Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất fucoidan từ một số loài rong nâu phổ biến tại khánh hòa

B CIO V O TAO TR N G DI HC NHA TR A N G NGUYN TH MINH TY NGHIấN CU XY DNG QUY TRèNH SN XUT FUCOIDAN T MT Sể LOI RONG NU PH BIN TI KHNH HềA LUN VN T H C s K TH U T Nha T r a n g -2013 B GIO V O TAO TR N G DI HC NHA TR A N G NGUYN TH MINH TY NGHIấN CU XY DNG QUY TRèNH SN XUT FUCOIDAN T MT Sể LOI RONG NU PH BIẫN TI KHNH HềA LUN VN T H C s K TH U T Chuyờn ngnh : Cụng ngh sau thu hoch Mó s : 60.54.01.04 Ngi hng dn khoa hc: TS V Ngc Bi TS Nguyn Duy Nht Nha T r a n g -2013 LI CAM OAN Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu cựa riờng tụi Cỏc s liu, kt qu nờu lun l trung thc v cha tng c cụng b bt k cụng trỡnh no khỏc Tỏc gi lun Nguyn Th Minh Tựy II LI CM N e hon thnh Lun ny Trc ht tụi xin gi ti Ban Giỏm hiu Trng i hc Nha Trang, Ban Chỳ nhim Khoa Cụng ngh Thc phõm s kớnh trng, nim t ho c hc v nghiờn cu ti trng nhng nm qua S bit n sõu sc nht tụi xin c ginh cho thy: TS V Ngc Bi - Trng khoa Cụng ngh Thc phm v TS Nguyn Duy Nht - Phú phũng Húa phõn tớch v Trin khai Cụng ngh - Vin Nghiờn cu v ng dng Cụng ngh Nha Trang ó tn tỡnh hng dn v ng viờn tụi sut quỏ trỡnh thc hin lun Xin cỏm n quý thy cụ giỏo khoa Cụng ngh Thc phõm v cỏc cỏn b phũng Húa phõn tớch v Triờn khai Cụng ngh - Vin Nghiờn cu v ỳ n g dng Cụng ngh Nha Trang tn tỡnh giỳp v to iu kin cho tụi sut thi gian qua Xin cỏm n cỏc thy cụ phn bin cho tụi nhng li khuyờn quớ bỏu c cụng trỡnh nghicn cu c hon thnh cú cht lng c bit xin c ghi nh tỡnh cm, s giỳp cựa gia ỡnh v bn bố luụn luụn chia s cựng tụi quỏ trỡnh nghiờn cu 111 MC LC Trang LI CAM O A N .i LềI CM N ii MC LC .iii DANH MC CC Kí HIU, CC CH VIT T T .V DANH MC CC B N G vi DANH MC CC HèNH vii M U CHNG 1: TNG QUAN 1.1 GII THIU V RONG N U 1.1.1 c im sinh hc 1.1.2 Phõn b v tr lng rong nõu 1.1.3 Thnh phn húa hc ca rong nõu 1.2 CễNG NGH SAU THU HOCH RONG BIấN 1.2.1 Gii thiu cụng ngh sau thu hoch rong bin 1.2.2 Mt s hin tng h hng ca rong 11 1.2.3 Cỏc bin phỏp bo qun rong khụ 11 1.3 FUCOIDAN .12 1.3.1 Khỏi nim v lựcoidan 12 1.3.2 c im, cu trỳc v cỏc tớnh cht ca ớựcoidan 13 1.3.3 Cụng dng sinh hc cua tựcoidan .15 1.4 CC PHNG PHP CHIT FUCOIDAN TRấN TH G I I 24 1.5 TèNH HNH NGHIấN CU FUCOIDAN VIT N A M 27 CHNG 2: NGUYấN VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU .31 2.1 NGUYấN VT LIU 31 2.2 PHNG PHP NGHIấN c u 31 2.2.1 Phng phỏp phõn tớch húa hc 31 2.2.2 Phng phỏp tỏch chit ớlicoidan 31 2.2.3 B trớ thớ nghim nghiờn cu 35 IV 2.3 DNG C V HểA CHT CH YU .47 2.3.1 Dng c v thit b 47 2.3.2 Húa cht 47 2.4 PHNG PHP X Lí S LIU 48 CHNG 3:KẫT U NGHIấN CU V THAO LUN 49 3.1 NH GI KII NNG THU NHN FUCOIDAN T LOI RONG NU PH BIN KHNH H ề A 49 3.1.1 Thnh phn húa hc c ban cựa loi rong nõu thu mu Khỏnh Hũa 49 3.1.2 Xỏc nh phng phỏp nh lng Ricoidan .50 3.2 XY DNG QUI TRèNH CAI TIấN THU NHN PUCOIDAN T RONG NU 56 3.2.1 Tỏch chit fucoidan t rong nõu S.poớycystum theo qui trỡnh 56 3.2.2 Tỏch chit ớucoidan t rong nõu s.mcclurei theo qui trỡnh 58 3.2.3 Tỏch chit Ricoidan t rong nõu S.oigocystum theo qui trỡnh 60 3.2.4 Xõy dng qui trỡnh ci tin tỏch chit ớiicoidan t rong nõu 64 3.3 XUT QUI TRèNH THU NHN PUCOIDAN V SN XUT TH SN PH M 71 3.3.1 xut qui trỡnh thu nhn tucoidan t rong nõu 71 3.3.2 Sn xut th v dỏnh giỏ hiu qu thu ớucoidan so vi cỏc quy trỡnh hin hnh 75 3.3.3 Xỏc nh s cú mt cựa ớucoidan v d tinh sch ca ớucoidan sn phm 78 KT LUN V ấ XUT í KIN 83 KT LUN : .83 ẩ X U T í K I N 84 TI LIU THAM KHO PH LC V DANH MC CC Kí HIU, CC CH VIẫT TT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome BKC Benzalkonium Chloride C2 V trớ cacbon s cs Cng s Da Dalton DNA Acid Deoxyribo Nucleic ESI-MS Electrospray Ionisation - Mass Spectroscopy EtOH F20 Phõn on fucoidan th 20 FDA Food and Drug Administration GC Gas Chromatography Gr (+) Gram dng Gr (-) Gram am HGF Hepatocvte Growth Factor HIV Human Immunodeficiency Virus IR Infrared spectroscopy KH&CN Khoa Hc V Cụng Ngh L.B.Nga Liờn Ban Nga MWCO Moleculare Weight Cut Off NK Natural Killer NMR Nuclear Magnetic Resonance s Sargassum TCN Tiờu Chun Ngnh TCVN Tiờu Chun Vit Nam T bo B Lympho bo fỡ TFA Triớluoroacetic TLPT Trng Lng Phõn T TMS Tetrametylsilan WHO World Health Organization DANH MC CC BNG Bng 1.1 Cỏc ging loi rong nõu tỡm thy v phõn b [3] Bng 1.2 Din tớch rong nõu mc t nhiờn mt s tnh [3] Bng Anh hng cua iu kin tỏch chit i hiu sut tỏch tựcoidan theo Black (1952) 40 Bang 2.2 Ket qu phn tớch tng quan gia iu kin v hiu sut chit tỡicoidan 40 Bang 2.3 Bng biu din hiu sut liờn h vi nhit , thi gian v p H 41 Bỏng 2.4 Bng biu din hiu sut liờn h vi nhit , thi gian v pH vi mt loi rong khỏc 41 Bng 3.1 Thnh phn húa hc chớnh cua loi rong nõu nguyờn liu 49 Bng 3.2 Hm lng lucose cỏc mu rong nõu v mu ớucoidan tng ng .53 Bng 3.3 Hm lng tucoidan ca cỏc mu rong nõu (tớnh toỏn theo PP1) 53 Bang 3.4 Hm lng tucoidan thu c t cỏc mu rong nõu tớnh toỏn theo PP2 54 Bang 3.5 Hm lng tucoidan thu c t cỏc mu rong nõu tỏch chit v tinh ch theo PP2 v PP3 54 Bang 3.6 Hm lng ớiicoidan thu c t cỏc mu rong nõu s.mccurei, S.poycystum, S.oigocystum tỏch chit v tinh ch theo PP3 55 Bỏng 3.7 Kt quỏ ỏnh giỏ hicoidan thu nhn t rong nõu S.poycystum tỏch chit theo qui trinh khỏc 57 Bỏng 3.8 Kờt qu ỏnh giỏ ớiicoidan thu nhn t rong nõu s.mccurei tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 59 Bng 3.9 Kct qua ỏnh giỏ ớựcoidan thu nhn t rong nõu S.oligocysttn tỏch chit theo phng phỏp khỏc 61 Bang 3.10 Hm lng lựcoidan (gHOOg rong khụ) thu c cỏc ch xay khỏc 64 Nhn xột: 65 Bng 3.11 nh hng cựa cỏc bin dc lp n sn lng lucoidan cụng on xay 66 Bng 3.12 Kt qu phõn tớch phng sai ANOVA sn lng ớucoidan 70 Bng 3.13 Kột qu iu kin ti u cựa quỏ trỡnh 71 Bõng 3.14.1 lm lng hicoidan thụ thu c t rong nõu s.mccurei, S.poycystum, S.oligocystum tỏch chit theo qui trỡnh i chng v qui trỡnh mi (g/1 kg rong khụ) 76 Bng 3.15 Tý l ớựcoidan tinh khit sỏn phm thụ thu c tỏch chit theo qui trỡnh i chng v qui trỡnh mi t cỏc mu rong nõu s.mccurei, S.poycystum, S.oligocysớum .76 Bng 3.16 Hiu sut thu nhn ớucoidan tinh khit (%) tỏch chit theo qui trỡnh di chng v qui trỡnh mi t cỏc mu rong nõu s.mcclureỡ, S.poycystum, S.oligocystum 76 vu DANH MC CC HèNH Hỡnh 1.1 Hỡnh ỏnh rong nõu Hỡnh 1.2 Hỡnh nh v rong s m cclurei .8 I lỡnh 1.3 Hỡnh nh v rong S.polycystum Hnh 1.4 Hỡnh nh v rong S.olygocystum .9 Hỡnh 1.5 ui trỡnh cụng ngh sau thu hoch rong biờn Vit Nam 10 I lỡnh 1.6 Cu trỳc ớỡicoidan t Fucus vesiculosus mụ tỏ vo nm 1950 [47] .13 Hnh 1.7 Cu trỳc t Fucus anescens [43] 14 Hỡnh 1.8 Cu trỳc fucoidan t Fucus distichus L [42] 14 Hỡnh 1.9 Cu trỳc fucoidan t Fucus scrratus [4 ] .14 Hỡnh 1.10 Cu trỳc fucoidan t Ascophyllum nodosum [44] 15 Hỡnh 1.11 Hỡnh nh rong nõu v cỏc sn phm fucoidan 15 Hỡnh 1.12 Hỡnh anh v cụng thc cu trỳc ca fucoidan kt qu o ESI-MS ion dng cựa mt on phõn on fucoidan F20 t rong s swartzzii 29 Hỡnh 2.1 Qui trỡnh chit fucoidan ca Vin Nghiờn cuv n g dng 32 Hỡnh 2.2 Qui trỡnh chit fucoidan theo bỏn quyn EP0645143A1 34 Hỡnh 2.3 B trớ thớ nghim tỏch chit fucoidan theo qui trỡnh 38 Hỡnh 2.4 S ũ b trớ thớ nghim sn xut th v ỏnh giỏ hiu quỏ thu fucoidan so vi qui trỡnh hin hnh 47 Hỡnh 3.1 Sc ký GC ca hexaacetat glucitol v sỏc ký dũ GC ca cỏc dng chun 51 Hỡnh 3.2 Sc kv ca cỏc sn phm thy phõn fucoidan ca s.mcclurei v S.polycystum 51 Hỡnh 3.3 Sc ký d ca cỏc sn phm thỳy phõn rong nõu s.mcclurei, S.polycystum 52 Hỡnh 3.4 S bin ụi hm lng fucoidan thu nhn t cỏc mu rong nõu s.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum tỏch chit v tinh ch theo P P 55 Hỡnh 3.5 S thay i t l fucoidan tinh khit cỏc mu sn phm fucoidan thụ thu nhn t rong nõu s polycystum tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 57 I lỡnh 6.1liu sut thu nhn ớỡicoidan tinh khit t rong nõu S.polvcystum tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 58 Hỡnh 3.7 S thay ụi t l fucoidan tinh khit cỏc mu san phm fucoidan thụ thu nhn t rong nõu s.mcclurei tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 59 Hỡnh 3.8 Hiu sut thu nhn fucoidan tinh khit t rong nõu s.mcclurci tỏch 60 chit theo qui trỡnh khỏc 60 V I11 Hỡnh 3.9 S thay ụi t l fucoidan tinh khit cỏc mu san phm fucoidan thụ thu nhn t rong nõu S.oligocystum tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 61 Hỡnh 3.10 Hiu sut thu nhn ớucoidan tinh khit t rong nõu S.oligocystum 62 tỏch chit theo qui trỡnh khỏc 62 Hỡnh 3.11 Hm lng ớucoidan thu c theo cỏc ch xay khỏc 65 Hỡnh 3.12 Cỏc biu thờ hin mc nh hng v mi tng quan gia cỏc yu t n hm lng fucoidan tinh khit thu c 69 Hỡnh 3.13 Qui trỡnh sỏn xut fucoidan 72 Hỡnh 3.14 T l ớucoidan tinh khit (% so vi sn phm thụ) thu dc tỏch chit theo qui trỡnh i chng v qui trỡnh mi t cỏc mu rong nõu s.mcclurei, S.polycystum, S.oigocystum .77 Hỡnh 3.15 Hiu sut thu nhn fucoidan tinh khit (%) tỏch chit theo qui trỡnh ụi chng v qui trỡnh mi t cỏc mu rong nõu s.mcclurei, S.polycystuiT S.oligocystum 77 Hỡnh 3.16 Phụ cng hng t ht nhõn proton ca cỏc mu ớucoidan thu t loi rong nõu s.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum 81 75 chng t dch lc ang cũn tn ti ion Ca2 ng ngha vi vic ht nha no khụng cũn cú kha nng hp th ion Ca2 t dch lc c na Vỡ vy phi tin hnh cỏc ht nha qua dung dch acid HC1 long Khi ú ion Ca2 trờn b mt cỏc ht nha số i chỳng to mui vi cr dung dch HC1 Nh vy n cụng on ny cỏc ion kim loi nng khụng cn thit ó b loi bũ ngoi Trung h ũ a : Trung hũa dch lc, a dch lc v pH=7, vỡ ti pll=7 thỡ fucoidan mi tựa trit cn K c t t a : Nh d bit cn l mt dung mụi phõn cc hỏo nc nờn s dng chỳng kt ta fucoidan Trong dch chit lỳc ny cũn cha mt phan laminaran cha b loi b M tinh cht ca laminaran l kt ta cn n nũng d 85% (v/v) tr lờn (tc l sau tua nng cũn ca dung dch tụng thờ l 85% (v/v)), cũn fucoidan ta khoỏng nng cn l 65 - 70% (v/v) Tin hnh cho cn 96% (v/v) vo dch rong vi t l cn/dch l 2/1, lỳc ny nng o c bng thit b o cn l 65% (v/v) Nh vv kt ta thu c l fucoidan ch khụng cú laminaran Sau dú quy mnh tay cn tip xỳc vi dch lm cho quỏ trỡnh kt tỳa xõy nhanh hn Kt ta cú mu nõu, kt bụng ln, lng xung ỏy L y tõ m : Sau thu c kt ta thỡ mt thi gian cho kt ta lng xung ỏy, sau ú tin hnh ly tõm, gn lp cụn phớa trờn i (cú th dựng c chng cõt thu hi cn cao ), cũn kt ta thỡ c thu li Sy k t tu a : Tin hnh sy kt tua t sy nhit 50c v thi gian 18 gi, sy n t khụ giũn thỡ kt thỳc, thu dc sỏn phm fucoidan tinh 3.3.2 S n x u t t h v ỏ n h giỏ h i u q u th u fu c o id a n so vúi cỏc q u y tr ỡn h h i n h n h Sau ti u húa cụng on xav chit ca quy trỡnh mi v hon thin quy trỡnh, tin hnh sỏn xut th nghim trờn loi rong nõu s.mcclurei, S.poycystum, S.oligocvsum theo quy trỡnh xay chit mi v quy trỡnh i chng (qui trỡnh tỏch chit fucoidan bng nc v CaCl2 ca bn quyn EP0645143A1), tin hnh mu thớ nghim vi loi rong theo qui trỡnh, mi mu thớ nghim s dng Ikg rong khụ thu nhn fucoidan Cỏc mu thớ nghim u lp li ln, kt qu trung bỡnh chung gia cỏc ln thớ nghim Sau thu nhn fucoidan tin hnh sy khụ n trng lng khụng i v cõn nh lng hm lng fucoidan thụ Sau ú, tin hnh nh lng fucoidan tinh khit sn phm fucoidan thụ bng phng phỏp 3(PP3) [27] v tớnh hiu sut thu nhn ớucoidan tinh khit Sau ú, tin hnh xỏc nh s cú mt cựa fucoidan 76 sn phm Kct qu lng tỡicoian thu c ca tng loi rong theo quy trỡnh c th hin trone bng 3.14, bng 3.15, bỏng 3.16, hỡnh 3.14 v hỡnh 3.15 B iing 3.14 H m lu n g ớu c o id a n th ụ th u tr c t r o n g n õ u s.mcclurey S.polycystum} SLoiigocystum k h i tỏ c h c h i t th e o q u i tr ỡ n h i c h n g v q u t r ỡ n h m i (g/1 k g r o n g k h ụ ) Q u i trỡn h S n p h m ớu c o d a n th ụ /1 k g r o n g k h ụ (g ) s.mccurei S.poỡycystum S.oigocystum Qui trỡnh i chng 13,3 35,8 32,4 Qui trỡnh mi 13,5 36,2 32,4 B n g 3.15 T l u c o id a n tin h k h i t tro n g sn p h ỏ n i th ụ th u u c tỏ c h chit th e o qui tr ỡn h oi c h n g v q u i trỡn h m t cỏc m u ro n g n õ u Q u y trỡn h s.mcclurei, S.poycystU, S.oligcystum T l u c o d a n t r o n g s n p h m t h ụ ( % ) s.mcclurei S.poớycystum S.oligocystum Qui trỡnh i chng 90,68 91,5 90,3 Qui trỡnh mi 96,5 97,1 96,8 B n g 3.16 H i u s u t th u n h n ớu c o id a n tin h k h i t ( % ) k h i tỏ c h c h i t th e o q u i tr ỡn h i c h ỳ n g v q u tr ỡ n h m ú i t cỏc m u r o n g n õ u Q u y trỡn h s.mcclurei, S.poiycystum, S.oligocystum H i u s u t t h u n h n u c o d a n t i n h k h i t ( % ) s.mccurei S.poycystum S.oỡigocystum Qui trỡnh i chng 90 90,74 90,58 Qui trỡnh mi 97,22 97,37 97,1 77 Qui trinh i chng Qui trinh mi s.mcclurei S.polycystum S.oligocystum Loi rong H ỡn h T l ớu c o id a n tin h k h i t ( % so v ú i s n p h m th ụ ) th u c k h i tỏ c h c h i t th e o q u i t r ỡ n h d i c h n g v q u i t r ỡ n h m ú i t c ỏ c m u r o n g n õ u s.mcclurei, S.poycystum, s.oigocystum 100 -t 2202 _ 9202 m Qui trinh ụi chng Qui trinh mi s.mcclurei S.polycystum S.oligocystum Loi ro n g H ỡn h 3.15 H iu s u t th u n h n ớu c o id a n tin h k h i t ( % ) k h i tỏ c h c h i t th e o q u trỡn h di c h ỳ n g v q u trỡn h m ú i t cỏc m u ro n g n õ u s.mccurei, S.olycystum, S.oigocystum 78 N h n x ộ t: T kột qua thu nhn fucoidan t loi rong nõu thu mu ti tnh Khỏnh Hũa theo quy trỡnh i chng (qui trỡnh tỏch chit ớucoidan bng nc v CaC2 theo bn quyn EP0645143A1) v quy trỡnh xay chit mi dc trinh by bỏng 3.14, bng 3.15, bng 3.16, hỡnh 3.14 v hỡnh 3.15, cho thy t l lucoidan tinh khit sn phm ớucoidan thụ thu dc theo quy trỡnh chit tỏch mi trờn c loi rong s.mcclurei, s polycystum, S.oigocystum cao hn so vi quy trỡnh i chng Chng t ớucoidan thu c theo quy trỡnh mi sch hn V hiu sut thu nhn ớucoidan tinh khit theo quy trỡnh chit tỏch mi trờn ca loi rong s.mccurei, S.poỡycystum, S.oligocystum cao hn so vi quy trỡnh i chng Vỡ qui trỡnh xay chit mi s dng cỏc thụng s thớch hp hn v ci tin cụng on nu chit thnh xay chit Qui trỡnh xay chit b sung thờm cụng on xay rong lm phỏ v cu trỳc rong nhanh hn, cỏc cht thoỏt nhanh hn, d dng hn nờn lm rỳt ngn thi gian nu, nhit nu, nõng cao hiu sut thu hi tucoidan v ũng thi iu quan trng nht l giỳp ớucoidan gi c hot tớnh sinh hc khụng b tỏc ng bi thi gian nu chit lõu Nh vy, t l /ucoỡdan tinh khit sn phm /ucoỡdan thụ v hiu sut thu nhn /ucoidan tinh khit thu c theo quy trỡnh chit tỏch mi mi trờn c loi rong s.mccureỡ, S.povcystum, S.oigocystum cao hn so vi quy trỡnh oi chng Loi rong S.poycystum chit sut vi qui trỡnh xay chit mi cho sỏn phõm tucoidan thụ cao nht l 36,2g/lkg rong khụ, t hiu sut thu nhn ớucoidan cao nht l 97,37% so vi loi rong nõu s.mcclurei, S.oligocystum v t hiu sut thu nhn ớucoidan tinh khit cao nht l 97,1% (so vi ớucoidan thụ) Nh vy, loi rong th nghim thỡ loi rong S.polycystum cho hm lng ucoidan cao nht v chit hang phng phỏp xay chit mi cho hiu sut tnh theo ucoỡdan tinh v sch ca fucoifan trờn loi rong ny cao nht Vỡ vy, cỏc loi rong nõu phụ hin ti Khỏnh Hũa nờn ng dng loi rong S.poycvstum nuụi v sõn xut fu coidan thu dc hiu qu kinh t cao hn 3 X ỏ c n h s cú m t c a ớu c o id a n v d tin h s c h c a ớu c o id a n tr o n g s n p h n i Tin hnh o ph HNMR di vi mu ớucoidan thu c t mu rong nõu s mcclurei, S.polvcystum, S.oligocystum ti Khỏnh Hũa theo phng phỏp xay chit mi khng nh sn phõm thu c l ớucoidan v kim tra tinh sch ca tucoidan Kt qu thu c th hin hỡnh 3.16 79 5SssS2s?r ^ r - v - t -1 N *H* :*IPằi* rợmằ www* IV T u iM ttri ***o ôV r Iôl S MM 2*1ẻ