Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 653-658, 2013 TÁCH DÒNG cDNA VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 Võ Thị Thương Lan1, Lê Hồng Thu1, Đinh Đoàn Long1,2 Trường Đại học Khoa học tự nhiên2, Đại học Quốc Gia Hà Nội Khoa Y-Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội TÓM TẮT Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G protein có vai trò định hoạt động tế bào thần kinh, tham gia vào việc điều hòa phản xạ nơn, hơ hấp hành vi phản xạ Thụ thể NK1-R phiên mã từ gen đơn gồm hai dạng sai khác đầu carboxyl hình thành cắt nối luân phiên mRNA Hai dạng NK1-R có lực liên kết khác với chất đồng vận chất đối vận Biểu NK1-R tái tổ hợp hệ thống tế bào động vật phương pháp tối ưu để sàng lọc chất đối vận/đồng vận cạnh tranh với phối tử sản xuất biệt dược điều trị bệnh thần kinh, rối loạn đáp ứng miễn dịch Trong báo này, chúng tơi trình bày kết phân lập cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R từ mơ phổi người Việt Nam Trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn NK1-R phân lập từ mô phổi giống với NK1-R phân lập từ mơ não người Việt có amino acid sai khác so với trình tự gốc ngân hàng liệu (Databank) Tuy nhiên, phân tích in silico cho thấy sai khác không ảnh hưởng đến cấu trúc xuyên màng thụ thể cDNA hoàn chỉnh đưa vào vector biểu pEGFP-N1 nhằm mục đích xây dựng hệ thống tế bào biểu NK1-R tái tổ hợp để sàng lọc chất đồng vận đối vận thụ thể từ nguồn dược liệu Việt Nam Từ khóa: Chất đối vận thụ thể, chất đồng vận thụ thể, phối tử P, thụ thể neurokinin-1 (NK1-R), thụ thể xuyên màng liên kết G protein MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) thành viên họ thụ thể chứa vùng kỵ nước xuyên màng Đầu carboxyl NK1-R liên kết với G protein bên tế bào chất; đầu amino liên kết chủ yếu với chất P (phối tử) bên màng tế bào (Severini et al., 2000) NK1-R bắt đầu đường truyền tải tín hiệu gây đau đớn đáp ứng sinh lí (hơ hấp, điều hòa, hành vi phản xạ) cho tế bào (InHae, Tae, 1995) Ở người, gen mã hóa NK1-R gen đơn có exon, nằm nhiễm sắc thể số Sau phiên mã, có dạng mRNA (khác vùng 3’) dịch mã tổng hợp hai dạng NK1-R có lực khác với chất đồng vận chất đối vận thụ thể (Jian et al., 2008) Trong chất đồng vận liên kết với thụ thể có tác dụng tương tự phối tử (ligands) chất đối vận liên kết với thụ thể không gây phản ứng sinh học làm giảm hay khóa phản ứng trung gian chất đồng vận (Rosso, Mu˜noz, 2006) Phát triển thuốc đồng vận hay đối vận NK1-R đặc biệt có ý nghĩa điều trị nhiều bệnh, ví dụ thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa bệnh đường hô hấp, điều trị chứng buồn nôn nôn mửa tác dụng hóa trị liệu ung thư (Chamindi et al., 2009; Rogers, Blackburn, 2010) Một ứng dụng rộng rãi thuốc đối vận NK1-R tham gia vào việc điều trị chứng tâm thần phân liệt, trầm cảm có liên quan đến việc tăng lượng dopamine não (Rupnipak, Kramer, 2002) Khi phối tử P liên kết với NK1-R lượng dopamine tăng Có thể điều chỉnh lượng dopamine cách sử dụng thuốc đối vận liên kết với NK1-R nhằm ngăn chặn tương tác chất P (Rupnipak, Kramer, 2002) Năm 2003, lần chất đối vận NK1-R aprepitant (Emend) hiệp hội quản lý thuốc thực phẩm (FDA) Hoa Kỳ phê chuẩn cho phép sản xuất lưu thông thị trường (Rogers, Blackburn, 2010) Việc tìm kiếm chất đối vận đồng vận NK1-R hầu hết dựa vào hệ thống tế bào biểu NK1-R nội sinh NK1-R tái tổ hợp (Quartara, Altamura, 2006) Với ưu điểm bật số lượng phương thức biểu nên NK1-R tái tổ hợp sử dụng nghiên cứu cấu trúc, động học tương tác NK1-R với chất đồng vận chủ vận (tăng khả phát tương tác, chủ động gây đột biến định hướng làm thay đổi cấu trúc NK1R,…) (Quartara, Altamura, 2006) Vì vậy, phân lập cDNA hồn chỉnh, biểu NK1-R tái tổ hợp; từ thiết lập hệ thống tế bào sàng lọc thuốc từ 653 Võ Thị Thương Lan et al nguồn dược liệu đặc hữu hướng phát triển thuốc quan tâm (Quartara, Altamura, 2006) Ở Việt Nam, nghiên cứu NK1-R, chất đối vận đồng vận NK1-R chưa công bố hệ thống sàng lọc chất chưa khả thi Nghiên cứu chúng tơi trình bày kết phân lập cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể NK1 từ mơ phổi, so sánh với cDNA phân lập từ mô não người Việt Nam thiết kế vector biểu mang cDNA-NK1-R hồn chỉnh nhằm mục đích chủ động biểu thụ thể để sàng lọc chất có khả tương tác với NK1-R từ dược liệu Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu u phổi sau phẫu thuật giữ nitơ sử dụng để tách chiết ARN tổng số PureLink Kit (Invitrogen) Hai µg RNA tổng số dùng làm khuôn phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA sử dụng oligoT enzyme Reverse Transcriptase (Invitrogen) Phản ứng thực theo quy trình hướng dẫn Invitrogen Phương pháp Phản ứng RT-PCR thực để khuếch đại đoạn 5’-NK1 (788 bp) cặp mồi NK1F: CGAAATGGATAACGTCCTCCC NK1R1: GCCAGCAGATGGCGAAGG, đoạn 3’-NK1 (728 bp) cặp mồi NK1F1: GATCTACTTCCTCCCCCTGC NK1R: CAAGTCCCAGT GTGAGGGTG Phản ứng sử dụng µl cDNA với chu trình nhiệt lặp lại 40 chu kỳ (94oC phút; 60oC 30’’; 72oC 90’’) Sản phẩm sau xử lý với enzyme SmaI nối với nhờ DNA ligase tạo nên cDNA hồn chỉnh cDNA tách dòng vector pJET1.2 biến nạp vào E coli DH5a Vector pJET mang cDNA kí hiệu pJET-NK1 Các phản ứng PCR sử dụng enzyme Pfu Taq polymerase có hoạt tính đọc sửa để đảm bảo tính xác trình nhân bản.Trình tự cDNA xác định máy tự động Vị trí mồi, kích thước sản phẩm RT-PCR trình bày hình Mồi NK1F3-: ATTTAAGCTTACCATGGATAACG TCCTCC (vị trí nhận biết HindIII gạch chân trình tự Kozak in đậm) mồi NK1R3: TAAGGATCC CTAGGAGAGCACATTG (vị trí nhận biết BamHI) thiết kế để nhân cDNA hoàn chỉnh NK1-R từ khuôn pJET-NK1 Sản phẩm PCR với cặp mồi NK1F3/R3 xử lý với hai enzyme HindIII BamHI đưa vào vector biểu pEGFP-N1 mở vòng với hai enzyme Vector pEGFP-NK1 biến nạp vào E coli DH5a; thể biến nạp mang vector chọn lọc mơi trường bổ sung kanamycine (50µg/ml) Trình tự nucleotide cDNA NK1-R hoàn chỉnh xác định máy đọc tự động Hình Sơ đồ phân lập cDNA thụ thể NK1 sử dụng cặp mồi nhân vùng 5’-NK1 vùng 3’-NK1 riêng biệt KẾT QUẢ Phân lập hai đoạn 5’-NK1 3’-NK1 cDNA mã cho NK1-R 3’-NK1 có hai băng DNA, băng có kích thước 700 bp mong đợi (Hình 2B), băng thứ hai kích thước 500 bp tương ứng với loại NK1-R ngắn Sử dụng khuôn cDNAs để khuếch đại hai đoạn 5’-NK1 3’-NK1 hai cặp mồi NK1F/NK1R1; NK1F1/NK1R phản ứng PCR Kết quả, đoạn 5’-NK1 khuếch đại thành băng DNA rõ nét có kích thước gần 800 bp tính tốn (Hình 2A) Trong kết khuếch đại đoạn Hai đoạn 5’-NK1 3’-NK1 có kích thước 700 bp tinh Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), tách dòng vector pJET1.2 (Fermentas) biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Một số khuẩn lạc mọc môi trường LB tách chiết DNA plasmid để 654 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 653-658, 2013 kiểm tra khả mang gen vector tái tổ hợp tương ứng pJET-5-NK1 pJET-3-NK1 Tạo cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R Plasmid pJET-3-NK1 mở vòng SmaI XbaI Sản phẩm PCR khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp pJET-5-NK1 cắt với hai enzyme đưa vào pJET-3-NK1 mở vòng để tạo thành đoạn cDNA hồn chỉnh mã hóa cho NK1-R (Hình 3A) Thể biến nạp E coli DH5α mọc môi trường kháng sinh có plasmid chứa cDNA hồn chỉnh (Hình 3B) Plasmid tái tổ hợp kí hiệu pJET-NK1 Hình Điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn 5’-NK1 (A) 3’-NK1 (B) (-): đối chứng âm khơng có khn cDNA; Giếng NK1: cDNA hoàn chỉnh NK1 M: Thang chuẩn SY-500 Hình (A) Plasmid pJET-3-NK1 (p3’) sản phẩm PCR (5’) xử lý với hai enzyme SmaI XbaI (B) Các khuẩn lạc (1-4) mang cDNA hoàn chỉnh (~1.4 kb) sàng lọc colony-PCR (-) Đối chứng âm DNA khn M kb DNA ladder Xác định trình tự nucleotide cDNA hồn chỉnh NK1-R Plasmid pJET-NK1 tách chiết từ dòng khuẩn lạc số (Hình 3B) xác định trình tự máy đọc tự động So sánh trình tự cDNA nhận từ mơ phổi với trình tự cDNA hồn chỉnh phân lập từ mô não người Việt Nam (Phan Ha Mỵ, 2012) không thấy sai khác Cả hai trình tự có nucleotide khác với trình tự ngân hàng liệu (Mã số NCBI: M81797.1) tương ứng với sai khác amino acid (Bảng 1) Bảng Sai khác trình tự nucleotide amino acid thụ thể NK1 người Việt với trình tự NCBI Các số ngoặc vị trí nucleotide amino acid trình tự gốc có ngân hàng Databank cDNA-NK1-R (M81797.1) cDNA-NK1-R (Người Việt Nam) NK1-R (NM_007053.3) NK1-R (Người Việt Nam) AAG (186) AGG R - Arginine (62) G - Glycine GAC (372) GGC T – Threonine (124) A - Alanine TAT (772) TGT Y – Tyrosine (214) C - Cysteine GAG (996) GGG E - Glutamic acid (332) G - Glycine 655 Võ Thị Thương Lan et al Thiết kế vector biểu mang cDNA hoàn chỉnh NK1-R Đoạn cDNA hoàn chỉnh khuếch đại từ plasmid pJET-NK1 với cặp mồi NK1F3/R3 (Hình 4A) cắt với hai enzyme HindIII BamHI Việc thiết kế thêm trình tự Kozak (ACCATGG) mồi NK1F3 cho phép sử dụng mã mở đầu trình tự cDNA NK1 thay mã mở đầu thiết kế sẵn vector biểu Do kích thước cDNA hồn chỉnh giảm 100 bp vùng 5’ không dịch mã Vector pEGFP-N1 mở vòng hai enzyme cDNA hồn chỉnh mã cho NK1-R đưa vào vector mở vòng nhờ DNA ligase Các thể biến nạp mang vector biểu có chứa cDNA chọn lọc phản ứng PCR (Hình 4B) Hình (A) Plasmid pJET-3-NK1 (pC) sản phẩm PCR (NK1) xử lý với hai enzyme SmaI XbaI pU: vector không cắt với enzyme (B) Các khuẩn lạc (1-6) mang cDNA hoàn chỉnh (1241 bp) sàng lọc colony-PCR (-): Đối chứng âm DNA khn M kb DNA ladder Giải trình tự cDNA hồn chỉnh mã hóa cho NK1R vector biểu pEGFP-N1 Để khẳng định có mặt cDNA-NK1 vector biểu hiện, hai vector biểu pCDNA3NK1-11 peGFP-N1-NK1-5 giải trình tự (kết khơng hiển thị) Kết giải trình tự cho thấy cDNA-NK1 vector biểu khơng có sai khác so với trình tự cDNA gốc vector tách dòng pJET Điều chứng tỏ chúng tơi thành công việc thiết kế vector biểu mang cDNA hồn chỉnh mã hóa cho NK1-R người Việt Nam THẢO LUẬN NK1-R ba loại thụ thể tachykinin động vật có vú Trên thực tế, liên kết chéo xảy với lực liên kết khác thụ thể tachykinin (Almeida et al., 2004) Ví dụ tachykinin P có lực liên kết với NK1-R cao gấp 100 500 lần so với hai thụ thể khác (Gerard et al., 1991) Phân tử mRNA phiên mã từ gen NK1-R cắt nối luân phiên tương ứng với loại NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh (407 amino acid) loại NK1 bị xén cụt đầu carboxyl (311 amino acid) (Caberlotto et al., 2007) Việc xuất băng DNA có kích thước 400 bp (Hình 2B) cDNA mã cho dạng NK1-R ngắn Biểu 656 dạng ngắn không phát phân lập cDNA NK1-R từ mô não người Việt, gợi ý hoạt động khác NK1-R mơ biệt hóa (Baker et al., 2003) Trình tự nucleotide cDNAs hồn chỉnh mã hóa cho NK1-R người lần công bố Hopkins đồng tác giả (1991) Kết cho thấy NK1-R mô phổi giống với NK1-R mô não người Việt có amino acid sai khác với số liệu Databank Điều chứng tỏ khác biệt trình tự nucleotide gen mã hóa cho NK1-R người Việt Nam với trình tự nucleotide ngân hàng liệu tính đa hình nucleotide (SNPs) Sử dụng phần mềm TMHMM server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/) để kiểm tra tính xuyên màng trình tự protein suy diễn thu được, chúng tơi nhận thấy sai khác amino acid không ảnh hưởng đến tính xuyên màng Tuy nhiên, amino acid sai khác đủ làm thay đổi lực liên kết với phối tử (Ciucci et al., 1997) Trình tự amino acid NK1 người chuột có độ tương đồng cao 99%, nhiên lực liên kết với phối tử L-733060 thay đổi từ 0.87 với NK1-R người đến 550 với NK1-R chuột (Almeida et al., 2004) Vì vậy, việc thiết kế thành cơng vector biểu NK1-R người Việt Nam khẳng định mối liên hệ sai khác amino acid lực kiên kết, đồng thời mở khả sử dụng hệ thống tế bào để sàng lọc Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 653-658, 2013 chất đối vận, đồng vận với NK1-R từ nguồn dược liệu phong phú đa dạng nước ta KẾT LUẬN Chúng thiết kế vector biểu pEGFP-N1 mang cDNA hồn chỉnh NK1-R phân lập từ mơ phổi người Việt Nam Trình tự amino acid suy diễn giống với NK1-R phân lập từ mô não người Việt có sai khác so với trình tự gốc Databank Phân tích mơ cho thấy sai khác khơng ảnh hưởng đến tính xun màng thụ thể, nhiên lực kiên kết với phối tử cần nghiên cứu tiếp hệ thống tế bào biểu NK1-R tái tổ hợp Lời cảm ơn: Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam cho đề tài ĐT-PTNTĐ 2011-G/04 để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Almeida TA, Rojo J, Nieto PM, Pinto FM, Hernandez M, Martín JD, Candenas ML (2004) Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships Bentham Science Publishers 11: 2045-2057 Baker SJ, Morris JL, Gibbins IL (2003) Cloning of a Cterminally truncated NK-1 receptor from guinea-pig nervous system Brain Res Mol 11: 136-144 Caberlotto L, Hurd YL, Murdock P, Wahlin JP, Melotto S, Corsi M, Carletti R (2007) Neurokinin receptor and relative abundance of the short and long isoforms in the human brain Eur J Neurosci 17: 1736-1749 Chamindi S, Nassima AD, Jennie ZM, Guobo C, Bankole AJ, Ming DL (2009) Susceptibility locus in neurokinin-1 receptor gene associated with alcohol dependence Neuropsychopharmacology 34: 2442-2456 Ciucci A, Palma C, Riitano D, Manzini S, Werge T (1997) Gly166 in the NK1 receptor regulates tachykinin selectivity and receptor conformation FEBS Letters 416: 335-351 Gerard NP, Garraway LA, Eddy RL, Shows TB (1991) Human substance P receptor (NK-1): organization of the gene, chromosome localization and functional expression of cDNA clones Biochem 30: 10640-10654 Hopkins B Powell SJ, Danks P, Briggs I, Graham A (1991) Isolation and characterization of the human lung NK-1 receptor cDNA Biochem Biophys Res Commun 180:1110-1118 InHae J, Tae HJ (1995) Differential roles of exoloop of the human follicle – stimulating hormone receptor in hormone binding and receptor activation J Biol Chem 270: 15970-15993 Jian PL, Saien L, Florin T, Morris FT, Laurie EK, Susan EL, Steven DD (2008) Differences in the length of the carboxyl terminus mediate function properties of neurokinin-1 receptor PNAS 105: 12605-12619 Phan Hà Mỵ (2012) Tách dòng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin từ mơ não người Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Severini C, Salvadori S, Guerrini R, Falconieri-Erspamer G, Mignogna G, Erspamer V (2000) Parallel bioassay of 39 tachykinins on 11 smooth muscle preparations Structure and receptor selectivity/affinity relationship Peptides 21: 1587-1601 Quartara L, Altamura M (2006) Tachykinin receptors antagonists: from research to clinic”, Current Drug Targets 7: 975-992 Rogers MP, Blackburn L (2010) Use of neurokinin-1 receptor antagonists in patients receiving moderately or highly emetogenic chemotherapy Clin J Oncol Nurs 14: 500-517 Rosso M, Mu˜noz M (2006) Pharmacology Guide In vitro pharmacology: concentration-response curves Neuropsychopharmacology 21: 1245-1256 Rupnipak MJ, Kramer MS (2002) Substance P and related tachykinins Neuropsychopharmacology 17: 169-191 657 Võ Thị Thương Lan et al CLONING THE FULL LENGTH cDNA ENCODING NEUROKININ RECEPTOR (NK1R) AND CONSTRUCTING NK1-R EXPRESSION VECTOR Vo Thi Thuong Lan1,*, Le Hong Thu1, Dinh Doan Long1,2 Hanoi University of Science, Hanoi National University School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University SUMMARY The NK1 receptor (NK1-R) is a member of family of G protein-coupled receptors and is responsible for transmitting signals from the extracellular environment It plays an important role in pain and inflammation, and controlling chemotherapy-induced nausea and vomiting It is also involved in the neural circuitry of anxiety, depression and emesis These evidences have led to the development of bio assays based on recombinant NK1-R to screen agonists and antagonists for purpose of therapeutic agents Eukaryotic cells that expressed the recombinant NK1-R are used as a modern method of screening candidate compounds for the ability to agonists and antagonists of NK-1 receptors In this study, a full length cDNA encoding NK1-R was isolated from Vietnamese lung tissue Nucleotide sequencing and deduced peptide sequences were identical to those isolated from Vietnamese brain tissue, but revealed different nucleotides and amino acids as compared to those presented in databank These variant amino acids appeared to not influence transmembrane domains following TMHMM server 2.0 programe Sequence polymorphisms can potentially influence the efficacy of drugs in patient populations and are an important consideration in the drug development process Therefore, identification of relation between these single nucleotide polymorphisms and the affinity interaction between NK1 receptor and its ligands is of interest in the future The specific Kozak sequence was integrated into the 5’ end of the full length cDNA in order to improve initial translation without difficulty Subsequently, the modified cDNA was subcloned into the expression vector pEGFP-N1 that was used for screening candidate compounds extracted from Vietnamese herbal medicines in the future Keywords: neurokinin-1 receptor (NK1-R), agonists of NK1-R, antagonists of NK1-R, P ligand, transmembrane G protein-coupled receptors * Author for correspondence:+84-4-22134496, E-mail: vothithuonglan@hus.edu.vn 658 ... NK1R vector biểu pEGFP-N1 Để khẳng định có mặt cDNA- NK1 vector biểu hiện, hai vector biểu pCDNA3NK1-11 peGFP-N1-NK1-5 giải trình tự (kết khơng hiển thị) Kết giải trình tự cho thấy cDNA- NK1 vector. .. bày kết phân lập cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể NK1 từ mô phổi, so sánh với cDNA phân lập từ mô não người Việt Nam thiết kế vector biểu mang cDNA- NK1-R hồn chỉnh nhằm mục đích chủ động biểu thụ. .. trình tự cho thấy cDNA- NK1 vector biểu khơng có sai khác so với trình tự cDNA gốc vector tách dòng pJET Điều chứng tỏ thành công việc thiết kế vector biểu mang cDNA hồn chỉnh mã hóa cho NK1-R người