ThiếtkếvectorchuyểngenbiểukhángnguyênvirútPRRStếbàothựcvật Lê Thị Thanh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số 60 42 01 14 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Tường Vân; PGS TS Võ Thị Thương Lan Năm bảo vệ: 2013 Abstract Thiếtkế thành công đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 Đồng thời đoạn gen dòng hóa thành cơng vào vector tách dòng pBT/T lưu trữ tếbàovi khuẩn E coli DH 5α Thiếtkế thành công vectorchuyểngen pCBGW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 kỹ thuật Gateway qua hai phản ứng BP LR Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vectorchuyểngen Đã chuyển thành công gen ltbgp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 vào tếbào thuốc siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sàng lọc dòng BY-2 mang gen ltb-gp5 biểu sản phẩm protein Keywords Tếbàothực vật; Virút PRRS; Sinh học thực nghiệm; Thiếtkế Vector; Gen Content MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm virút gây ra, có khả lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế Ở Việt Nam bệnh gọi bệnh “lợn tai xanh” lợn mắc bệnh thường bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trưng bệnh tượng sẩy thai lợn nái chửa triệu chứng bệnh đường hô hấp, đặc biệt lợn cai sữa Bệnh phát lần Hoa Kỳ năm 1987 Sau xuất nhiều nước chăn nuôi lợn theo phương thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)… Từ năm 1992, bệnh gây ổ dịch lớn nhiều nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn giới Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp gián tiếp) bệnh lợn tai xanh năm gần lớn so với thiệt hại bệnh khác gây lợn Ước tính hàng năm nước Mỹ phải gánh chịu tổn tất bệnh gây khoảng 560 triệu USD việc tiêu huỷ lợn chết lợn ốm, chi phí chống dịch xử lý mơi trường Ở Việt Nam, bệnh phát lần vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ vào tỉnh phía Nam Tuy nhiên dịch bệnh nặng thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Đến bệnh trở nên khó có thể kiểm soát đươ ̣c lây lan ngày r ộng tập quán hệ thống chăn nuôi heo phức tạp Việt Nam Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp sử dụng tiêm phòng vắcxin kết hợp biện pháp thú y Gần có số lượng hạn chế vắcxin bất hoạt nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng chủng châu Mỹ châu Âu Tuy nhiên vắcxin dạng có số nhược điểm vắcxin bất hoạt hiệu bảo vệ miễn dịch thường khơng cao, vắcxin nhược độc ta ̣o mức độ bảo vệ tốt chủng tương đồng lại có nguy phát triển độc tính trở lại Hiện thị trường Việt Nam có hai loại vắcxin chống PRRSV dạng giá thành cao, hiệu lại thấp có khả điều trị các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virút Vắcxin thựcvật hay còn go ̣i là vắ cxin ăn (edible vaccine) sản phẩm công nghệ sinh học đại Thực chất vắcxin thựcvật vắcxin tiểu đơn vị sản xuất dựa hệ thống thựcvật để thu protein khángnguyên mong muốn So với hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thựcvật có nhiều ưu điểm như: dễ dàng tăng quy mô sản xuất thu sinh khối; khángnguyênbiểuthựcvật ổn định nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản sử dụng; dùng qua đường miệng ăn tươi (quả, lá) nấu chín (hạt, củ; an tồn; đặc biệt vắcxin ăn kích thích sản xuất kháng thể hệ thống niêm mạc ruột hiệu vắcxin tiêm Từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài “Thiết kếvectorchuyểngenbiểukhángnguyênvirútPRRStếbàothực vật”, tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế KH&CN theo nghị định thư hai nước Việt Nam – Vương Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểugen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc đậu tương” giai đoạn 2011-2013 Đề tài tiến hành Phòng Cơng nghệ TếbàoThực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiếtkếvectorchuyểngen mã hóa cho số khángnguyênvirútPRRS vào tếbàothựcvật ii) Đánh giá hiệu sử dụng vector thơng qua việc phân tích biểukhángnguyêntếbào thuốc BY-2 Reference TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2007), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2007 2 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2008), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2008, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2008 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2009), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2009 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2010), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2010, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2010 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2011), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2011, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2012), Báo cáo kết thựckế hoạch 12 tháng năm 2012, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2012 Bùi Mỹ Duyên (2012), Thiếtkếvectorbiểu số khángnguyên virus lợn tai xanh (PRRSV) tếbào thuốc lá, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học Mở Đậu Ngọc Hào , Văn Đăng Kỳ , Nguyễn Văn Long , Tiêu Quang An (2008), “Mô ̣t số đă ̣c điể m dich ̣ tễ Hô ̣i chứng sinh sản và hô hấ p (PRRS) lợn từ cuố i tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nước”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (5), tr 14-20 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đồn Thị Thanh Hương,Trần Quang Vui, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Bá Hiến (2009), “Phân tích gen M mã hoá protein màng virus gây bệnh lợn tai xanh”, Tạp chí Khoa học Phát triển, (7), tr 282 – 290 10 Nguyễn Thị Thanh Huyền, Chuẩn hóa phương pháp chuyểngen vào tếbào thuốc BY-2 nhằm biểu protein HA vius H5N1, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học Mở 11 Võ Thị Thương Lan (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công nghệ gen nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế 13 Lê Quỳnh Liên , Phan Tro ̣ng Hoàng , Đỗ Xuân Đồng , Chu Hoàng Hà , Lê Trầ n Biǹ h (2008), “Biểu khángnguyên glycoprotein virus dại thuốc chuyển gen”, Tạp chí CNSH, (6), tr 445-452 14 Đinh Đoàn Long , Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyề n học phân tử và tế bào , Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 15 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất Giáo dục Việt nam 16 Trịnh Thị Trang Nhung (2010), Biểu tinh peptide kháng khuẩn Cecropin, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 17 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), “Công nghệ genthực vật”, Hội nghị Khoa học công nghệ 2007,5, tr 345-411 18 Nguyễn Tường Vân (2011), “Nghiên cứu biểugen mã hóa protein vỏ Glycoprotein (GP5) virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc đậu tương”, Thuyết minh nhiệm vụ hợp tác quốc tế KH&CN theo Nghị định thư, tr 1-25 Tài liệu tiếng Anh 19 Ansari, I.H., Kwon, B., Osorio, F.A., Pattnaik, A.K (2006), “Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies”, J Virol, (80), pp 3994–4004 20 Arakawa T, Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997), “Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants”, Transgenic Research, (6), pp 403-413 21 Arntzen C, Plotkin S, Dodet B (2008), “Plant-derived vaccines and antibodies: potential and limitations”, Vaccine, (23), pp 1753–1756 22 Aziz MA, Singh S, Kumar PA and Bhatnagar R (2002), “Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax”, Biochemical and Biophysical Research Communications, (299), pp 345-351 23 Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin CM, Pang VF, Jeng CR (2010), “Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant”, Vet Immunol Immunopathol, 135, pp 234-242 24 Dalsgaard K, Uttenthal A Jones TD, Xu F Merryweather A, Hamilton WDO, Langcveld JPM, Boshuizen RS, Karnstrup S Lomonossoff GP, Porta C, Vela C, Casa] JI, Meloen RH, Rodgers PB (1997), “Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease”, Nat Biotechnol, 15, pp 248-252 25 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001), “Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants”, Trends Plant Sci, 6, pp 219-226 26 Diaz I, Darwich L, Pappaterra G, Pujols J, Mateu E (2006), “Different European-type vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus have different immunological properties and confer different protection to pigs”, Virology, 351, pp 249–259 27 Dus Santos MI, Wigdorovitz A, Trono K, Rios RD, Franzone PM, Gil F, Moreno J, Carrillo C, Escnihano IM, Borca MV (2002), “A novel methodology to develop a toot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants”, Vaccine, 20, pp 1141-1147 28 Feng Y, Zhao T, Tung Nguyen, Inui K, Ma Y, Nguyen Thi Hoa, Nguyen Van Cam , Liu D , Bui Quang Anh, To Long Thanh , Wang C, Tian K, and Gao GF (2008), “Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China in 2007”, Emerging Infectious Diseases, 14, pp 1774-1776 29 Hou YH, Chen J, Tong GZ, Tian ZJ, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng JM, An TQ, Yang HC (2008), “A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and the GP5 encodinggene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces protective immunity in piglets”, Vaccine, 26, pp 1438–1449 30 Invitrogen (2010), Gateway® Technology, Version E, Catalog nos 12535-019 and 12535-027 31 Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK (2002), “Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants”, Transgenic Res, 1, pp 447-454 32 Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S (2006a), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice”, Vet Immunol, 113, pp 169–180 33 Jiang W, Jiang P, Wang X, Li Y, Wang X, Du Y (2007), “Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein N-linked glycans on immune responses in mice”, Virus Genes, 35, pp 663–671 34 Jiang Y, Xiao S, Fang L, Yu X, Song Y, Niu C, Chen H (2006b), “DNA vaccines coexpressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity”, Vaccine, 24, pp 2869–2879 35 Kim TG, Gruber A and Langridge WHR (2004), “HIV-1 gp 120 V3 cholera toxin B subunit fusion gene expression in transgenic potato”, Protein Expression and Purification, 37, pp 196-202 36 Lamphear BJ, Jilka JM, Kest L, Welter M, Howard JA, Streatfield Si (2004), “A cornbased delivery system or animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine”, Virology, 22, pp 2420-2424 37 Lauterslager TGM, Florack DEA, Wal TJV, Molthoff JW, Langeveld JPM, Bosch D, Boersma WJA and Hilgers LAT (2001), “Oral immunisation of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LTB”, Vaccine, 19, pp 2749-2755 38 Mason HS, Warzecha H, Mor T and Arntzen CJ (2002), “Edible plant vaccines: application for prophylactic and therapeutic molecular medicine”, Trends in Molecular Medicine, 8, pp 324-329 39 Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002), “Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain”, J Virol, 76, pp 4241–4250 40 Palmer K E, Schnippenkoetter WH, Rybicki EP (1998), “Geminivirus isolation and DNA extraction” In Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance, pp 41-52 Edited by G Foster & S Taylor Totowa, NJ:Humana Press 41 Perlak FJ, Fuchs RL, Dean DA, McPherson SL and Fishhoff DA (1991), “Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes”, Proc Natl Acad Sci USA, 88, pp 3324-3328 42 Plagemann PG (2004), “GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus”, Virus Res, 102, pp 225–230 43 Rebay Lab (2013), Transformation of Bacteria via Electroporation Protocol 44 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 1, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 45 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 46 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 47 Streatfield SJ and JA Howard (2003), “Plant-based vaccines”, Int J Parasitol, 33, pp 479-493 48 Thermo sciencetific (2006), CloneJETTM PCR Cloning Kit procedure 49 Thermo sciencetific (2008-2009), Molecular Biology Catalog and Product Application guide 50 Thermo Scientific (2006), GeneJET Gel Extraction Kit Procedure 51 Thermo Scientific (2006), GeneJETTM PCR Purification Kit Procedure 52 Thermo Scientific (2006), GeneJET™ RNA Purification Kit Procedure 53 Thermo Scientific (2006), RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Procedure 54 Wasin Charerntantanakul (2012), “Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects”, Virology, 1(1): 23-30 55 Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007), “Co-expressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)”, Virus Genes, 35, pp 585–595 Trang web 56 http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/molStudents/spring2003/McCord/electrop oration.htm 57 www.bio.utk.edu/cellbiol/prot/by2-medium.pdf 58 http://www.protocolonline.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DNA_Extraction_Purification/DNA_Extraction _from_Plants/ 59 http://www.prrs.org/Elimination/93/RegionalElimination.aspx#.Ui2T639EnqE 60 http://www.prrssymposium.org/default.aspx 61 http://www.respig.com/diseases/prrs.asp 62 http://www.thepigsite.com/diseaseinfo/97/porcine-reproductive-respiratory-syndromeprrs ... KH&CN Vi t Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho số kháng nguyên vi rút PRRS vào tế bào thực vật ii) Đánh giá hiệu sử dụng vector thông qua vi c phân tích biểu kháng nguyên tế. .. khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài Thiết kế vector chuyển gen biểu kháng nguyên vi rút PRRS tế bào thực vật , tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế KH&CN theo nghị định thư hai nước Vi t Nam... (2012), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2012, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2012 Bùi Mỹ Duyên (2012), Thiết kế vector biểu số kháng nguyên virus lợn tai xanh (PRRSV) tế bào thuốc lá, Khóa