Nghiên cứu này nhằm góp phần tìm ra dược liệu, hoạt chất có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan làm cơ sở nghiên cứu thuốc có tác dụng hỗ trợ, bảo vệ gan. Nghiên cứu tiến hành trên 50 mẫu nguyên liệu được thu mua ở nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học SÀNG LỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG POLYPHENOL TỪ MỘT SỐ DƢỢC LIỆU HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ, BẢO VỆ GAN Huỳnh Thị Như Thuý*, Nguyễn Hữu Lạc Thuỷ*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Ngày nay, chứng bệnh gan trở thành số bệnh phổ biến có nguy tử vong cao Việt Nam giới Nh}n d}n thường dùng thuốc có tác dụng bảo vệ gan chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật Y học đại sử dụng dạng cao chiết toàn phần hay hoạt chất tinh khiết Hiện nay, hướng phát triển chứng minh tác dụng cao toàn phần, cao ph}n đoạn hoạt chất tinh khiết dược liệu mơ hình thử nghiệm với trang thiết bị có kết luận khoa học Nghiên cứu nhằm góp phần tìm dược liệu, hoạt chất có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan làm sở nghiên cứu thuốc có tác dụng hỗ trợ, bảo vệ gan Đối tượng nghiên cứu: 50 mẫu nguyên liệu thu mua nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro 50 dược liệu phương ph{p đo quang phổ với phép thử DPPH Xây dựng thẩm định quy trình định lượng polyphenol c{c dược liệu tiềm phương ph{p đo quang với thuốc thử Folin - Ciocalteu Thử tác dụng bảo vệ gan in vivo theo hướng chống oxy hóa dược liệu tiềm mơ hình tổn thương gan cyclophosphamid Kết quả: Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá Đã s|ng lọc 5/50 dược liệu có hoạt tính chống oxy hố, ức chế 85% nồng độ 60 g/ml: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc, Kim ngân hoa Chọn dung mơi có khả chiết cao tồn phần có hoạt tính chống oxy hố tốt nhất: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc: cồn 70%; Kim ngân hoa: cồn 50% X{c định IC50 cao tồn phần Xây dựng thẩm định quy trình định lượng polyphenol Với phương ph{p quang phổ UV - Vis dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu, quy trình thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 0,0141x + 0,0267, R2 = 1,00 với khoảng nồng độ khảo sát 10,0 – 60,0 (μg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,7 %) v| độ (tỉ lệ phục hồi 99,86%) Mẫu thử Cao cồn 70% Cao cồn 70% Cao cồn 70% Cao cồn 50% Cao cồn 70% Cốt khí củ Hậu phác Trâm mốc Kim ngân hoa Hòe Polyphenol (%) 10,09 9,34 9,20 7,93 7,29 IC50 (µg/ml) 30,67 33,20 85,54 162,39 118,48 Thử tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa in vivo Cao cồn 70% Cốt khí củ có tác dụng bảo vệ gan liều 0,9 v| 1,8 g/kg (tương đương 6,11 g v| 12,22 g dược liệu khô/kg) Kết luận: Cao cồn 70% Cốt khí củ cao chiết có tác dụng chống oxy hóa tốt 50 mẫu nguyên liệu (tương đương 200 mẫu cao), đồng thời có tác dụng chống oxy hố, bảo vệ gan in vivo Từ khóa: cốt khí củ, sàng lọc, DPPH, Folin–Ciocalteu, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, cyclophosphamid *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 091.551.7890 Chuyên Đề Dƣợc Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com 221 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ABSTRACT SCREENING AND DETERMINATION OF POLYPHENOL OF MEDICAL PLANTS ON ANTIOXIDANT ACTIVITIES, HEPATOPROTECTIVE EFFECT Huynh Thi Nhu Thuy, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:221 - 228 Background – Objectives: Nowadays, hepatitis is becoming one of the common, high risk of death deseases in Viet Nam and around the world People often use medical plants to protect liver Morden medicine use extract, pure subtances Demonstrating the effect of extracts, pure subtances by test methods and modern equipments is currently a development trend The aim of the present study was to indicate more antioxidant, hepatoprotective medical plants, constituents That will be the basis for hepatoprotective drug studies Materials: 50 antioxidant medical plants were purchased in Pharmacy of traditional medicines, in District 5, Ho Chi Minh city Methods: UV–visible spectroscopy method with DPPH for screening of 50 medical plants on antioxidant activities Determination and validation of Folin-Ciocalteu for the determinatin of polyphenol content in antioxidant medical plants In vivo, hepatoprotective effect was evaluated in mice induced liver damage by cyclophosphamid Results: Screening in vitro of herbal plant on antioxidant activities The best results were obtained for 5/50 antioxidant medical plants which inhibit over 85% at the same concentration - 60 g/ml: Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc Polygonaceae (1), Magnolia officinalis Rehd et Wils Magnoliaceae (2), Styphnolobium japonicum L Fabaceae (3), Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae (4), Syzygium cumini L Myrtaceae (5) Ethanol 70% is the best solvent for strongest antioxidant properties: (1), (2), (3), (5), 50% ethanol is the best for (4) Determinate IC50 of whole extracts Determination and validation for the determinatin of polyphenol content The determinatin of polyphenol content by Folin-Ciocalteu was validated specificity, showed linearity range (10.0– 60.0 g/mL; ŷ = 0.0141x + 0.0267, R2 = 1.00), repeatability with RSD = 2.7 % and accuracy with recovery ratio 99,86 % Samples 70% ethanol extract (1) 70% ethanol extract (2) 70% ethanol extract (5) 50% ethanol extract (4) 70% ethanol extract (3) Polyphenol(%) 10.09 9.34 9.20 7.93 7.29 IC50 (µg/ml) 30.67 33.20 85.54 162.39 118.48 In vivo hepatoprotective effect 70% ethanol extract (1) has hepatoprotective effect at dose 0.9; 1.8 g/kg (equivalent to 6.11 g; 12.22 g dried herb/kg) Conclusions: The highest antioxidant activities, hepatoprotective effect in 50 medical plants (200 extracts) is 70% ethanol extract of Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc Polygonaceae Keywords: Polygonum cuspidatum, screening, DPPH, Folin – Ciocalteu, antioxidant activity đến rối loạn cân ĐẶT VẤN ĐỀ trình sinh hóa ngun nhân gây nên Gốc tự t{c nh}n độc hại gây bệnh Do đó, việc tìm hợp chất nhiều bệnh nhƣ bệnh đƣờng tim mạch, chống oxy hóa có khả ức chế gốc tự bệnh g n, ung thƣ Về mặt hóa học, gốc tự ức chế trình gián tiếp sinh gốc tự bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều l| điều cần thiết(3) phản ứng hóa học với hợp chất nhƣ protein, lipid, c rbohydr t, < thể Điều dẫn 222 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Ngày nay, chứng bệnh g n đ ng trở thành số bệnh phổ biến v| có nguy tử vong cao Việt N m nhƣ giới Hiện nay, hƣớng phát triển chứng minh tác dụng cao toàn phần, cao ph}n đoạn hoạt chất tinh khiết củ dƣợc liệu mơ hình thử nghiệm với trang thiết bị có kết luận khoa học Mục tiêu củ đề tài là: sàng lọc số dƣợc liệu có tính chống oxy hố in vitro, xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng polyphenol cao chiết tiềm nhằm chọn r dƣợc liệu có tác dụng chống oxy hoá tốt nhất, thử tác dụng bảo vệ gan in vivo cao chiết tiềm ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu 50 mẫu nguyên liệu đƣợc thu mua nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp HCM Thiết bị Hệ thống quang phổ UV - Vis Shimadzu 2550 (Japan), cân phân tích Sartorius Practum 224-1S (0,1 mg; 0,01 mg) Các thiết bị n|y đƣợc hiệu chuẩn theo quy định Dung môi - hóa chất Natri carbonat, sắt (III) clorid (Trung Quốc), thuốc thử Folin - Ciocalteu, 2,2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH Merck – Đức), cyclophosphamid, acid tricloroacetic, acid thiobarbituric Sigma – Aldrich (Mỹ) Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá Nghiên cứu Y học ethyl acetat Dịch chiết ph}n đoạn đƣợc thu hồi dung m i đến c o đặc, mẫu cao n-hexan, cao cloroform cao ethyl acetat mẫu thử cho thử nghiệm sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa Thử nghiệm sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá (phép thử DPPH) Mẫu thử (các mẫu thử nồng độ 60 g/ml): cân 0,15 g lần lƣợt cao (toàn phần 96%; 70%; 50%; 25% v| c{c c o ph}n đoạn) hòa t n v| điền đầy meth nol bình định mức 100 ml Lọc lấy dịch, lấy xác ml dịch lọc n|y cho v|o bình định mức 50 ml, điền đầy methanol (dịch thử T) Pha dung dịch vitamin C nồng độ 1,25; 2,50; 3,75; 5,00; 6,25 µg/ml methanol Thuốc thử DPPH: DPPH hòa tan methanol nồng độ 0,15 mg/ml (bảo quản oC, tránh ánh sáng) Phản ứng x{c định hoạt tính chống oxy hóa Trong bình định mức 10 ml, cho ml thuốc thử DPPH, ml dung dịch thử nghiệm, điền meth nol đến vạch Để yên 30 phút, tránh ánh sáng, quét phổ khoảng bƣớc sóng 200 – 800 nm để tìm bƣớc sóng cực đại Tiến hành song song với mẫu đối chứng điều kiện nhƣng kh ng có dung dịch thử Mẫu trắng sử dụng l| meth nol X{c định độ hấp thu bƣớc sóng hấp thu cực đại, phần trăm hoạt tính chống oxy hó S% đƣợc x{c định theo cơng thức sau: Chiết xuất cao tồn phần Cân 50 g bột dƣợc liệu, chiết phƣơng ph{p ngấm kiệt, khảo sát với dung môi chiết cồn 96%, 70%, 50% cồn 25% Toàn dịch chiết đƣợc thu hồi dung m i đến cao đặc Chọn dung môi chiết c{c dƣợc liệu cho kết thử nghiệm DPPH cao T{ch ph}n đoạn cao toàn phần Chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với dung mơi có độ phân cực tăng dần từ n–hexan, cloroform Chuyên Đề Dƣợc Từ kết khảo sát, chọn c{c dƣợc liệu có hoạt tính chống oxy ho{ c o có %S > 85% để khảo sát IC50 v| x{c định h|m lƣợng polyphenol Xác định IC50 mẫu thử vitamin C Pha dung dịch thử nghiệm có nồng độ tăng dần cho tác dụng với lƣợng DPPH X{c định độ hấp thu xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính X{c định IC50 từ phƣơng trình hồi quy Giá trị IC50 mẫu thử có 223 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 nồng độ thấp, tác dụng loại bỏ gốc tự mạnh, khả chống oxy hóa cao Xây dựng thẩm định quy trình định lượng polyphenol Chọn cao toàn phần c o ph}n đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao khảo sát, tiến hành xây dựng quy trình định lƣợng polyphenol phƣơng ph{p qu ng phổ với thuốc thử FC Mẫu đối chiếu Dung dịch acid gallic 20 µg/ml (ddA) Mẫu thử Cân xác khoảng g cao cồn 70% Cốt khí củ cho v|o bình định mức 100 ml, thêm nƣớc đến vạch, siêu âm 50 ± o C 15 phút, lọc lấy dịch lọc Lấy xác ml dịch lọc cho v|o bình định mức 100 ml điền đến vạch nƣớc cất thu đƣợc dung dịch thử (T) Khảo s{t quy trình định lượng polyphenol Quét phổ mẫu thử mẫu đối chiếu khoảng bƣớc sóng từ 400 – 800 nm, x{c định cực đại hấp thu Khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối chiếu A, dịch chiết T với thuốc thử FC Trong bình định mức 10 ml: cho lần lƣợt X ml (0,5; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 3,0) dung dịch đối chiếu A (hoặc dung dịch thử T), cố định ml thuốc thử FC ml dung dịch natri carbonat 20% Lắc đều, x{c định độ hấp thu bƣớc sóng cực đại khảo sát Thẩm định quy trình Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng dẫn ICH(4) bao gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ x{c, độ Quy trình s u đạt yêu cầu thẩm định đƣợc ứng dụng định lƣợng mẫu c o dƣợc liệu tiềm đƣợc sàng lọc Thử tác dụng sinh học mơ hình in vivo X{c định độc tính cấp đường uống(1,2) Số lƣợng chuột thí nghiệm: 10 con, tuỳ vào số liều thử nghiệm Nhiệt độ phòng thử nghiệm: 29 – 300C Chuột nhịn đói 12 trƣớc tiến hành thử nghiệm Cho chuột uống liều cao cồn 70% Cốt khí củ liều cao qua kim với thể tích 20 ml/kg Theo dõi phản ứng xảy chuột vòng 72 Đ{nh gi{ dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (chết hay sống) chuột thử nghiệm Tính tần suất chuột chết lơ khảo sát tính liều LD50 Mơ hình tổn thương gan cyclophosphamid (CY)(1,2) Cân chuột trƣớc tiêm cyclophosphamid, cho uống mẫu thử v| trƣớc định lƣợng MDA Thời gian cho uống ngày từ đến sáng, uống liên tục ngày Vào ngày thứ 8, sau lần cho uống cuối mổ tách lấy gan chuột đem định lƣợng MDA Bảng 1: Bố trí thí nghiệm Nhóm CY (-) Chọn thể tích dung dịch thử T cho độ hấp thu bƣớc sóng cực đại tƣơng đƣơng với mẫu đối chiếu A Đồng thời khảo s{t độ ổn định mẫu dung dịch đối chiếu A, dung dịch thử T thời điểm 0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 25’, 30’, 35’, 40’, 45’, 50’, 55’, 60’ Từ kết khảo sát, viết dự thảo quy trình thẩm định theo quy định ICH 224 CY (+) Lô (n=9) Liều thử nghiệm Tiêm phúc mạc CY Chứng bình thường Chứng bệnh lý Cao cồn 70% Cốt khí củ Cao cồn 70% Cốt khí củ Nước cất - Nước cất 0,9 g cao/kg thể trọng chuột 1,8 g cao/kg thể trọng chuột 0,1 g/kg thể trọng chuột 150 mg/kg Silymarin X{c định h|m lượng malonyl dialdehyd (MDA) gan chuột: Cách tiến hành Tách gan chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm KCl 1,15 %, tỷ lệ khối lƣợng gan - Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 thể tích dung dịch KCl (1:9), phút tốc độ 13.000 vòng/phút, - oC S u đó, lấy ml dịch đồng thể cho định lƣợng MDA), bổ sung dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vừ đủ ml Ủ hỗn hợp phản ứng 37 oC 60 phút dừng phản ứng ml acid trichloroacetic TCA 10% S u đó, đem ly tâm hỗn hợp 10.000 vòng/phút 10 phút oC Sau ly tâm lấy ml dịch cho phản ứng với ml thiobarbituric acid 0,8% 100 oC 15 phút v| đo qu ng λ = 532 nm H|m lƣợng MDA nM/g protein đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA KẾT QUẢ Kết sàng lọc phép thử DPPH tác dụng chống oxy hoá 50 mẫu dƣợc liệu 13/200 cao chiết có hoạt tính chống oxy hoá > 85% nồng độ 60 g/ml củ c{c dƣợc liệu: Hậu phác, Trà, Cốt khí củ, Hòe, Kim ngân hoa, Diệp hạ châu, Trâm mốc Trong đó, h i dƣợc liệu Trà Diệp hạ ch}u có nhiều cơng trình cơng bố hoạt tính chống oxy hố(5,6) Do dƣợc liệu Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Kim ngân hoa, Trâm mốc đƣợc chọn cho nghiên cứu sàng lọc Cồn 70% l| dung m i đƣợc chọn chiết cao toàn phần c{c dƣợc liệu: Cốt khí củ, Hậu phác, Hoè, Trâm mốc với tác dụng chống oxy hoá tốt nhất, cồn 50% đƣợc chọn chiết cao toàn phần Kim ngân hoa Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hoá phép thử DPPH cao phân đoạn cao toàn phần: Bảng 2: Kết sàng lọc chọn dung mơi chiết cao tồn phần dược liệu tiềm Chuyên Đề Dƣợc 0,0343 0,0553 0,1400 0,0931 95,1 92,1 80,0 86,7 0,0511 0,2962 0,2094 0,2220 92,7 57,7 70,1 68,3 0,0728 0,3081 0,1568 0,1828 Bảng 3: Kết sàng lọc hoạt tính chống oxy hố phân đoạn (nồng độ 60 g/ml) Độ hấp thu (A) Cốt khí % ức chế củ Cao tồn phần (A) % ức chế A cao n–hexan (A) % ức chế A cao cloroform (A) % ức chế A cao ethyl acetat (A) % ức chế 0,0343 95,1% 0,2941 58,0% Hậu phác Hòe 0,0553 0,1400 92,1% 80,0% 0,5546 0,6687 20,8% 4,5% Kim Trâm ngân mốc hoa 0,0931 0,0574 86,7% 91,8% 0,6988 0,3809 0,2% 45,6% 0,3333 0,3851 0,6231 0,6854 0,4586 52,4% 45,0% 11,0% 2,1% 34,5% 0,0602 0,077 0,4796 0,098 0,0735 91,4% 89,0% 31,5% 86,0% 89,5% Cao toàn phần củ dƣợc liệu dƣợc chọn có hoạt tính chống oxy hố tốt so với c{c c o ph}n đoạn Do tiếp tục chọn mẫu cao toàn phần x{c định IC50 xác định hàm lƣợng polyphenol cao chiết Kết xác định IC50 cao cồn toàn phần vitamin C Kết thực nghiệm cho thấy cao Cốt khí củ có IC50 thấp Nhóm hợp chất polyphenol dƣợc liệu đƣợc tài liệu chứng minh có liên qu n đến tác dụng chống oxy hố Vì vậy, h|m lƣợng polyphenol đƣợc khảo s{t để khẳng định thêm hoạt tính chống oxy hố Chọn cao Cốt khí củ để làm mẫu thử khảo sát xây dựng quy trình định lƣợng polyphenol cao Hậu phác, cao Hòe, cao Trâm mốc, cao Kim ngân hoa (Hình 1) Kết khảo sát quy trình định lƣợng polyphenol phƣơng pháp quang phổ với thuốc thử FC: Cực đại hấp thu dung dịch đối chiếu acid gallic 761,8 nm; dung dịch thử T 761 nm, Tên mẫu Cao cồn Cao cồn Cao cồn Cao cồn dược liệu 96% 70% 50% 25% A S% A S% A S% A S% Cốt khí củ 0,1477 78,9 Hậu phác 0,1919 72,6 Hòe 0,2416 65,5 Trâm mốc 0,1708 75,6 Kim ngân 0,1288 81,6 hoa Nghiên cứu Y học 89,6 56,0 77,6 73,9 0,1751 75,0 0,0574 91,8 0,0693 90,1 chọn bƣớc sóng 761 nm cực đại hấp thu quy trình Kết khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối chiếu A, dung dịch thử T với thuốc thử FC ml thuốc thử FC đủ phản ứng với nồng độ 60 µg/ml dung dịch đối chiếu A tƣơng đƣơng 225 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ml); ml thuốc thử FC phản ứng với nồng độ 600 µg/ml dung dịch thử T, thời gian ổn định sau 10 phút đến 60 phút Dự thảo quy trình định lƣợng polyphenol cao cồn 70%: Thực phản ứng theo bảng Bảng 4: Pha chế dung dịch thử nghiệm Mẫu đối Mẫu Mẫu trắng chiếu thử Dung dịch đối chiếu (ml) 1,0 0,0 0,0 Dung dịch thử (ml) 1,0 1,0 0,0 Thuốc thử FC (ml) 1,0 1,0 1,0 Dung dịch Na2CO3 20% (ml) 5,0 5,0 5,0 Nước cất vừa đủ (ml) 10 150 %S y = 1,6037x + 0,82 100 R² = 0,997 50 0 20 40 60 80 Nồng độ (µg/ml) Cốt khí củ; y = 1,6037x + 0,82 với R2 = 0,9977; IC50 30,67 µg/ml Hậu phác; y = 1,4798x + 0,8647 với R2 = 0,9946; IC50 33,20 µg/ml Trâm mốc; y = 0,5457 + 4,9557 với R2 = 0,996; IC50 85,54 µg/ml Hòe; y = 0,3757x + 5,4929 với R2 = 0,9988; IC50 118,48 µg/ml Kim ngân hoa; y = 0,3036x + 0,6976 với R2 = 0,9992; IC50 162,39 µg/ml Vitamin C; y = 9,4197x + 1,4061 với R2 = 0,9996; IC50 5,16 µg/ml Hình 1: Đồ thị tương quan nồng độ hoạt tính chống oxy hóa số mẫu dược liệu khảo sát chất đối chiếu vitamin C 226 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Lắc đều, để yên bình phản ứng 15 phút H|m lƣợng P % polyphenol đƣợc tính từ độ hấp thu mẫu đối chiếu mẫu thử bƣớc sóng 761 nm hoạt tính oxy hóa hiệu so với 50 dƣợc liệu sàng lọc b n đầu Bảng 6: Kết định lượng polyphenol cao toàn phần IC50 c{c dược liệu Mẫu thử Cao cồn 70% Cốt khí củ Cao cồn 70% Hậu phác Mẫu đối chiếu: dung dịch acid gallic: 20 µg/ml H|m lƣợng P (%) polyphenol (qui acid g llic đƣợc tính theo cơng thức sau: AC: độ hấp thu mẫu đối chiếu AT: độ hấp thu mẫu thử m: khối lượng mẫu thử (g) C%: độ tinh khiết acid gallic (98%) H%: độ ẩm cao chiết (5,4%) Kết thẩm định quy trình Kết khảo sát độ đặc hiệu - Mẫu trắng khơng có tín hiệu bƣớc sóng cực đại mẫu đối chiếu mẫu thử - Cực đại hấp thu mẫu thử λ = 761 nm tƣơng đƣơng với cực đại hấp thu mẫu đối chiếu λ = 761,8 nm - Khi thêm lƣợng chất đối chiếu vào mẫu thử độ hấp thu mẫu thử A761 = 0,3002 tăng lên A761 = 0,4160 so với trƣớc thêm chất đối chiếu Cao cồn 70% Trâm mốc 9,20 85,54 7,93 7,29 162,39 118,48 Kết thử tác dụng bảo vệ gan in vivo Kết xác định độc tính cấp đường uống cao cồn 70% Cốt khí củ Từ kết khảo s{t độc tính cấp đƣờng uống cao cồn 70%, tính đƣợc liều tối đ khơng gây chết chuột (LD0) 19,5 g/kg thể trọng chuột tƣơng đƣơng 132,5 g dƣợc liệu khô) Kiến nghị liều thử nghiệm 0,9 g/kg (1/22 LD0 tƣơng đƣơng với 6,11 g dƣợc liệu khô/kg thể trọng chuột) 1,8 g/kg (1/11 LD0 v| tƣơng đƣơng với 12,22 g m dƣợc liệu khô/kg thể trọng chuột) Kết khảo s{t h|m lƣợng malonyl dialdehyd (MDA) gan chuột đƣợc trình bày bảng Bảng 7: Kết khảo s{t h|m lượng MDA gan chuột Kết thẩm định quy trình định lượng polyphenol Bảng 5: Kết thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình Từ kết bảng 6, kết luận cao Cốt khí củ có h|m lƣợng polyphenol cao ≈10% Chuyên Đề Dƣợc Nhóm Lơ (n=9) CY (-) Chứng sinh lý Chứng bệnh lý Cao cồn 70% Cốt khí củ 0,9 g/kg Cao cồn 70% Cốt khí củ 1,8 g/kg Silymarin 0,1 g/kg CY (+) Chỉ tiêu Kết ứng dụng quy trình định lƣợng mẫu cao tồn phần Polyphenol (%) IC50 (µg/ml) 10,09 30,67 9,34 33,20 Cao cồn 50% Kim ngân hoa Cao cồn 70% Hòe Kết luận: quy trình đạt độ đặc hiệu Kết Phương trình hồi quy ŷ = 0,0141x + 0,0267 Khoảng tuyến tính Hệ số R = (khoảng nồng độ khảo sát 10,0 – 60,0 μg/ml) Độ lặp lại RSD% hàm lượng polyphenol 2,7 % Độ Tỷ lệ phục hồi 99,86 % Nghiên cứu Y học Hàm lượng MDA (nM/g protein) 30,576 ± 2,023 ** 67,813 ± 2,556 39,842 ± 5,732 # 40,147 ± 2,862 ## 33,089 ± 2,864 ## ** P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý # P < 0,05 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý ## P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý Mẫu thử nghiệm đƣợc cho uống liều 0,9 1,8 g/kg thể trọng chuột ngày chuột bị gây tổn thƣơng g n cyclophosphamid thể tác dụng bảo vệ g n theo hƣớng chống oxy hóa Cụ thể, h|m lƣợng MDA lơ chuột 227 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 uống liều 0,9 1,8 g/kg giảm lần lƣợt là: 41,2%; 40,8% so với l đối chiếu silym rin, h|m lƣợng MDA lô giảm 51,2% BÀN LUẬN Bằng phương pháp quang phổ với thuốc thử DPPH, sàng lọc chọn 5/200 dược liệu có tác dụng chống oxy hóa (S%>80%); nồng độ cồn để chiết cao chiết ảnh hưởng đến khả chống oxy hóa Trong số dược liệu, loại chiết cồn 70% hiệu Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc so với Kim ngân hoa (cồn 50%) Các cao phân đoạn có hoạt tính cao cồn toàn phần, IC50 cao cốt khí củ thấp tương đương với 16% so với vitamin C Kết tương thích với kết xác định hàm lượng polyphenol cao cốt khí củ quy trình đo quang với thuốc thử Folin-Ciocaltue Bảng trình bày kết thử nghiệm chống oxy hóa thuốc thử DPPH Bảng trình bày kết định lượng polyphenol IC 50 mẫu khảo sát Từ kết bảng 2, 6, chọn cao cồn 70% chiết từ dược liệu cố khí củ để khảo sát in vivo hoạt tính bảo vệ gan so sánh với silymarin Mẫu thử thể tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa qua hàm lượng MDA lơ chuột uống liều 0,9 1,8 g/kg giảm là: 41,2%; 40,8% so với lô đối chiếu silymarin, hàm lượng MDA giảm 51,2% 228 Bảng trình bày kết khảo sát hoạt tính bảo vệ gan gây độc cyclophosphamid so sánh với chất đối chiếu silymarin KẾT LUẬN Bằng phƣơng ph{p s|ng lọc hoạt tính chống oxy hoá với thuốc thử DPPH kết hợp với thử nghiệm xây dựng v| định lƣợng polyphenol cao chiết, chúng t i x{c định đƣợc cao chiết cồn 70% củ dƣợc liệu Cốt khí củ (IC50 30,67 µg/ml; P% polyphenol 10%) có tác dụng chống oxy hóa so sánh với chứng dƣơng vit C; từ kết khảo sát in vivo chuột thực nghiệm so với chất đối chiếu silymarin, sơ x{c định tác dụng bảo vệ gan củ dƣợc liệu Cốt khí củ TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, Viện Dƣợc Liệu 2006 , Phƣơng ph{p nghiên cứu tác dụng dƣợc lý từ dƣợc thảo, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 102-110, 174-175, 279-290 Đỗ Trung Đ|m 2014 , Phƣơng ph{p x{c định độc tính cấp thuốc Gi sson I, Ischiropoulos H et l 2002 , “The rel tionship between oxidative/nitrative stress and pathological inclusions in Alzheimer’s nd P rkinson’s dise se”, Free Radical Biology & Medicine, 32 (12), pp 1264-1275 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp 1–13 Rich rd S , Joshu A , M rio GF 2014 , “Ch pter – Antioxid nt C p city of Green Te C melli sinensis ”, Processing and Impact on Antioxidants in Beverages, pp 33–39 Shih-Hua F, Yerra KR, Yew-Min T 2008 , “Anti-oxidant and inflammatory mediator's growth inhibitory effects of compounds isol ted from Phyll nthus urin ri ”, Journal of Ethnopharmacology, 116 (2), pp 333-340 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... thấp, tác dụng loại bỏ gốc tự mạnh, khả chống oxy hóa cao Xây dựng thẩm định quy trình định lượng polyphenol Chọn cao toàn phần c o ph}n đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao khảo sát, tiến hành xây. .. khảo sát Từ kết bảng 2, 6, chọn cao cồn 70% chiết từ dược liệu cố khí củ để khảo sát in vivo hoạt tính bảo vệ gan so sánh với silymarin Mẫu thử thể tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa... dialdehyd (MDA) gan chuột đƣợc trình bày bảng Bảng 7: Kết khảo s{t h|m lượng MDA gan chuột Kết thẩm định quy trình định lượng polyphenol Bảng 5: Kết thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình Từ kết