Nghiên cứu phân lập saponin và vicenin 2 trong rau đắng đất, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng qui trình định lượng vicenin 2 trong rau đắng đất (glinus oppositifolius (l ) dc , molluginaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP SAPONIN VÀ VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) DC., Molluginaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP SAPONIN VÀ VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) DC., Molluginaceae) Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM ĐÔNG PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Thị Thu Hiền TĨM TẮT Luận văn Thạc sĩ Dược học, khóa 2017-2019 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP SAPONIN VÀ VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae) Nguyễn Thị Thu Hiền Người hướng dẫn: TS Phạm Đông Phương Đặt vấn đề Rau đắng đất dược liệu phổ biến miền Nam Việt Nam với hai thành phần hóa học saponin flavonoid Trên thị trường có nhiều chế phẩm với thành phần Rau đắng đất (Glinus oppositifolius) sử dụng phổ biến Boganic, BAR, Livonic … tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu Rau đắng đất Vì vậy, việc phân lập số saponin, thiết lập chất chuẩn xây dựng quy trình định lượng vicenin cần thiết, góp phần vào công tác kiểm nghiệm đánh giá chất lượng rau đắng đất Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Phần mặt đất Rau đắng đất thu hái Tỉnh Tây Ninh vào tháng năm 2018 Phương pháp nghiên cứu: (1) Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất saponin vicenin (2) Thiết lập chất chuẩn vicenin (3) Xây dựng thẩm định quy trình định lượng vicenin Kết (1) Từ 30 g cao EtOAc tiến hành phân lập kỹ thuật sắc ký cột nhanh sắc ký cột pha đảo (RP-18) thu ba hợp chất tinh khiết G-2 (175 mg), G-3 (105 mg) G-4 (52 mg) Dựa vào liệu phổ MS 1D-NMR, 2D-NMR kết hợp với so sánh liệu tài liệu công bố, hợp chất G-2, G-3 G-4 xác định spergulacin, glinosid C spergulacin A Từ 90 g cao n-BuOH phân lập 450,5 mg vicenin đạt độ tinh khiết cao (2) Thiết lập đánh giá vicenin làm chất chuẩn đối chiếu (3) Xây dựng thẩm định quy trình định lượng vicenin Kết luận Qua trình nghiên cứu, đề tài thực đầy đủ mục tiêu đặt ra, đạt kết khả quan mở thêm nhiều hướng nghiên cứu SUMMARY Final essay for the degree as a Master of Pharmacy – Academy year 2017-2019 STUDY ON ISOLATION OF SAPONIN AND VICENIN 2, ESTABLISHING THE REFERENCE STANDARD AND QUANTITATIVE ASSAY OF VICENIN OF Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae Nguyen Thi Thu Hien Instructor: Dr Pham Dong Phuong Introduction Glinus oppositifolius (L.) DC is very popular in southern Vietnam with two main components: saponins and flavonoids In the market, there are many preparations such as Boganic, BAR, Livonic with the composition of Glinus oppositifolius which is used quite popularly due to its protective effect on the liver However, in Vietnam there have not had many studies on Glinus oppositifolius Therefore, isolating some saponins, establishing reference standard and quantitative assay of vicenin is necessary in the testing and quality evaluation of Glinus oppositifolius Materials and methods Materials: The aerial of Glinus oppositifolius collected in Tay Ninh Province in June 2018 Methods: (1) Extract, isolate and determine the structure of saponins and vicenin (2) Establish vicenin reference standard (3) Develop and validate vicenin quantitative assay in herbal Results 1) From 30 g EtOAc fraction extract, three pure compounds G-2 (175 mg), G-3 (105 mg) and G-4 (52 mg) were isolated by using fast column chromatography and reversephase column chromatography (RP-18) Based on data of MS and 1D-NMR and 2DNMR spectra combined with comparing data in published documents, compounds G-2, G-3 and G-4 were elucidated as spergulacin, glinosid C and spergulacin A From 90 g n-BuOH fraction extract, 450,5 mg of high purity vicenin was isolated (2) Establish and evaluate vicenin as reference standard (5) Develop and validate the quantitative assay of vicenin in herbal Conclusion According to the study, all the set targets are met with positive results and opened many new research directions MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Rau đắng (Molluginaceae) 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Glinus (L.) DC .2 1.1.4 Đặc điểm thực vật phân bố Rau đắng đất .3 1.1.5 Thành phần hóa học Rau đắng đất 1.1.6 Tác dụng dược lý công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHUẨN 11 1.2.1 Khái niệm .11 1.2.2 Phân loại 12 1.2.3 Quy trình xây dựng chất đối chiếu từ dược liệu .13 1.3 TỔNG QUAN VỀ VICENIN 1.3.1 Tính chất hóa lý 1.3.2 Tác dụng dược lý CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Dung mơi hóa chất .5 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Chiết xuất phân tách phân đoạn 2.2.2 Phân lập phương pháp sắc ký 2.2.3 Xác định cấu trúc chất phân lập 2.2.4 Thiết lập chất chuẩn 2.2.5 Xây dựng quy trình định lượng vicenin Rau đắng đất 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .20 3.1.1 Chiết xuất phân tách phân đoạn 20 3.1.2 Phân lập hợp chất từ cao EtOAc .21 3.1.3 Phân lập tinh chế vicenin từ cao n-BuOH 26 3.1.3 Xác định cấu trúc G-1, G-2, G-3, G-4 .31 3.2 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN VICENIN 45 3.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VICENIN TRONG CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT 57 3.4 BÀN LUẬN 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .70 4.1 KẾT LUẬN 70 4.2 ĐỀ NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên APCI Atmospheric-pressure chemical ionization COSY Correlated Spectroscopy d doublet DCM Dicloromethane dd doublet of doublets DĐVN Dược điển Việt Nam DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetat ESI Electrospray ionization HPLC High Performance Liquid Chromatography HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HSQC Heteronuclear single quantum coherence IC50 Half maximal inhibitory concentration m multiplet MS Mass spectroscopy Ý nghĩa (Phổ) tương quan 1H – 1H Ethyl acetat Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế 50% Phổ khối Bão hòa nước bhn NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PTN Phịng thí nghiệm Phịng thí nghiệm RDĐ Rau đắng đất s singlet Sbb Độ lệch chuẩn độ đồng lọ Sr Độ lệch chuẩn lặp lại SKLM Sắc ký lớp mỏng t triplet Tr Thời gian lưu Ubb Độ không đảm bảo đo chuẩn từ độ đồng Sắc ký lớp mỏng lọ VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân khơng DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Rau đắng đất Hình 1.2 Cấu trúc số flavonoid Rau đắng đất Hình 1.3 Một số cấu trúc saponin Rau đắng đất Hình 1.4 Một số chế phẩm chứa Rau đắng đất thị trường: 10 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học vicenin Hình 2.6 Cây Rau đắng đất cao khô Hình 3.7 Sơ đồ quy trình chiết phân bố 20 Hình 3.8 Sắc ký đồ cao chiết xuất từ cao khô Rau đắng đất 21 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân tích cao EtOAc 22 Hình 3.10 Sắc ký đồ phân đoạn cao EA cột VLC 22 Hình 3.11 Sắc kí đồ phân đoạn PĐ cột đảo 24 Hình 3.12 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết G-2 25 Hình 3.13 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết G-3 25 Hình 3.14 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết G-4 26 Hình 3.15 Sơ đồ tóm tắt chiết xuất phân lập từ cao EtOAc 26 Hình 3.16 Sắc ký đồ phân tích cao n- BuOH 27 Hình 3.17 Sắc ký đồ phân đoạn cao n-BuOH cột VLC-2 27 Hình 3.18 Sắc ký đồ phân đoạn PĐ cột pha đảo C18 29 Hình 3.19 Sắc ký đồ phân đoạn PĐ 6.3 cột Sephadex 30 Hình 3.20 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết G-1 31 Hình 3.21 Sơ đồ tóm tắt chiết xuất phân lập từ cao n-BuOH 31 Hình 3.22 Phổ MS G-1 32 Hình 3.23 Cơng thức cấu tạo tương tác HMBC vicenin 34 Hình 3.24 Phổ MS G-2 34 Hình 3.25 Cơng thức cấu tạo tương tác HMBC, COSY G-2 38 Hình 3.26 Phổ MS G-3 38 Hình 3.27 Công thức cấu tạo tương tác HMBC, COSY G-3 41 Hình 3.28 Phổ MS G-4 41 Hình 3.29 Cơng thức cấu tạo tương tác HMBC, COSY G-4 45 Hình 3.30 Sắc ký đồ kiểm tra vicenin với hệ dung môi khác 46 Hình 3.31 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b) 46 Hình 3.32 Phổ UV mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b) 47 Hình 3.33 Phổ MS vicenin điều chế (G1) 47 Hình 3.34 Phổ IR vicenin điều chế (G-1) 48 Hình 3.35 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết vicenin 49 Hình 3.36 Nhiệt đồ mẫu vicenin điều chế 49 Hình 3.37 Sắc ký đồ thể tính đặc hiệu phương pháp 51 Hình 3.38 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích đỉnh nồng độ vicenin 52 Hình 3.39 Sắc ký đồ phổ UV – Vis vicenin 57 Hình 3.40 Sắc ký đồ khảo sát chương trình dung mơi rửa giải 59 Hình 3.41 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử 61 Hình 3.42 Sắc ký HPLC khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng vicenin 64 Hình 3.43 Phổ UV – Vis vicenin mẫu thử (a) mẫu chuẩn (b) 64 Hình 3.44 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ vicenin 65 61 Phụ lục 83 Phổ G-4: COSY 62 Phụ lục 84 Phổ G-4: COSY trích vùng δH 2,9 - 5,3 ppm 63 Phụ lục 85 Phổ G-4: COSY trích vùng δH 0,6 - 2,1 ppm 64 Phụ lục 86 Phổ G-4: COSY trích vùng δH 1,00 - 1,75 ppm 65 Phụ lục 87 Kết thử tinh khiết vicenin điều chế 66 Phụ lục 88 Kết phân tích - viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh 67 68 69 70 71 72 73 74 Phụ lục 89 Certificate of Analysis 75 ... 20 17 -20 19 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP SAPONIN VÀ VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VICENIN TRONG RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae). .. ? ?Nghiên cứu phân lập saponin vicenin Rau đắng đất, thiết lập chất đối chiếu xây dựng quy trình định lượng vicenin Rau đắng đất? ?? thực với mục tiêu sau: - Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ Rau. .. đoạn 2. 2 .2 Phân lập phương pháp sắc ký 2. 2.3 Xác định cấu trúc chất phân lập 2. 2.4 Thiết lập chất chuẩn 2. 2.5 Xây dựng quy trình định lượng vicenin Rau đắng đất 16