cotton seeds of Viet Nam”, Tạp Chí Hố Học, 35 (2), pp 91-93 40 Oliver C L., Bauer, J A., Wolter K G., Ubell M L., Narayan A., O’Connell K M., Fisher S G., Wang S., Wu X., Ji M., Carey T E., Bradford C R (2004), “In vitro effects of the BH3 mimetic, (-)-gossypol, on head and neck squamous cell carcinoma cells” Clin Cancer Res., 10, pp 7757-7763 41 Oliver C L., Miranda M B., Shangary S., Land S., Wang S., Johnson D E (2005), “(-)-Gossypol acts directly on the mitochondria to overcome Bcl-2- 71 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 and Bcl-X(L)-mediated apoptosis resistance” Mol Cancer Ther., 4, pp 2331 42 Percy G R., Calhoun, Kim L H (1996), “Seed gossypol variation within Gossypium barbadense L Cotton”, Crop Science, 36, pp 193-197 43 Pitot H, Saleh M., Holmlund J., Maleski J., Forero A (2007), “Extended phase I trial of the oral pan-Bcl-2 inhibitor AT-101 by multiple dosing scheldules in patients with advanced cancers”, Proc Am Sco Clin Oncol., 25 (18S), pp 3583 44 Razakantoanina V., Nguyen Kim P P., Jaureguiberry G (2000) Antimalarial activity of new gossypol derivatives Parasitol Res., 86, pp 665-668 45 Royer R E., Deck L M., Campos N M., Hunsaker L A., Vander Jagt D L (1986), “Biologically active derivatives of gossypol: Synthesis and antimalarial activities of periacylated gossylic nitriles”, J Med Chem., 29, pp 1799-1801 46 Ruddon W R (2007), Cancer biology, Oxford university press., New York 47 Sampatk D S., Balaram P A (1986) “Rapid Procedure for the Resolution of Racemic Gossypol”, J Chem Soc Chem Commun, pp 649-650 48 Scudiero D A., Shoemaker R H., Kenneth D P., Monks A., Tierney S., Nofziger T H., Currens M J., Seniff D., Boyd M R (1988), “Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines”, Cancer Res., 48, pp 4827-4833 49 Shandilya L N., Clarkson T B (1982), “Hypolipidemic effects of gossypol in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis)”, Lipids, 17, pp 285-290 50 Shelley M D., Hartley L., Fish R G., Groundwater P., Morgan J J G., Mort D., Mason M., Evans A (1999),”Stereo-specific cytotoxic effect of 72 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 gossypol enantiomers and gossypolone in tumour cell lines”, Cancer Lett.,135, pp 56 51 Shelley M D., Hartley L., Groundwater P W., Fish R G (2000) “Structure-activity studies on gossypol in tumor cell lines” Anticancer Drugs, 11, pp 209-216 52 Stipanovic D R., Puckhaber S L., Bell A A., Percival E A., Jacobs J (2005), “Occurrance of (+) and (-) gossypol in wild species of cotton and in Gossypium hirsutum Var marie-galante (Watt) Hutchinson”, J Agric Food Chem., 53 (16), pp 6266-6271 53 Tuszynski P G., Cossu G.(1984), “Differential Cytotoxic Effect of Gossypol on Human Melanoma, Colon Carcinoma, and Other Tissue Culture Cell Lines”, Cancer Res., 44, pp 768-771 54 Ueno H., Sahni M K., Segal S J., Koide S S (1988), “Interaction of gossypol with sperm acromolecules and enzymes” Contraception, 37, pp.333-341 55 Vadehra D V., Kalla N R., Saxena, M., Hashia R., Kaur P., Gupta L K (1985), “Antimicrobial activity of G-AA”, IRCS Med Sci ,13, pp 10-11 56 Van Poznak C., Seidman A D., Reidenberg M M., Moasser M M., Sklarin N., Van Zee K., Borgen P., Gollub M., Bacotti D., Yao T J., Bloch R., Ligueros M., et al (2001), “Oral gossypol in the treatment of patients with refractory metastatic breast cancer: A phase I/II clinical trial” Breast Cancer Res Treat., 66, pp 239-248 57 Vander Jagt D L., Deck L M., Royer R E (2000), “Gossypol: Prototype of inhibitors targeted to dinucleotide folds” Curr Med Chem., 7, pp 479498 73 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 58 Vogler M., Dinsdale D., Dyer M J S., Cohen J M., (2009), “Bcl-2 inhibitors: small molecules with a big impact on cancer therapy”, Cell Death and Differ., 16, pp 360-367 59 Wang G., Nikolovska-Coleska Z., Yang C Y., Wang R., Tang G., Guo J., Shangary S., Qiu S., Gao W., Yang D., Meagher J., Stuckey J., Krajewski K., Jiang S., Roller P P., Abaan H O., Tomita Y., Wang S (2006), “Structure-Based Design of Potent Small-Molecule Inhibitors of AntiApoptotic Bcl-2 Proteins”, J Med Chem., 49 (21), pp 6139-6142 60 Wang N G., Zhou L F., Guan, M H., Lei H P (1987), “Effect of (-)- and (+)gossypol on fertility in male rats”, J Ethnopharmacol., 20, pp 21-24 63 61 Wang X., Beckham T., Morris J., Chen F., Gangemi D (2008), “Bioactivities of gossypol, 6-methoxy gossypol and 6, 60-dimethoxy gossypol”, J Agric Food Chem., 56, pp 4393-4398 62 Whaley K J., Sampath D S., Balaram P A (1984), Circular dichroism study of (ỵ) gossypol binding to proteins, Biochem Biophys Res Commun., 121, pp 953-959 63 Xu L Y., Wang S., Tang W., Liu, M., Davis M., Chen J., Rae J M., Lawrence, T., Lippman M.E (2005), “(-)-Gossypol enhances response to radiation therapy and results in tumor regression of human prostate cancer” Mol Cancer Ther., 4, pp 197-205 64 Zhang H P., Wang X., Chen F., Androulakis X M.,Wargovich M J (2007), “Anticancer activity of limonoid from Khaya senegalensis”, Phytother Res., 21, pp 731-734 65 Zhang M., Liu H., Tian Z., Griffith N B., Ji M., Li Q Q (2007), “Gossypol induces apoptosis in human PC-3 prostate cancer cells by modulating caspase-dependent and caspase-independent cell death pathways”, Life Sciences, 80, pp 767-774 74 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 66 Zhang M., Liu H., Tian Z., Huang J., Remo M., Li Q Q (2007), “Differential growth inhibition and induction of apoptosis by gossypol between HCT116 and HCT116/Bax (-/-) colorectal cancer cells”, Clin Exp Pharmacol Physiol ,34, pp 230-237 67 Zhang M., Liu H., Guo R., Ling Y., Wu X., Li B., Roller P P., Wang S., Yang D (2003), “Molecular mechanism of gossypol-induced cell growth inhibition and cell death of HT-29 human colon carcinoma cells”, Biochem Pharmacol , 66, pp 93-103 WEBSITES 68 http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00544596?term=Gossypol&rank=12 69 http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01003769?term=Gossypol&rank=10 70 http://www.nationmaster.com/red/pie/agr_cot_pro-agriculture-cottonproduction 71 http://www.soystats.com/2008/page_29.htm 72 http://www.thesaigontimes.vn/Home/kinhdoanh/dautu/25552/ 73 http://www.tienphong.vn/Tianyon/Index.aspx?ArticleID=176511&ChannelID=9 75 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 76 ... (- )gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh Xuất phát từ thực tế nêu thực đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT... hợp gossypol racemic phân lập từ hạt bơng Gossypium hirsutum trrồng Việt Nam có tác dụng ức chế phân bào hai dòng tế bào ung thư người dòng tế bào ung thư RD (Rhabdomyosarcoma) dịng tế bào ung thư. .. chứng minh có tác dụng nhiều loại tế bào ung thư lympho B, ung thư máu lympho bào mãn tính (CLL) dịng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ Đặc biệt, có tác dụng ức chế hiệu tế bào ung thư phổi chuột