Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen Cry2Ab3 có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương Etiella zinkenella

Sâu đục quả đậu tương Etiella zinkenella Treitschke là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất, chất lương đậu tương. Bài viết trình bày việc thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen Cry2Ab3 có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương Etiella zinkenella.

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN cry2Ab3 CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG SÂU ĐỤC QUẢ ĐẬU TƯƠNG Etiella zinkenella Nguyễn Hữu Kiên1, Nguyễn Thị Hòa1, Lê Thị Mai Hương1, Nguyễn Trung Anh1, Đinh Thị Mai Thu1, Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Lê Thị Minh Thành2, Nguyễn Văn Đồng1* TÓM TẮT Sâu đục đậu tương Etiella zinkenella Treitschke nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng đến suất, chất lương đậu tương Mặc dù việc tạo giống trồng biến đổi gen kháng sâu mang gen cry phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) nghiên cứu thành công nhiều đối tượng trồng khác đậu tương hạn chế Nghiên cứu thực với mục tiêu thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3 dạng dại cải biến phân lập từ chủng Bt BD8.2 địa Việt Nam Kết nghiên cứu cung cấp vật liệu di truyền phục vụ cho việc chuyển gen vào đậu tương nhằm tăng khả kháng sâu đục Etiella zinkenella Từ khóa: Bacillus thuringiensis, cry2Ab3, đậu tương, Etiella zinkenella, vector pZY101-Asc ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu đục Etiella zinkenella Treitschke côn trùng thuộc cánh vảy (Lepidoptera) biết tới đối tượng phân bố rộng khắp giới gây hại nhiều loài trồng khác nhau, đặc biệt đậu tương non nguồn thức ăn ưa thích chúng Cụ thể, suất đậu tương Iran bị thiệt hại sâu đục đến 40%, Đài Loan 10-15%, Philipines 57%, Indonesia lên tới 80% (Berg et al., 1998) Để hạn chế tác hại sâu đục trồng, số biện pháp phịng trừ sâu hại sử dụng phổ biến thuốc trừ sâu hóa học, sinh học côn trùng thiên (Kumar et al., 2008; Tabata et al., 2008; USDA, 2012) Trong đó, thuốc trừ sâu hóa học biện pháp đem lại hiệu cao Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học làm ảnh hưởng tới nhiễm mơi trường, lồi thiên địch có ích đặc biệt sức khỏe người Để cải thiện vấn đề này, việc phát triển giống trồng có khả kháng sâu đục kỹ thuật di truyền chuyển gen vào thực vật hướng đầy hứa hẹn Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Email: dongjircas@yahoo.com 16 Hiện nay, có nhiều gen kháng/diệt trùng gây hại chuyển vào trồng có nguồn gốc từ động vật, thực vật vi sinh vật Trong đó, chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đối tượng nghiên cứu nhiều số tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng Khoảng 800 gen mã hoá cho độc tố Bt chúng phân loại thành 80 họ Các loại độc tố Bt có khác tính đặc hiệu loại côn trùng thuộc Cánh vảy, Hai cánh, Cánh cứng, Cánh ngửa, Tuyến trùng, (Crickmore et al., 2013) Từ gen mã hóa protein độc tố Bt lần tách dòng giải trình tự năm 1981 hàng loạt gen mã hóa protein độc tố Bt Cry (crystal endotoxin), Cyt (Cytolysin), Vip (Vegetative Insecticidal Protein) số độc tố khác hemolysin, enterotoxin, chitin nghiên cứu đặc tính diệt trùng chúng Trong đó, Cry họ độc tố quan trọng ứng dụng nhiều sản xuất thuốc trừ sâu Bt chuyển gen vào trồng để kháng sâu Các gen cry phân loại dựa hoạt tính diệt trùng đặc hiệu tương đồng chuỗi nucleotide Trên sở này, gen cry protein tinh thể độc tố diệt sâu chia làm nhóm chính: (1) Gen cry1 mã hố protein cry1 có trọng lượng phân tử 130140 kDa độc côn trùng cánh vảy; (2) Gen cry2 mã hoá tiền độc tố có khối lượng phân tử 6971 kDa có hoạt lực với ấu trùng cánh vảy (Cry2B) hai cỏnh (Cry2A); (3) Gen cry3 mó Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 4/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ hố tổng hợp protein 73-74 kDa diệt trùng cánh cứng; (4) Gen cry4 mã hố tổng hợp protein có khối lượng phân tử 135, 128, 74 72 kDa diệt ấu trùng thuộc hai cánh; (5) Gen cry5 tổng hợp độc tố 80 kDa diệt côn trùng cánh vảy cánh cứng; (6) Gen cry6 xếp vào nhóm gen diệt tuyến trùng (Crickmore et al., 2013) Kết nghiên cứu (số liệu chưa công bố) rằng, gen cry2Ab3 biểu vi khuẩn Escherichia coli (E coli) protein Cry2Ab3 sản sinh tiêu diệt sâu đục đậu tương điều kiện nhân tạo Dựa sở đó, nghiên cứu chỉnh sửa gen cry2Ab3-wt (dạng dại) ban đầu nhằm tạo gen cry2Ab3-cb (cải biến) có khả tương thích với hệ gen đậu tương tốt hơn; sau đó, thiết kế cấu trúc vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3-wt cb để phục vụ cho việc chuyển gen gen vào đậu tương nhằm tăng cường khả kháng sâu đục chuyển gen cry2Ab3-wt cb VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Gen cry2Ab3-wt nhóm nghiên cứu Viện Nghiên cứu Hệ gen phân lập từ chủng vi khuẩn Bt BD8.2 Việt Nam nhân dòng Vector pJET1.2 Vector pRTL2 pZY101-Asc Trung tâm Quốc gia Công nghệ sinh học – Trường Đại học Missouri, Hoa Kỳ cung cấp Các vật liệu nghiên cứu lưu giữ Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Cải biến gen cry2Ab3 Để cải biến gen cry2Ab3, công cụ OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) sử dụng kết hợp với tỷ lệ phần trăm ba mã hóa tối ưu cho gen đậu tương trang web (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- STT Tên mồi 2Ab3cb-Syt-F 2Ab3cb-Syt-R pUC19-F pUC19-R 2Ab3cb-Seq1 bin/showcodon.cgi?species=3847) để chỉnh sửa ba mã hóa gen cry2Ab3-wt ban đầu 2.2.2 Tổng hợp nhân tạo tách dòng gen cry2Ab3-cb Gen cry2Ab3-cb có kích thước 1902 bp chia thành đoạn ngắn ~75 nucleotide tổng hợp frit tổng hợp gen theo công nghệ Công ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam) Đoạn DNA gen cry2Ab3-cb khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi 2Ab3cb-Syt-F/2Ab3cb-Syt-R có chứa 25 nucleotide tương đồng với đầu biên (đã gắn vào đầu 5’ 3’ đoạn gen cry2Ab3-cb tổng hợp) vector pUC19 (Bảng 1) enzyme PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Tiếp theo, sản phẩm PCR tinh trực tiếp kit PCR Purification (Jena Bioscience, Đức) sử dụng cho phản ứng nối vào vector pUC19 (đã xử lý enzyme giới hạn SmaI trước đó) theo quy trình eClone Cơng ty Sinh hóa Phù Sa, với thành phần phản ứng: Vector pUC19 100 ng, sản phẩm PCR 300 ng, dung dịch đệm eClone 1,5 µl, enzyme eClone 1,0 µl, nước cất lần với tổng thể tích 15 µl Phản ứng ủ 37oC 15 phút đặt đá để sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn E coli Top10 phương pháp sốc nhiệt Sau đó, dịch khuẩn cấy trải nuôi qua đêm đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Ampicillin 37oC Các khuẩn lạc vector tái tổ hợp pUC19:cry2Ab3-cb mọc đĩa mơi trường có chứa kháng sinh lựa chọn để kiểm tra PCR cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1) sử dụng kit PCR EZ mix-tracking dye (Cơng ty Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản xuất Các khuẩn lạc dương tính với PCR lựa chọn đem nuôi tăng sinh khối mơi trường LB lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin qua đêm 37oC tách chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, Đức) Các DNA plasmid pUC19:cry2Ab3-cb giải trình tự với cặp mồi pUC19-F/R 2Ab3cb-Seq1/2 (Bảng 1) Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Trình tự (5’-3’) GCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCC TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA CCACTTAGCATTACCTCTAGTG Mục đích Cặp mồi sử dụng cho tổng hợp gen cry2Ab3-cb Cặp mồi vector tách dịng pUC19 Cặp mồi sử dụng cho giải N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 4/2021 17 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 2Ab3cb-Seq2 AATGGTTTTTCAGGCGCAAGAC 2Ab3wt-NcoI-F 2Ab3wt-SmaI-R 10 2Ab3cb-NcoI-F 2Ab3cb-SmaI-R 11 12 35S-F pRTL2-R TATA CCATGG ATGAATAGTGTATTGAATAGCGG GATG CCCGGG TTAATAAAGTGGTGAAATATTAGT TATA CCATGG ATGAACTCAGTGTTGAACT TAAT CCCGGG TTAGTACAGGGGTGAAATATTAGT CTTCGCAAGACCCTTCCTC ACTGGTGATTTTTGCGGACT trình tự gen cry2Ab3cb Cặp mồi cho tách dòng gen cry2Ab3-wt Cặp mồi cho tách dịng gen cry2Ab3-cb Mồi xi từ vùng promoter 35S mồi ngược từ vùng kết thúc pRTL2 sử dụng cho giải trình tự 13 Seq_2Ab3wt-R CATTATACGCATCACAAATAGTAGTTCTTCCG Cặp mồi cho giải trình tự 14 Seq_2Ab3wt-F TTTGATCTTATGAATATTATGCTTGTACCAACT gen cry2Ab3-wt 15 Seq_2Ab3cb-R TCACATATCGTAGTTCGACCGGAGTT Cặp mồi cho giải trình tự gen cry2Ab3-cb 16 Seq_2Ab3cb-F GTTTGATCTTATGAATATCATGCTGGTGCC 2.2.3 Thiết kế vector biểu thực vật mang cb biến mọc đĩa mơi trường có chứa kháng sinh lựa chọn cho PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry2Ab3-wt cb gen cry2Ab3-wt (2Ab3wt-NcoI-F/2Ab3wt-SmaI-R) 2.2.3.1 Ghép nối đoạn gen cry2Ab3-wt cb vào cb (2Ab3cb-NcoI-F/2Ab3cb-SmaI-R) (Bảng 1) sử vector pRTL2 dụng kit PCR EZ mix-tracking dye Sản phẩm PCR Để thiết kế vector chuyển gen mang gen chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% cry2Ab3-wt cb, đoạn gen cry2Ab3-wt cb 2.2.3.3 Giải trình tự gen khuếch đại PCR từ DNA plasmid Các khuẩn lạc dương tính với cặp mồi đặc vector tách dịng có chứa đoạn gen cry2Ab3 quan tâm sử dụng PhusionTM High-Fidelity DNA hiệu cho gen cry2Ab3-wt cb lựa chọn cho Polymerase với cặp mồi đặc hiệu cho gen nuôi tăng sinh khối mơi trường LB lỏng có bổ o cry2Ab3-wt (2Ab3wt-NcoI-F/2Ab3wt-SmaI-R) cb sung 100 mg/L Ampicillin 37 C qua đêm tách (2Ab3cb-NcoI-F/2Ab3cb-SmaI-R) (Bảng 1) theo chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-n-Easy Plasmid hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR cắt Mini-Prep Các DNA plasmid vector tái tổ hợp với enzyme giới hạn NcoI SmaI (Thermo Fisher pRTL2:cry2Ab3-wt cb sử dụng cho giải trình Scientific, Hoa Kỳ) kiểm tra điện di gel tự với cặp mồi 35S-F/pRTL2-R; thêm vào đó, agarose 1%, sau sản phẩm cắt tinh pRTL2:cry2Ab3-wt sử dụng thêm cặp mồi kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Đức) Các Seq_2Ab3wt-F/Seq_2Ab3wt-R pRTL2:cry2Ab3-cb đoạn cắt gen cry2Ab3-wt cb ghép nối với sử dụng cặp mồi Seq_2Ab3cb-F/ Seq_2Ab3cb-R vector pRTL2 (đã xử lý với enzyme giới hạn NcoI (Bảng 1) SmaI) T4 DNA ligase (Thermo Fisher 2.2.3.4 Ghép nối đoạn gen cry2Ab3-wt cb vào Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất vector biểu thực vật pZY101-Asc 2.2.3.2 Sàng lọc vector tái tổ hợp mang gen cry2Ab3-wt cb PCR Sản phẩm phản ứng ghép nối sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E coli Top10 phương pháp sốc nhiệt Tiếp theo, dịch khuẩn cấy trải nuôi qua đêm đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Ampicillin 37oC Các khuẩn lạc vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Aa-wt 18 Sau giải trình tự kiểm tra, DNA plasmid vector pRTL2:cry2Ab3-wt cb sau cắt enzyme giới hạn HindIII Sản phẩm cắt cấu trúc 35S:cry2Ab3-wt cb xử lý tạo đầu với T4 DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Tiếp theo, cấu trúc 35S:cry2Ab3-wt cb sau tinh ghép nối vi vector pZY101-Asc (ó c ct Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 4/2021 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ với enzyme giới hạn HindIII xử lý đầu bằng) sử dụng enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm ghép nối vector pZY101-Asc đoạn cấu trúc 35S:cry2Ab3wt cb sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E Coli Top10 phương pháp sốc nhiệt Dịch khuẩn nuôi qua đêm đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L Streptomycin 50 mg/L 37oC Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry2Ab3-wt cb mọc đĩa mơi trường LB có chứa kháng sinh lựa chọn cho kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu cry2Ab3-wt (2Ab3wt-NcoI-F/2Ab3wt-SmaI-R) cb (2Ab3cb-NcoI-F/2Ab3cb-SmaI-R) (Bảng 1) sử dụng kit PCR EZ mix-tracking dye Cuối cùng, sản phẩm PCR kiểm tra chạy điện di gel agarose 1% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Cải biến gen cry2Ab3 Hiện nay, protein chức để biểu bên vật chủ tự nhiên gặp nhiều trở ngại Trong đó, thơng tin di truyền mã hóa khung đọc mở không đơn giản thứ tự amino acid protein mà sinh vật khác thường thể ưa thích đặc biệt với số ba khác mã hóa mã hóa cho protein chức Đây gọi sai lệch ba mã hóa xác định yếu tố quan trọng biểu gen Tỷ lệ ba định xuất mã di truyền có khác đáng kể sinh vật Điều thực tế ba ưa thích có liên quan tới dư thừa tRNA nhận diện có sẵn tế bào Một gen ngoại lai biểu sinh vật vật chủ, trình tự tRNA chứa yếu tố kìm hãm biểu ba có tần suất thấp vật chủ dẫn tới chúng bị đào thải Có mối tương quan định tần suất xuất ba gặp mức độ biểu protein ngoại lai Do vậy, hiểu xuất ba hiếm, đặc biệt đầu N- protein nên tránh việc thiết kế gen ngoại lai Để làm điều đó, cải biến gen ngoại lai quan tâm việc thay ba sử dụng thường xuyên ba ưa thích trồng mà không làm thay đổi chức trình tự protein (Hudson et al., 2011; Murray et al., 1989; Zhang et al., 2011) Trong nghiên cứu này, để cải biến gen cry2Ab3 phù hợp cho việc chuyển gen vào đậu tương, sử dụng công cụ OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) kết hợp với tỷ lệ phần trăm ba mã hóa tối ưu cho gen đậu tương (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=3847) cho chỉnh sửa gen cry2Ab3-wt ban đầu Kết bảng cho thấy, gen cry2Ab3-cb có thay đổi nucleotide số ba mã hóa amino acid chuỗi trình tự DNA khơng có thay đổi chiều dài trình tự DNA so với gen cry2Ab3-wt (1902 bp) mã hóa cho 633 amino acid giống Cụ thể, gen cry2Ab3-cb có 262 hốn đổi vị trí Purines cho Pyrimidines ngược lại so với cry2Ab3-wt, có 239 thay đổi Purine với Purine Pyrimidine với Pyrimidine với cry2Ab3-cb so với wt Sự thay đổi xảy tất vị trí nucleotide ba, ví dụ có ba chỉnh sửa vị trí nucleotide đầu tiên, có ba chỉnh sửa vị trí nucleotide thứ hai, có ba chỉnh sửa vị trí nucleotide thứ ba, có trường hợp chỉnh sửa nucleotide ba Sự xáo trộn nucleotide làm thay đổi tỷ lệ phần trăm GC AT trình tự gen cry2Ab3-cb Cụ thể, tỷ lệ GC gen thay đổi từ 34,4% gen cry2Ab3-wt lên 44% gen cry2Ab3cb Sự thay đổi hoàn toàn phù hợp với tỷ lệ phần trăm GC gen ngoại lai muốn biểu tốt đậu tương phải đạt 40% (Hudson et al., 2011) Ngồi ra, thay đổi nucleotide trình tự dẫn tới biến động số lượng ba mã hóa gen cry2Ab3-cb so với cry2Ab3-wt Cụ thể, ba AAC mã hóa cho Asparagine (N) tăng nhiều với 19 lần, từ có 12 cry2Ab3-wt lên 31 cry2Ab3-cb, ngược lại ba TTA mã hóa cho Leucine (L) giảm nhiều với 29 lần, từ có 34 cry2Ab3-wt xuống cry2Ab3-cb; đó, có ba ATG mã hóa cho Methionine (M), TCT mã hóa cho Serine (S), GCG mã hóa cho Alanine (A), TGG mã hóa cho Triptophan (W), GGT mã hóa cho Glycine (G), CGT mã hóa cho Arginine (R) ba kết thúc TAA khơng có thay đổi cry2Ab3wt cb (Bng 3) Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 4/2021 19 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Bảng Kết cải biến trình tự gen cry2Ab3 (Chú thích: *: thay đổi Purines Pyrimidines; #: thay đổi Purine Purine Pyrimidine Pyrimidine; aa: amino acid; 1Ia-wt: cry2Ab3-wt; 1Ia-cb: cry2Ab3-cb) Bảng Các ba mã hóa cho gen cry2Ab3-wt cb Khi phân tích vùng bảo thủ (conserved domains) gen cry2Ab3-wt cb cho thấy tương đồng vùng bảo thủ endotoxin_N, siêu họ endotoxin_mid C8M6-C8M35-C8M36_like superfamily (Hình 1), điều chứng tỏ gen 20 cry2Ab3-wt cb có chỉnh sửa nucleotide các ba mã hóa amino acid khơng làm thay đổi trình tự protein cry2Ab3 N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 4/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Hình Kết phân tích vùng bảo thủ gen cry2Ab3-wt cb đầu (Hình 2A) Như vậy, với kết thành cơng bước đầu việc tách dịng gen cry2Ab3-cb vào vector pUC19 (Hình 2B) Ba số 10 khuẩn lạc dương tính với PCR tiếp tục sử dụng cho giải trình tự Kết giải trình tự cho thấy, khuẩn lạc có trình tự hồn tồn xác với gen cry2Ab3-cb thiết kế ban đầu (Bảng 2) Chú thích: (A) Vùng bảo thủ gen cry2Ab3wt (B) Vùng bảo thủ gen cry2Ab3-cb 3.3 Thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3-wt cb Qua kết cho thấy, gen cry2Ab3 cải biến thành công mà không làm thay đổi đặc trưng protein Cry2Ab3 ban đầu gen cry2Ab3-cb thay đổi vị trí nucleotide ba mã hóa số lượng ba mã hóa ưu tiên cho amino acid để phù hợp với hệ gen đậu tương Để thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3-wt cb quan tâm, đoạn gen cry2Ab3wt cb từ DNA plasmid vector tách dịng có chứa đoạn gen tương ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (Bảng 1) Tiếp theo, sản phẩm PCR đoạn gen cry2Ab3wt cb cắt xử lý enzyme giới hạn NcoI SmaI (Hình 3A) sử dụng cho ghép nối với vector pRLT2 (cũng xử lý với enzyme giới hạn tương ứng) (Hình 3B-C) Các vector tái tổ hợp pRTL2: cry2Ab3-wt cb biến nạp vào E coli nuôi qua đêm đĩa môi trường LB có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Ampicillin 37oC Các khuẩn lạc mọc đĩa LB lựa chọn để kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu 2Ab3wt-NcoI-F/2Ab3wt-SmaI-R cho gen cry2Ab3-wt 2Ab3cb-NcoI-F/2Ab3cb-SmaIR cho gen cry2Ab3-cb (Bảng 1) 3.2 Tổng hợp nhân tạo tách dòng gen cry2Ab3-cb Gen cry2Ab3 sau cải biến thành cơng gắn thêm vị trí enzyme giới hạn NcoI vào phía trước đầu 5‘ và SmaI vào đầu 3‘ tổng hợp nhân tạo theo quy trình phương pháp Cơng ty Sinh hóa Phù Sa Sản phẩm khuếch đại gen cry2Ab3cb gắn vào vector pUC19 (đã cắt xử lý với enzyme giới hạn SmaI) Tiếp theo, vector tách dòng pUC19 có chứa đoạn gen cry2Ab3-cb biến nạp vào vi khuẩn E coli Các khuẩn lạc mọc đĩa môi trường LB đặc có chứa 100 mg/L kháng sinh Ampicillin lựa chọn để kiểm tra PCR với cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1) Hình Kết tách dịng gen cry2Ab3-cb Chú thích: (A) Kết PCR khuẩn lạc vector tách dòng pUC19 chứa gen cry2Ab3-cb 1-11: sản phẩm PCR 12 khuẩn lạc; M, PSA DNA Ladder (B) Cấu trúc vector tách dòng pUC19:cry2Ab3-cb Kết PCR cho thấy, tổng số 11 khuẩn lạc lựa chọn để kiểm tra có 10 khuẩn lạc cho kết dương tính với cặp mồi vector pUC19 có kích thước khoảng 1902 bp trùng với kích thước dựa đoán gen cry2Ab3-cb thiết kế ban Hình Kết khuếch đại gen cry2Ab3-wt cb xử lý vector pRLT2 enzyme giới hạn Chú thích: (A) Kết PCR gen cry2Ab3-wt từ DNA plasmid pJET1.2:cry2Ab3-wt gen cry2Ab3-cb từ DNA plasmid pUC19:cry2Ab3-cb (B) Cấu trúc vector pRTL2 (C) Kết cắt vector pRTL2 bng Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 4/2021 21 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ enzyme giới hạn NcoI SmaI (D) Kết PCR gen cry2Ab3-wt từ khuẩn lạc vector pRTL2:cry2Ab3wt (E) Kết PCR gen cry2Ab3-cb từ khuẩn lạc vector pRTL2:cry2Ab3-cb (F) Cấu trúc 35S:cry2Ab3-wt cb M1, GeneRuler 1kb DNA ladder; -, đối chứng âm H2O; 1, DNA plasmid vector pJET1.2:cry2Ab3-wt; 2, DNA plasmid vector pUC19:cry2Ab3-cb; M2, 1Kb DNA Ladder; 3, Vector pRTL2; 4, Đối chứng dương từ DNA plasmid vector pJET1.2:cry2Ab3-wt; 5-11, Khuẩn lạc vector pRTL2:cry2Ab3-wt; 12, Đối chứng dương từ DNA plasmid vector pUC19:cry2Ab3-cb; 13-15, Khuẩn lạc vector pRTL:cry2Ab3-cb Kết điện di cho thấy, số khuẩn lạc pRTL2:cry2Ab3-wt cho kết dương tính tất khuẩn lạc pRTL:cry2Ab3-cb cho kết dương tính với gen cry2Ab3-wt cb (Hình 3D-E) Như vậy, việc ghép nối đoạn gen cry2Ab3-wt cb vào vector pRTL2 bước đầu thành công Để kiểm tra lại sản phẩm ghép nối vào vector pRTL2, khuẩn lạc dương tính ni tăng sinh khối, tách chiết DNA plasmid giải trình tự Kết giải trình tự cho thấy, khuẩn lạc vector tái tổ hợp pRTL2:cry2Ab3-wt cb có trình tự hồn tồn xác so với ban đầu gen cho thấy chiều điều khiển promoter 35S (Bảng 2, Hình 3F) Hình Kết thiết kế vector pZY101:35S:cry2Ab3wt cb Chú thích: (A) vector biểu thực vật pZY101Asc (B) Kết cắt vector pZY101-Asc enzyme giới hạn HindIII (C) Kết PCR gen cry2Ab3-wt từ khuẩn lạc vector pZY101:35S:cry2Ab3-wt (D) Kết PCR gen cry2Ab3-cb từ khuẩn lạc vector pZY101:35S:cry2Ab3-cb M, GeneRuler 1kb DNA ladder; P, vector pZY101-Asc cắt; 1, Đối chứng dương 22 từ DNA plasmid vector pJET1.2:cry2Ab3-wt; 2, Đối chứng âm H2O; 3-5, Khuẩn lạc vector pZY101:35S:cry2Ab3-wt; 6, Đối chứng âm H2O; 7, Đối chứng dương từ DNA plasmid vector pUC19:cry2Ab3-cb; 8-9, Khuẩn lạc vector pZY101:35S:cry2Ab3-cb Sau tách dịng thành cơng vector pRTL2 có chứa cấu trúc 35S:cry2Ab3-wt cb, tiến hành cắt cấu trúc 35S:cry2Ab3-wt cb từ vector tái tổ hợp pRTL2:cry2Ab3-wt cb enzyme giới hạn HindIII Sản phẩm cắt ghép nối với vector biểu thực vật pZY101-Asc (cũng cắt mở vịng xử lý vị trí enzyme giới hạn) (Hình 4A-B) enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm ghép nối vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry2Ab3-wt cb biến nạp vào vi khuẩn E coli ni qua đêm đĩa mơi trường LB có bổ sung kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L Streptomycin 50 mg/L 37oC Các khuẩn lạc màu trắng mọc môi trường LB lựa chọn để kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry2Ab3-wt cb (Bảng 1) Kết PCR cho thấy, khuẩn lạc cho kết dương tính với cặp mồi đặc hiệu gen cry2Ab3-wt cb (Hình 4C-D) Kết rằng, vector biểu thực vật pZY101:35S:cry2Ab3-wt cb thiết kế thành công Sâu bệnh hại trồng nguyên nhân ảnh hưởng nghiêm trọng tới suất sản lượng trồng Để đối phó với sâu bệnh hại trồng, có nhiều nghiên cứu cho thấy gen Bt có khả tiêu diệt nhiều đối tượng sâu hại khác Ví dụ, biểu gen cry1Ia chuyển gen giúp chúng có khả tiêu diệt số loại sâu thuộc cánh cứng đục sâu keo mùa thu (de-Oliveira et al., 2016; Silva et al., 2016; Tounsi et al., 2003) Độc tố protein Cry1Aa có khả tiêu diệt số côn trùng thuộc Cánh vảy nhiều trồng khác (Liu, Dean, 2006; Choi et al., 2008) Tuy nhiên, khả tiêu diệt sâu đục đậu tương độc tố Cry2Ab3 cịn chưa sáng tỏ Chính vậy, nghiên cứu thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3-wt cb có nguồn gốc từ chủng Bt BD8.2 phân lập Việt Nam để chuyển vào đậu tương nhằm đánh giá khả diệt sâu đục đậu tương chuyển gen cry2Ab3wt cb N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 4/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ KẾT LUẬN Gen cry2Ab3-wt cải biến thành công việc sửa đổi ba mã hóa gặp ba mã hóa có tần suất xuất nhiều gen đậu tương không làm thay đổi chức cấy trúc protein Cry2Ab3 ban đầu Các vector biểu pZY101:35S:cry2Ab3wt cb thiết kế thành công nguồn vật liệu cần thiết cho chuyển nạp gen cry2Ab3-wt cb vào đậu tương phục vụ cho nghiên cứu đánh giá khả diệt sâu đục protein Cry2Ab3 sau LỜI CẢM ƠN Cơng trình nghiên cứu thực khuôn khổ đề tài “Phân lập thiết kế gen kháng sâu tạo giống đậu tương biến đổi gen” theo QĐ số 4495/QĐ-BNN-KHCN ngày 31/10/2016 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp PTNT việc Phê duyệt danh mục nhiệm vụ khoa học công nghệ thực từ năm 2017 thuộc Chương trình CNSH Nơng nghiệp – Thủy sản TÀI LIỆU THAM KHẢO Choi Y J., Gringorten J L., Bélanger L., Morel L., Bourque D., Masson L., Groleau D., Míguez C B (2008) Production of an insecticidal crystal protein from Bacillus thuringiensis by the methylotroph Methylobacterium extorquens Applied and environmental microbiology, 74(16): 5178-5182 Crickmore N., Zeigler D R., Schnepf E., van Rie J., Lereclus D., Baum J., Bravo A., Dean D H (2013) Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature Available online: http://www.lifesci sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/ de-Oliveira R S., Oliveira-Neto O B., Moura H F., de Macedo L L., Arraes F B., Lucena W A., Lourenco-Tessutti I T., de Deus Barbosa A A., da Silva M C., Grossi-de-Sa M F (2016) Transgenic Cotton Plants Expressing Cry1Ia12 Toxin Confer Resistance to Fall Armyworm (Spodoptera frugiperda) and Cotton Boll Weevil (Anthonomus grandis) Front Plant Sci, 7: 165 Hudson L., Bost K., Piller K (2011) Optimizing Recombinant Protein Expression in Soybean, Soybean - Molecular Aspects of Breeding, Aleksandra Sudaric, IntechOpen, DOI: 10.5772/15111 Available from: https://www.intechopen.com/books/soybeanmolecular-aspects-of-breeding/optimizingrecombinant-protein-expression-in-soybean Kumar S., Chandra A., Pandey K C (2008) Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic crop: an environment friendly insectpest management strategy J Environ Biol, 29(5): 64-153 Liu X S., Dean D H (2006) Redesigning Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin into a mosquito toxin Protein Eng Des Sel, 19(3): 107-111 Murray E E., Lotzer J., Eberle M (1989) Codon usage in plant genes Nucleic Acids Res, 17(2): 477-498 Silva C R., Monnerat R., Lima L M., Martins E S., Melo Filho P A., Pinheiro M P., Santos R.C (2016) Stable integration and expression of a cry1Ia gene conferring resistance to fall armyworm and boll weevil in cotton plants Pest Manag Sci, 72(8): 15491557 Tabata J., Yokosuka T., Hattori M., Ohashi M., Noguchi H., Sugie H (2008) Sex attractant pheromone of the limabean pod borer, Etiella zinckenella (Treitschke) (Lepidoptera: Pyralidae), in Japan Appl Entomol Zool, 43 (3): 351–358 10 Tounsi S., Zouari N., Jaoua S (2003) Cloning and study of the expression of a novel cry1Ia-type gene from Bacillus thuringiensis subsp kurstaki J Appl Microbiol, 95(1): 23-28 11 USDA (2012) Field Release of Aphelinus glycinis (Hymenoptera: Aphelinidae) for Biological Control of the Soybean Aphid, Aphis glycines (Hemiptera: Aphididae), in the Continental United States Environmental Assessment 12 Zhang L., Guo Y., Luo L., Wang Y P., Dong Z M., Sun S H., Qiu L J (2011) Analysis of Nuclear Gene Codon Bias on Soybean Genome and Transcriptome Acta Agronomica Sinica, 37(6): 965974 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 4/2021 23 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CONSTRUCTION OF PLANT EXPRESION VECTORS CONTAINING cry2Ab3 GENES CONFERRING RESISTANCE TO SOYBEAN POD BORER Etiella zinkenella Nguyen Huu Kien1, Nguyen Thi Hoa1, Le Thi Mai Huong1, Nguyen Trung Anh1, Dinh Thi Mai Thu1, Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, Le Thi Minh Thanh2, Nguyen Van Dong1* Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology * Email: dongjircas@yahoo.com Summary The soybean pod borer Etiella zinkenella Treitschke is one of the serious pests limiting soybean productivity and yield Whereas the breeding of genetically engineered insect-resistant plants containing cry genes cloned from Bacillus thuringiensis (Bt) strains have been studied on numerous crops, but soybean is still limited The present study was performed with the aim of constructing plant expression vectors carrying native- and modified-cry2Ab3 genes isolated from native Bt strain BD8.2 in Vietnam Results of this study will provide genetic materials for introducing these genes into soybean to enhance resistance to the pod borer Etiella zinkenella Keywords: Bacillus thuringiensis, cry2Ab3, Etiella zinkenella, pZY101-Asc vector, soybean Người phản biện: PGS.TS Hà Viết Cường Ngày nhận bài: 02/11/2020 Ngày thông qua phản biện: 3/12/2020 Ngày duyệt đăng: 10/12/2020 24 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 4/2021 ... chỉnh sửa gen cry2Ab3- wt (dạng dại) ban đầu nhằm tạo gen cry2Ab3- cb (cải biến) có khả tương thích với hệ gen đậu tương tốt hơn; sau đó, thiết kế cấu trúc vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3- wt... acid để phù hợp với hệ gen đậu tương Để thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3- wt cb quan tâm, đoạn gen cry2Ab3wt cb từ DNA plasmid vector tách dịng có chứa đoạn gen tương ứng khuếch đại... nghiên cứu thiết kế vector biểu thực vật mang gen cry2Ab3- wt cb có nguồn gốc từ chủng Bt BD8.2 phân lập Việt Nam để chuyển vào đậu tương nhằm đánh giá khả diệt sâu đục đậu tương chuyển gen cry2Ab3wt