Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm lựa chọn vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 kháng CD20 và xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20. Bài viết nghiên cứu nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt, gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS (2001), phương pháp ELISA và Western blot.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 SÀNG LỌC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20 Trần Minh Đạo*; Phạm Thu Thùy*; Lê Quang Huấn** TÓM TẮT Mục tiêu: lựa chọn vector biểu kháng thể scFv-CH2 kháng thể tạo có khả liên kết với kháng nguyên CD20 Phương pháp: nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt, gắn gen anti-CD20Fa vào vector biểu pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp biểu protein (kháng thể) tiến hành theo Sambrook CS (2001), phương pháp ELISA Western blot Kết quả: gen anti-CD20Fa gắn vào vector vector có khả biểu scFv-CH2 Tuy nhiên, vector pET28a biểu kháng thể scFv-CH2 kháng thể có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao so với vector pET28a pET30GB1 Kháng thể scFv-CH2 tạo có khả liên kết với kháng nguyên CD20 thương mại CD20 biểu tế lympho B ác tính dòng Raji Kết luận: vector pET28a, pET30GB1 MPB có khả biểu scFv-CH2 Tuy nhiên, vector pET28a lựa chọn làm vector biểu scFv-CH2 Kháng thể scFv-CH2 tạo có khả liên kết với kháng nguyên CD20 thương mại CD20 biểu tế lympho B ác tính dòng Raji * Tõ khãa: Sàng lọc vector; Kháng thể scFv-CH2; Kháng CD20 Screening Vector System Expressed Anti-CD20 scFv-CH2 Antibody Summary Objectives: To screen vector expressing anti- CD20 scFv-CH2 antibody and this antibody can associate with anti-CD20 the best Methods: Using the methods of cutting, ligating anti-CD20Fa gene to expression vector pET28a, pET30GB1, MPB; transformation, plasmid DNA extraction and protein expression methods (antibody) were carried out according to Sambrook et al (2001) and ELISA, Western blot method Results: The anti-CD20Fa gene attached to three vectors and vectors have the ability to express scFv-CH2 However, the vector pET28a expressed scFvCH2 antibody the best compared to the vector MPB and pET30GB1 scFv-CH2 antibody can associate with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji) Conclusions: vectors pET28a, pET30GB1 and MPB have the ability to express scFv-CH2 However, pET28a vector is selected as the expression vector scFv-C H This antibody potentially associated with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji) * Key words: Vector screening; scFv-CH2 antibody; Anti-CD20 * Bệnh viện 19.8 ** Viện Công nghệ Sinh học Người phản hồi (Corresponding): Trần Minh Đạo (daohuy2003@yahoo.com) Ngày nhận bài: 26/12/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 13/01/2015 Ngày báo đăng: 02/03/2015 150 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng thể scFv khắc phục số nhược điểm kháng thể đơn dòng, hạn chế tối đa tượng HAMA (mAb có nguồn gốc từ chuột vào thể không - Lựa chọn vector biểu kháng thể scFv-CH2 kháng CD20 - Xác định khả liên kết kháng thể scFv-CH2 với CD20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU tương hợp với hệ miễn dịch người, khiến thể sinh kháng thể chống lại nó) kích Vật liệu nghiờn cứu thước nhỏ scFv thuận lợi thâm nhập - Chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3), biểu vào mơ đích [5, 6] Tuy nhiên, scFv lại có vector hạn chế khả liên kết với kháng (Novagen) vector MPB Phòng Cơng ngun tính nhạy yếu phản ứng hóa nghệ Tế bào động vật cung cấp Các mồi Fa miễn dịch (ELISA) [8] scFv có gắn thêm vùng CHR thiết kế để khuếch đại đoạn gen định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) anti-CD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2 khắc phục hạn chế này, tăng độ bền chứa trình tự nhận biết enzym giới hạn kháng thể Fc có vai trò quan trọng BamHI XhoI có trình tự cụ thể sau: việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua pET28a, pET30GB1 Fa: ATGGGAGCCTGGATCCGTATTATCTC chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể BamHI (CDC), hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế CHR: CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTATAG XhoI bào thông qua chế ADCC gây chết tế bào theo chương trình [10] CD20 kháng nguyên xuất 90% tế bào lympho B ác tính xuất khoảng 85 - 90% bệnh nhân lympho bào nonHodgkin khơng dễ dàng bị đồng hóa hay biến dạng gắn với kháng thể [3] CD20 đích tiềm liệu pháp điều trị bệnh liên quan đến tế bào lympho B ác tính [2, 7] Hiện có số hệ vector biểu protein (hay kháng thể) E coli như: hệ vector pET, pDEST, pASK-IBA… Tuy nhiên, phụ thuộc vào protein đích để lựa chọn hệ vector, hệ pET sử dụng phổ biến biểu protein E coli với gen đích vector biểu mức độ khác Vì vậy, nghiên cứu tiến hành nhằm: 151 Enzym BamHI, XhoI T4-ligase (New England Biolabs) Môi trường nuôi cấy E coli LB (tryptone, NaCl, cao nấm men agar mơi trường thạch) hóa chất khác sử dụng sinh học phân tử công nghệ gen Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp cắt, gắn sản phẩm PCR vào vector biểu pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp biểu protein tiến hành theo Sambrook CS (2001) [9] Phản ứng Western blot xác định hoạt tính liên kết kháng thể scFv-CH2 tạo với kháng thể cộng hợp kháng histidine Phản ứng ELISA xác định hoạt tính liên kết kháng thể scFv-CH2 tạo với CD20 thương mại (SB) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 CD20 dòng tế bào lympho B ác tính dòng Raji Học viện Qn y cung cấp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Nhân dòng vector biểu scFvCH2 vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu lựa chọn để gắn gen anti-CD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2, vector có sẵn đoạn trình tự gen mã hóa cho histidine hai đầu gen đích sau gắn vào, thuận tiện cho việc thu nhận, tinh nhận biết kháng thể scFv-CH2 Gen anti-CD20Fa tinh gel theo kit (Hãng QIAGEN), sau cắt BamHI XhoI Các vector pET28a, pET30GB1 MBP cắt BamHI XhoI Tạo vector tái tổ hợp cách đem gắn gen anti-CD20Fa vào vector xử lý với BamHI XhoI Các vector biến nạp vào chủng DH5α nhân lên lượng lớn Sử dụng PCR để chọn dòng từ khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp lấy khuẩn lạc) để PCR với cặp mồi tương ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1: T7F/R; MBP: Fa/C H R) Khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa) pET30GB1/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ khuẩn lạc cho kích thước gần 200 bp mồi T7 cộng với kích thước gen anti-CD20Fa khoảng 1.000 bp xấp xỉ 1.200 bp Khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ khuẩn lạc cho kích thước với kích thước gen anti-CD20Fa khoảng 1.000 bp 152 Hình 1: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen anti-CD20Fa gắn vào vector biểu M: marker ADN; 1, 2: khuẩn lạc chứa vector MBP; 3, 4: khuẩn lạc chứa vector pET30GB1; 5, 6: khuẩn lạc chứa vector pET28a Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đường chạy số 1, 2) có băng kích thước khoảng 1.000 bp, khuẩn lạc chứa vector pET30GB1 (đường chạy số 3, 4) khuẩn lạc chứa vector pET28a (đường chạy số 5, 6) có băng kích thước ~ 1.200 bp Kết phù hợp với tính tốn lý thuyết Như vậy, gen anti-CD20Fa gắn vào vector biểu (pET28a, pET30GB1 MBP) Biểu kháng thể scFv-CH2 hệ vector plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa, pET30GB1/anti-CD20Fa MBP/anti-CD20Fa) biến nạp vào tế bào E coli BL21, nuôi biểu 37oC có bổ sung Ka (50 µg/ml) chất cảm ứng IPTG (0,5 mM) Các mẫu cảm ứng IPTG (đường chạy số 2; 4; 6) xuất băng protein có kích thước tương ứng (pET28a: ~ 43 kDa; pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), mẫu khơng cảm ứng (đường chạy số 1; 3; 5) không thấy xuất băng Các băng protein xuất khả protein tái tổ hợp đích cần biểu Như vậy, vector tái tổ hợp có khả biểu kháng thể tái tổ hợp đích TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Theo thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn thêm histidine đầu Dựa vào đặc điểm này, xác định hoạt tính liên kết kháng thể scFv-CH2 tạo với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidie Vector pET28a (đường số 1) vector pET30GB1 (đường số 2) xuất băng kích thước nằm khoảng 40 - 55 kDa Tuy nhiên, kích thước protein đường số (~ 43 kDa) thấp xuất đậm đường số (~ 50 kDa), vector MBP (đường số 3, 4) khơng xuất băng kích thước ~ 85 kDa theo tính tốn lý thuyết Hình 2: Ảnh điện di biểu gen mã hóa scFv-CH2 vector M: marker; pET28a (1: Trước cảm ứng; 2: Sau cảm ứng) pET30GB1 (3: Trước cảm ứng; 4: Sau cảm ứng) MBP (5: Trước cảm ứng; 6: Sau cảm ứng) Chọn vector biểu scFv-CH2 Các vector có khả biểu protein tái tổ hợp Tuy nhiên, để lựa chọn vector biểu kháng thể scFv-CH2 có hàm lượng cao nhất, cần tiến hành phản ứng Western blot Như vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao so với vector MBP, pET30GB1 Mặt khác, kháng thể tạo từ pET28a không gắn đoạn protein dung hợp nên sau tinh protein loại bỏ phần protein dung hợp mà tiến hành nghiên cứu chẩn đoán bệnh Sau sơ kiểm tra khả biểu xác định hoạt tính kháng thể phản ứng Western blot, thấy vector tái tổ hợp pET28a/anti-CD20Fa biểu tốt có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao so với vector pET30GB1/antiCD20Fa MBP/anti-CD20Fa Vì vậy, pET28a lựa chọn làm vector biểu gen anti-CD20Fa * Xác định khả liên kết scFv-CH2 với CD20: Hình 3: Hình ảnh Western blot kháng thể scFv-CH2 vector biểu M: Marker protein; 1: pET28a; pET30GB1; 3, 4: MBP 153 2: Một số nhà khoa học sử dụng phương pháp ELISA để xác định khả liên kết kháng thể kháng CD20 tạo với CD20 tế bào lympho B ác tính dòng Raji hay dòng Daudi Anna [1], Geng [4] Fang [2] TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Tương tự, xác định khả liên kết kháng thể scFv-CH2 tạo với CD20 ELISA cạnh tranh Phản ứng ELISA gồm scFv-C H 2, kháng nguyên CD20 tái tổ hợp thương mại (SB) tế bào ung thư máu dòng lympho B có biểu CD20 (Raji) Học viện Quân y cung cấp A Giá trị OD B Hình 4: Hình ảnh tế bào lympho B kết ELISA xác định khả liên kết kháng thể scFv-CH2 với CD20 A: Hình ảnh tế bào lympho B biểu CD20 ác tính kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 400 lần) B: Biểu đồ kết ELISA xác định khả liên kết kháng thể scFv-CH2 với 154 kháng nguyên CD20 thương mại CD20 tế bào lympho B (Raji) TN1 - TN6: Thí nghiệm - thí nghiệm Kết ELISA cạnh tranh cho thấy, thí nghiệm khơng có kháng thể scFv-CH2 xuất màu có giá trị OD450nm tương ứng 0,185 0,165 Các thí nghiệm 1, (TN1, TN5) có kháng thể scFv-CH2 không xuất màu (OD450nm tương ứng 0,059 0,06) thí nghiệm đối chứng (TN3 TN4) không xuất màu (OD450nm tương ứng 0,056 0,061) thấp nhiều thí nghiệm Như vậy, qua phản ứng ELISA khẳng định kháng thể scFv-CH2 tạo có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương mại CD20 tế bào lympho B ác tính dòng Raji Kết chúng tơi tương tự nghiên cứu Anna, Geng Fang tạo kháng thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc scFv-LDP kháng CD20, kháng thể có hoạt tính liên kết với CD20 Tuy nhiên, nghiên cứu này, gen mã hóa scFv tách dòng từ ARN tủy gà gây miễn dịch với CD20, gen mã hóa scFv-CH2 gắn vào vector biểu pET28a ScFv-CH2 có khối lượng ~ 43 kDa biểu E coli (BL21), tinh cột sắc ký lực Ni2+, có khả liên kết với CD20 thương mại (SB) CD20 dòng tế bào Raji KẾT LUẬN Gen anti-CD20Fa mã hóa cho kháng thể scFv-CH2 gắn vào vector biểu Cả vector biểu pET28a, pET30GB1 MBP có khả biểu kháng thể scFvCH2 Vector pET28a lựa chọn làm vector biểu scFv-CH2 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Kháng thể scFv-CH2 tạo có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương mại CD20 tế bào lympho B ác tính dòng Raji TÀI LIỆU THAM KHẢO Anna M.W, Giselle J.T, Mark A.S Clarke P, Olafsen T, Stephen J.F, and Andrew A.R Multimerzation of a chimeric anti-CD20 singlechain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange Protein Engineering 2001, 14(12), pp.1025-1033 Fang Hong, Miao Qing Fang, Zhang ShengHua, Cheng Xin, Xiong DongSheng, Zhen YongSu Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin Life Sciences China 2011, 54 (3), pp.255-262 Fisher R.I Overview of non-Hodgkin's lymphoma: biology, staging, and treatment Seminars in Oncology 2003, 30 (2 - 4), pp.3-9 Geng S, Feng J, Li Y, Sun Y, Gu X, Huang Y, Wang Y, Kang X, Chang H, and Shen B Binding activity difference of anti-CD20 scFv-Fc fusion protein derived from variable domain exchange Cellular and Molecular Immunology 2006, (6), pp.439-443 155 Hagemeyer C.E, Muhlen C.V, Elverfeldt D.V, Peter K Single-chain antibodies as diagnostic tools and therapeutic agents Thrombosis and Haemostasis 2009, 101, pp.1012-1019 Kipriyanov S.M, Moldenhauer G, Schuhmacher J, Cochlovius B, Vonder Lieth C.W, Matys E.R, Little M Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics Molecular Biology 1999, 293 (1), pp.41-56 Lim SH, Beers SA, French RR, Johnson PWM, GlennieMJ and Cragg MS Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives Haematologica 2010, 95, pp.135-143 Reff M.E, Heard C A review of modifications to recombinant antibodies: attempt to increase efficacy in oncology applications Critical Reviews in Oncology Hematology 2001, 40, pp.25-35 Sambrook J, Russell D.W Molecular cloning A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 2001 10 Scott A.M, Allison J.P and Wolchok J.D Monoclonal antibodies in cancer therapy Cancer Immunity 2012, 12, pp.1-8 ... gắn vào vector biểu Cả vector biểu pET28a, pET30GB1 MBP có khả biểu kháng thể scFvCH2 Vector pET28a lựa chọn làm vector biểu scFv-CH2 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Kháng thể scFv-CH2. .. ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng thể scFv khắc phục số nhược điểm kháng thể đơn dòng, hạn chế tối đa tượng HAMA (mAb có nguồn gốc từ chuột vào thể không - Lựa chọn vector biểu kháng thể scFv-CH2 kháng CD20 - Xác... pET30GB1/antiCD20Fa MBP/anti-CD20Fa Vì vậy, pET28a lựa chọn làm vector biểu gen anti-CD20Fa * Xác định khả liên kết scFv-CH2 với CD20: Hình 3: Hình ảnh Western blot kháng thể scFv-CH2 vector biểu M: Marker