Đánh giá tác dụng gây độc của Gossypol phân lập từ hạt bông trên các dòng tế bào ung thư

MỤC LỤC

Bệnh ung thư

Ung thư là quá trình sinh trưởng bất bình thường của các tế bào gây ra bởi những biến đổi phức tạp trong biểu hiện gene dẫn đến làm mất cân bằng giữa quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào và cuối cùng phát triển thành một quần thể tế bào có thể xâm chiếm các mô và di căn đến các vị trí khác, gây bệnh và nếu không điều trị thì sẽ làm chết vật chủ. Trên quan điểm của lâm sàng, ung thư là một nhóm lớn các bệnh, có lẽ khoảng hai trăm bệnh, đa dạng theo độ tuổi mắc bệnh, tốc độ phát triển, trạng thái biệt hoá của tế bào, triệu trứng, khả năng xâm lấn, di căn, phản ứng với cách điều trị và chẩn đoán. - Điều trị ung thư theo hướng đích (Targeted cancer therapy): Liệu pháp này sử dụng các loại thuốc ngăn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư bằng cách cản trở các phân tử đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triển khối u.

Trong liệu pháp này có thể kể đến như sử dụng các kháng thể đơn dòng và các độc tố miễn dịch đặc hiệu, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, các chất chống proteasome như bortezomide, các thuốc ức chế Bcl-2 gây apoptosis như genasene,. Apoptosis là một cơ chế “chết theo chương trình của tế bào” làm cho các sinh vật đa bào có thể điểu khiển được số lượng tế bào trong các mô và loại bỏ các tế bào không cần thiết hay đã bị lão hoá trong quá trình phát triển của cơ quan. Các caspase khởi đầu (initiator caspase) này có thể phân cắt và hoạt hóa các caspase thi hành (effector caspase) (caspase-3, caspase-6 và caspase-7), gián tiếp làm phá huỷ tế bào bằng cách phân cắt hàng loạt các protein thiết yếu của tế bào [58].

Khi tiếp nhận được tín hiệu cái chết, Bax và Bak có thể tạo thành dạng oligomer trên màng ngoài ty thể, giải phóng cytochrome c và hoạt hoá caspase, trong khi đó các protein anti-apoptosis lại ngăn cản quá trình giải phóng này bằng cách cản trở sự hoạt hóa Bax và Bak. Do đó, các chất bắt chước domain BH3, có khả năng liên kết với 1 hay nhiều protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2, phát động quá trình apoptosis, rất có tiềm năng trở thành thuốc chống ung thư đặc biệt là để chống lại tính kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của các tế bào ung thư.

Hình 1.6. Apoptosis thông qua con đường ty thể [35]

Mô hình liên kết giữa Bcl-2 với (-)-gossypol và Bim

Đặc biệt, nó có tác dụng ức chế hiệu quả các tế bào ung thư phổi trên chuột (mô hình xenografts) với ít tác dụng phụ. Nó cũng gây chết tế bào ung thư bạch cầu cấp tính (AML) nhưng lại không làm chết tế bào máu bình thường in vitro và ức chế ung thư máu trên mô hình xenografts mà không gây tác dụng phụ. ABT-737 và A-385358-chất ức chế Bcl-xL đặc hiệu đã được chứng minh là làm cho tế bào ung thư trở lên nhạy hơn với các thuốc hoá trị liệu khác như dexamethasone, vincristine, và L-asparagine [5].

Obatoclax (GX15-070), đây là một dẫn xuất indol bipyrrol của prodiginine trong vi khuẩn được phát triển bởi hãng dược phẩm Gemin X Biotechnology (Canada), có đặc tính bắt chước BH3. Obatoclax gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu, ung thứ vú và thậm trí trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc khác như melphalan, ABT-737 hoặc bortezomib. Để hiểu rừ về cơ sở cấu trỳc của (-)-gossypol liờn kết với Bcl-2, dựa vào việc mô hình hoá trên máy tính họ đã tiến hành gắn (-)-gossypol vào rãnh liên kết với BH3 trong Bcl-2.

Dựa trên sự mô hình hoá này đã xác định (-)-gossypol tạo nên mạng lưới liên kết hydro với Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2 thông qua nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl lân cận trên vòng naphthalene bên phải. Nhóm isopropyl trong cùng vòng naphthalene này gắn vào hốc kỵ nước trong Bcl-2, phần nào bắt chước Phe 101 trong Bim.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan) - Viện Hóa học.

Phương pháp nghiên cứu

Phần chiết ete dầu và DEE được hoà trong chloroform ở nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng từ 200-500 nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian). Cao chiết DEE được tiến hành phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ là silica gel pha thuận cỡ hạt 0,04-0,063 mm (Merck) với khối lượng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần phân tách. Phương pháp chung là cao chiết DEE từ 100 g hạt bông (chuẩn bị theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.2.1) được hoà tan trong một thể tích DEE xác định (khoảng 6 ml cho 100 g hạt), dung dịch thu được sau đó được thêm acetic acid băng.

Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tinh G-AA như: nhiệt độ kết tinh (nhiệt độ phòng và 4ºC), tỷ lệ DEE/acetic acid và nồng độ của cao chiết DEE (thể tích DEE được dùng để kết tinh). Sản phẩm G-AA trong quá trình nghiên cứu tinh chế gossypol bằng phương pháp kết tinh được được xác định độ tinh khiết bằng quang phổ tử ngoại dựa theo phương pháp được xây dựng bởi Guangfeng Jia và cộng sự [21]. - Đánh giá độ tinh khiết của mẫu: Độ khiết của sản phẩm G-AA thu được trong quá trình kết tinh từ cao DEE được xác định bằng phương pháp UV dựa theo phương trình đường chuẩn được xây dựng ở trên.

Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh. Cấu trúc hoá học của gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó được xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại như: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ tử ngoại, máy đo phổ hồng ngoại, máy đo phổ khối lượng, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H, và 13C, máy đo độ quay cực, máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và so sánh với dữ liệu đã công bố. Hỗn hợp đồng phân diastereomer (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được phân tách trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,04-0,063 mm.

Các phân đoạn chứa (-)-gossypol sạch (1 vết trên SKLM) được gộp lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và có thể kết tinh lại dưới dạng G-AA trong hỗn hợp DEE/acetic acid băng. Sản phẩm (+)-gossypol, (-)-gossypol đã qua tinh chế được khẳng định cấu trúc bằng phương pháp phổ tử ngoại, MNR, phổ khối, xác định góc quay cực, điểm chảy, xác định độ tinh sạch bằng HPLC. Các mẫu (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol được hòa tan trong dung mụi acetonitrile, lọc qua màng lọc 0,45àM, hũa loàng đến nồng độ thớch hợp sau đó được chuyển vào trong máy phân tích HPLC.

Sản phẩm phản ứng là các bazơ Schiff, là các đồng phân diastereomer có thể phân tách trên HPLC, trong khi các đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)- gossypol không thể tách ra khỏi nhau trên HPLC trong cùng điều kiện. Căn cứ vào thời gian lưu và phổ tử ngoại của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol để xác định vị trí pic tương ứng của chúng trong mẫu hạt trên HPLC. Phần dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 àm, hũa loóng đến nồng độ thớch hợp bằng acetonitrile và được chuyển sang phân tích trên máy HPLC với điều kiện chạy theo mục 2.2.6.

KIẾN NGHỊ