DSpace at VNU: Tách dòng cDNA và thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1

TÁCH DÒNG cDNA VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 Võ Thị Thương Lan 1 , Lê Hồng Thu 1 , Đinh Đoàn Long 1,2 1 Trường Đại học Khoa học tự nhiên 2 , Đại học Quốc Gia Hà Nội

TÁCH DÒNG cDNA VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1

Võ Thị Thương Lan 1 , Lê Hồng Thu 1 , Đinh Đoàn Long 1,2

1 Trường Đại học Khoa học tự nhiên 2 , Đại học Quốc Gia Hà Nội

2 Khoa Y-Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

TÓM TẮT

Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein có vai trò quyết định hoạt động của các tế bào thần kinh, tham gia vào việc điều hòa các phản xạ nôn, hô hấp và các hành vi phản xạ Thụ thể NK1-R được phiên mã từ gen đơn bản nhưng gồm hai dạng sai khác nhau ở đầu carboxyl hình thành do cắt nối luân phiên mRNA Hai dạng NK1-R có ái lực liên kết khác nhau với các chất đồng vận hoặc các chất đối vận Biểu hiện NK1-R tái tổ hợp trong hệ thống tế bào động vật là phương pháp tối ưu hiện nay để sàng lọc các chất đối vận/đồng vận cạnh tranh với phối tử trong sản xuất các biệt dược điều trị các bệnh thần kinh, rối loạn đáp ứng miễn dịch Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R từ mô phổi của người Việt Nam Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của NK1-R phân lập từ mô phổi giống với NK1-R phân lập từ mô não của người Việt và có 4 amino acid sai khác so với trình tự gốc trong ngân hàng dữ liệu (Databank) Tuy nhiên, phân tích in silico cho thấy 4 sai khác này không ảnh hưởng đến cấu trúc xuyên màng của thụ thể cDNA hoàn chỉnh được đưa vào vector biểu hiện pEGFP-N1 nhằm mục đích xây dựng hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R tái tổ hợp để sàng lọc các chất đồng vận và đối vận thụ thể từ nguồn dược liệu Việt Nam

Từ khóa: Chất đối vận thụ thể, chất đồng vận thụ thể, phối tử P, thụ thể neurokinin-1 (NK1-R), thụ thể xuyên

màng liên kết G protein

MỞ ĐẦU

Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) là thành viên

trong họ thụ thể chứa 7 vùng kỵ nước xuyên màng

Đầu carboxyl của NK1-R liên kết với G protein bên

trong tế bào chất; đầu amino liên kết chủ yếu với

chất P (phối tử) ở bên ngoài màng tế bào (Severini et

al., 2000) NK1-R bắt đầu con đường truyền tải các

tín hiệu gây đau đớn và đáp ứng sinh lí (hô hấp, điều

hòa, các hành vi phản xạ) cho tế bào (InHae, Tae,

1995) Ở người, gen mã hóa NK1-R là gen đơn bản

có 5 exon, nằm trên nhiễm sắc thể số 2 Sau phiên

mã, có 2 dạng mRNA (khác nhau ở vùng 3’) được

dịch mã tổng hợp hai dạng NK1-R có ái lực khác

nhau với các chất đồng vận hoặc các chất đối vận thụ

thể (Jian et al., 2008) Trong khi các chất đồng vận

liên kết với thụ thể và có tác dụng tương tự như các

phối tử (ligands) thì các chất đối vận liên kết với thụ

thể nhưng không gây ra các phản ứng sinh học hoặc

làm giảm hay khóa các phản ứng trung gian của chất

đồng vận (Rosso, Mu˜noz, 2006) Phát triển các

thuốc đồng vận hay đối vận NK1-R đặc biệt có ý

nghĩa đối với điều trị nhiều bệnh, ví dụ như thuốc

giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh

đường hô hấp, điều trị chứng buồn nôn và sự nôn

mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư (Chamindi

et al., 2009; Rogers, Blackburn, 2010) Một ứng

dụng rộng rãi của thuốc đối vận NK1-R là tham gia vào việc điều trị chứng tâm thần phân liệt, trầm cảm

có liên quan đến việc tăng lượng dopamine trong não

bộ (Rupnipak, Kramer, 2002) Khi phối tử P liên kết với NK1-R thì lượng dopamine tăng Có thể điều chỉnh lượng dopamine bằng cách sử dụng các thuốc đối vận liên kết với NK1-R nhằm ngăn chặn sự tương tác của chất P (Rupnipak, Kramer, 2002) Năm 2003, lần đầu tiên chất đối vận NK1-R là aprepitant (Emend) được hiệp hội quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) Hoa Kỳ phê chuẩn cho phép sản xuất và lưu thông trên thị trường (Rogers, Blackburn, 2010)

Việc tìm kiếm các chất đối vận hoặc đồng vận NK1-R hầu hết dựa vào hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R nội sinh hoặc NK1-R tái tổ hợp (Quartara, Altamura, 2006) Với ưu điểm nổi bật về số lượng và phương thức biểu hiện nên NK1-R tái tổ hợp được

sử dụng trong các nghiên cứu cấu trúc, động học tương tác của NK1-R với chất đồng vận hoặc chủ vận (tăng khả năng phát hiện tương tác, chủ động gây đột biến định hướng làm thay đổi cấu trúc NK1-R,…) (Quartara, Altamura, 2006) Vì vậy, phân lập các cDNA hoàn chỉnh, biểu hiện NK1-R tái tổ hợp;

từ đó thiết lập các hệ thống tế bào sàng lọc thuốc từ

nguồn dược liệu đặc hữu là hướng phát triển thuốc

đang được quan tâm (Quartara, Altamura, 2006) Ở

Việt Nam, nghiên cứu về NK1-R, các chất đối vận

hoặc đồng vận NK1-R vẫn còn rất ít hoặc chưa được

công bố do hệ thống sàng lọc các chất này chưa khả

thi Nghiên cứu này của chúng tôi trình bày kết quả

phân lập cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể NK1

từ mô phổi, so sánh với cDNA phân lập từ mô não

người Việt Nam và thiết kế vector biểu hiện mang

cDNA-NK1-R hoàn chỉnh nhằm mục đích chủ động

biểu hiện thụ thể này để sàng lọc các chất có khả

năng tương tác với NK1-R từ dược liệu Việt Nam

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Mẫu u phổi sau phẫu thuật được giữ ngay trong

nitơ và được sử dụng để tách chiết ARN tổng số

bằng PureLink Kit (Invitrogen) Hai µg RNAtổng số

được dùng làm khuôn trong phản ứng phiên mã

ngược tổng hợp cDNA sử dụng oligoT và enzyme

Reverse Transcriptase (Invitrogen) Phản ứng được

thực hiện theo quy trình hướng dẫn của Invitrogen

Phương pháp

Phản ứng RT-PCR được thực hiện để khuếch đại

đoạn 5’-NK1 (788 bp) bằng cặp mồi NK1F:

GCCAGCAGATGGCGAAGG, và đoạn 3’-NK1

CAAGTCCCAGT GTGAGGGTG Phản ứng sử dụng 5 µl cDNA với chu trình nhiệt lặp lại 40 chu kỳ (94oC 5 phút; 60oC 30’’; 72oC 90’’) Sản phẩm sau

đó được xử lý với enzyme SmaI và nối với nhau nhờ

DNA ligase tạo nên cDNA hoàn chỉnh cDNA này được tách dòng trong vector pJET1.2 và biến nạp

vào E coli DH5a Vector pJET mang cDNA được kí

hiệu là pJET-NK1 Các phản ứng PCR đều sử dụng enzyme Pfu Taq polymerase có hoạt tính đọc sửa để đảm bảo tính chính xác trong quá trình nhân bản.Trình tự cDNA được xác định trên máy tự động

Vị trí mồi, kích thước sản phẩm RT-PCR được trình bày trên hình 1

Mồi NK1F3-: ATTTAAGCTTACCATGGATAACG TCCTCC (vị trí nhận biết của HindIII được gạch chân và

trình tự Kozak được in đậm) và mồi NK1R3:

TAAGGATCC CTAGGAGAGCACATTG (vị trí nhận biết của BamHI) được thiết kế để nhân bản cDNA hoàn chỉnh

của NK1-R từ khuôn pJET-NK1 Sản phẩm PCR với cặp mồi NK1F3/R3 được xử lý với hai enzyme

HindIII và BamHI và đưa vào vector biểu hiện

pEGFP-N1 đã được mở vòng với hai enzyme này

Vector pEGFP-NK1 được biến nạp vào E coli

DH5a; các thể biến nạp mang vector này được chọn lọc trên môi trường bổ sung kanamycine (50µg/ml) Trình tự nucleotide cDNA NK1-R hoàn chỉnh được xác định trên máy đọc tự động

KẾT QUẢ

Phân lập hai đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA

mã cho NK1-R

Sử dụng khuôn là cDNAs để khuếch đại hai

đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 bằng hai cặp mồi

NK1F/NK1R1; NK1F1/NK1R trong phản ứng PCR

Kết quả, đoạn 5’-NK1 đã được khuếch đại thành một

băng DNA rõ nét có kích thước gần 800 bp như tính

toán (Hình 2A) Trong khi kết quả khuếch đại đoạn

3’-NK1 có hai băng DNA, một băng có kích thước hơn 700 bp như mong đợi (Hình 2B), băng thứ hai kích thước hơn 500 bp có thể tương ứng với loại NK1-R ngắn

Hai đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 có kích thước hơn

700 bp được tinh sạch bằng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), được tách dòng trong vector pJET1.2 (Fermentas) và được biến nạp vào tế bào

khả biến E coli DH5α Một số khuẩn lạc mọc trên

môi trường LB được tách chiết DNA plasmid để

Hình 1 Sơ đồ phân lập cDNA thụ thể NK1 sử dụng các cặp mồi nhân bản vùng 5’-NK1 và vùng 3’-NK1 riêng biệt

kiểm tra khả năng mang gen của các vector tái tổ

hợp tương ứng pJET-5-NK1 và pJET-3-NK1

Tạo cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R

Plasmid pJET-3-NK1 được mở vòng bởi SmaI và

XbaI Sản phẩm PCR khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp

pJET-5-NK1 cũng được cắt với hai enzyme này và được đưa vào pJET-3-NK1 đã mở vòng để tạo thành đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R (Hình 3A)

Thể biến nạp E coli DH5α mọc trên môi trường kháng

sinh có plasmid chứa cDNA hoàn chỉnh (Hình 3B) Plasmid tái tổ hợp được kí hiệu pJET-NK1

Xác định trình tự nucleotide cDNA hoàn chỉnh

của NK1-R

Plasmid pJET-NK1 được tách chiết từ dòng

khuẩn lạc số 2 (Hình 3B) và được xác định trình tự

trên máy đọc tự động So sánh trình tự cDNA nhận

được từ mô phổi với trình tự cDNA hoàn chỉnh phân lập từ mô não người Việt Nam (Phan Ha Mỵ, 2012) không thấy bất kỳ sự sai khác nào Cả hai trình tự này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1) tương ứng với sai khác của 4 amino acid (Bảng 1)

Bảng 1 Sai khác về trình tự nucleotide và amino acid giữa thụ thể NK1 của người Việt với trình tự trên NCBI Các số trong

ngoặc chỉ vị trí của các nucleotide hoặc các amino acid trong trình tự gốc có trong ngân hàng Databank

cDNA-NK1-R

(M81797.1)

cDNA-NK1-R (Người Việt Nam)

NK1-R (NM_007053.3)

NK1-R (Người Việt Nam)

GAG (996) GGG E - Glutamic acid (332) G - Glycine

Hình 2 Điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn 5’-NK1 (A) và 3’-NK1 (B) (-): đối chứng âm không có khuôn cDNA; Giếng

NK1: cDNA hoàn chỉnh của NK1 M: Thang chuẩn SY-500

Hình 3 (A) Plasmid pJET-3-NK1 (p3’) và sản phẩm PCR (5’) được xử lý với hai enzyme SmaI và XbaI (B) Các khuẩn lạc

(1-4) mang cDNA hoàn chỉnh (~1.4 kb) sàng lọc bằng colony-PCR (-) Đối chứng âm không có DNA khuôn M 1 kb DNA ladder

Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA hoàn chỉnh

của NK1-R

Đoạn cDNA hoàn chỉnh được khuếch đại từ

plasmid pJET-NK1 với cặp mồi NK1F3/R3 (Hình 4A)

và được cắt với hai enzyme HindIII và BamHI Việc

thiết kế thêm trình tự Kozak (ACCATGG) trong mồi

NK1F3 cho phép sử dụng mã mở đầu trong trình tự

cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được thiết kế sẵn trên vector biểu hiện Do đó kích thước cDNA hoàn chỉnh giảm đi 100 bp ở vùng 5’ không dịch mã Vector pEGFP-N1 cũng được mở vòng bằng hai enzyme này cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R được đưa vào vector

mở vòng nhờ DNA ligase Các thể biến nạp mang vector biểu hiện có chứa cDNA được chọn lọc bằng phản ứng PCR (Hình 4B)

Giải trình tự cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho

NK1-R trong vector biểu hiện pEGFP-N1

Để khẳng định sự có mặt của cDNA-NK1 trong

các vector biểu hiện, hai vector biểu hiện

pCDNA3-NK1-11 và peGFP-N1-NK1-5 được giải trình tự (kết

quả không hiển thị) Kết quả giải trình tự cho thấy

cDNA-NK1 trong vector biểu hiện không có bất kỳ

sự sai khác nào so với trình tự cDNA gốc trong

vector tách dòng pJET Điều đó chứng tỏ rằng chúng

tôi đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện

mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R ở người

Việt Nam

THẢO LUẬN

NK1-R là một trong ba loại thụ thể của

tachykinin ở động vật có vú Trên thực tế, liên kết

chéo có thể xảy ra nhưng với ái lực liên kết rất khác

nhau giữa các thụ thể và tachykinin (Almeida et al.,

2004) Ví dụ như tachykinin P có ái lực liên kết với

NK1-R cao gấp 100 và 500 lần so với hai thụ thể

khác (Gerard et al., 1991) Phân tử mRNA phiên mã

từ gen NK1-R được cắt nối luân phiên tương ứng với

loại NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh (407 amino

acid) và loại NK1 bị xén cụt đầu carboxyl (311

amino acid) (Caberlotto et al., 2007) Việc xuất hiện

băng DNA có kích thước hơn 400 bp (Hình 2B) rất

có thể là cDNA mã cho dạng NK1-R ngắn Biểu hiện

của dạng ngắn không được phát hiện khi phân lập cDNA của NK1-R từ mô não người Việt, gợi ý sự hoạt động khác nhau của NK1-R ở các mô biệt hóa

(Baker et al., 2003)

Trình tự nucleotide cDNAs hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R của người lần đầu tiên được công bố bởi Hopkins và đồng tác giả (1991) Kết quả của chúng tôi cho thấy NK1-R mô phổi giống với NK1-R mô não người Việt và đều có 4 amino acid sai khác với

số liệu trong Databank Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho NK1-R của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu rất có thể là do tính đa hình nucleotide (SNPs) Sử dụng phần mềm

TMHMM server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/

màng của trình tự protein suy diễn thu được, chúng tôi nhận thấy cả 4 sai khác amino acid không ảnh hưởng đến tính xuyên màng Tuy nhiên, chỉ một amino acid sai khác cũng đủ làm thay đổi ái lực liên

kết với phối tử (Ciucci et al., 1997) Trình tự amino

acid của NK1 ở người và chuột có độ tương đồng cao 99%, tuy nhiên ái lực liên kết với cùng phối tử L-733060 thay đổi từ 0.87 với NK1-R của người đến

550 với NK1-R chuột (Almeida et al., 2004) Vì vậy,

việc thiết kế thành công vector biểu hiện NK1-R của người Việt Nam khẳng định mối liên hệ giữa sai khác 4 amino acid và ái lực kiên kết, đồng thời mở ra khả năng sử dụng hệ thống tế bào để sàng lọc các

Hình 4 (A) Plasmid pJET-3-NK1 (pC) và sản phẩm PCR (NK1) được xử lý với hai enzyme SmaI và XbaI pU: vector không

cắt với enzyme (B) Các khuẩn lạc (1-6) mang cDNA hoàn chỉnh (1241 bp) được sàng lọc bằng colony-PCR (-): Đối chứng

âm không có DNA khuôn M 1 kb DNA ladder

chất đối vận, đồng vận với NK1-R từ nguồn dược

liệu phong phú đa dạng của nước ta

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã thiết kế được vector biểu hiện

pEGFP-N1 mang cDNA hoàn chỉnh của NK1-R phân

lập từ mô phổi người Việt Nam Trình tự amino acid

suy diễn giống với NK1-R phân lập từ mô não người

Việt và có 4 sai khác so với trình tự gốc trong

Databank Phân tích mô phỏng cho thấy sự sai khác này

không ảnh hưởng đến tính xuyên màng của thụ thể, tuy

nhiên ái lực kiên kết với phối tử cần nghiên cứu tiếp

trên hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R tái tổ hợp

Lời cảm ơn: Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ

của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho đề tài

ĐT-PTNTĐ 2011-G/04 để thực hiện nghiên cứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Almeida TA, Rojo J, Nieto PM, Pinto FM, Hernandez M,

Martín JD, Candenas ML (2004) Tachykinins and

tachykinin receptors: structure and activity relationships

Bentham Science Publishers 11: 2045-2057

Baker SJ, Morris JL, Gibbins IL (2003) Cloning of a

C-terminally truncated NK-1 receptor from guinea-pig

nervous system Brain Res Mol 11: 136-144

Caberlotto L, Hurd YL, Murdock P, Wahlin JP, Melotto

S, Corsi M, Carletti R (2007) Neurokinin 1 receptor and

relative abundance of the short and long isoforms in the

human brain Eur J Neurosci 17: 1736-1749

Chamindi S, Nassima AD, Jennie ZM, Guobo C, Bankole

AJ, Ming DL (2009) Susceptibility locus in neurokinin-1

receptor gene associated with alcohol dependence

Neuropsychopharmacology 34: 2442-2456

Ciucci A, Palma C, Riitano D, Manzini S, Werge T (1997)

Gly166 in the NK1 receptor regulates tachykinin

selectivity and receptor conformation FEBS Letters 416:

335-351

Gerard NP, Garraway LA, Eddy RL, Shows TB (1991) Human substance P receptor (NK-1): organization of the gene, chromosome localization and functional expression

of cDNA clones Biochem 30: 10640-10654

Hopkins B Powell SJ, Danks P, Briggs I, Graham A (1991) Isolation and characterization of the human lung

NK-1 receptor cDNA Biochem Biophys Res Commun

180:1110-1118

InHae J, Tae HJ (1995) Differential roles of exoloop 1 of the human follicle – stimulating hormone receptor in

hormone binding and receptor activation J Biol Chem 270:

15970-15993

Jian PL, Saien L, Florin T, Morris FT, Laurie EK, Susan

EL, Steven DD (2008) Differences in the length of the carboxyl terminus mediate function properties of

neurokinin-1 receptor PNAS 105: 12605-12619

Phan Hà Mỵ (2012) Tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 từ mô não người Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Severini C, Salvadori S, Guerrini R, Falconieri-Erspamer

G, Mignogna G, Erspamer V (2000) Parallel bioassay of

39 tachykinins on 11 smooth muscle preparations Structure and receptor selectivity/affinity relationship

Peptides 21: 1587-1601

Quartara L, Altamura M (2006) Tachykinin receptors

antagonists: from research to clinic”, Current Drug Targets 7: 975-992

Rogers MP, Blackburn L (2010) Use of neurokinin-1 receptor antagonists in patients receiving moderately or

highly emetogenic chemotherapy Clin J Oncol Nurs 14:

500-517

Rosso M, Mu˜noz M (2006) Pharmacology Guide In vitro pharmacology: concentration-response curves

Neuropsychopharmacology 21: 1245-1256

Rupnipak MJ, Kramer MS (2002) Substance P and related

tachykinins Neuropsychopharmacology 17: 169-191.

CLONING THE FULL LENGTH cDNA ENCODING NEUROKININ 1 RECEPTOR (NK1-R) AND CONSTRUCTING NK1-R EXPRESSION VECTOR

Vo Thi Thuong Lan 1,*, Le Hong Thu 1 , Dinh Doan Long 1,2

1 Hanoi University of Science, Hanoi National University

2 School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University

SUMMARY

The NK1 receptor (NK1-R) is a member of family 1 of G protein-coupled receptors and is responsible for transmitting signals from the extracellular environment It plays an important role in pain and inflammation, and controlling chemotherapy-induced nausea and vomiting It is also involved in the neural circuitry of anxiety, depression and emesis These evidences have led to the development of bio assays based on recombinant NK1-R to screen agonists and antagonists for purpose of therapeutic agents Eukaryotic cells that expressed the recombinant NK1-R are used as a modern method of screening candidate compounds for the ability to agonists and antagonists of NK-1 receptors In this study, a full length cDNA encoding NK1-R was isolated from Vietnamese lung tissue Nucleotide sequencing and deduced peptide sequences were identical to those isolated from Vietnamese brain tissue, but revealed 4 different nucleotides and amino acids as compared

to those presented in databank These variant amino acids appeared to not influence transmembrane domains following TMHMM server 2.0 programe Sequence polymorphisms can potentially influence the efficacy of drugs in patient populations and are an important consideration in the drug development process Therefore, identification of relation between these single nucleotide polymorphisms and the affinity interaction between NK1 receptor and its ligands is of interest in the future The specific Kozak sequence was integrated into the 5’ end of the full length cDNA in order to improve initial translation without difficulty Subsequently, the modified cDNA was subcloned into the expression vector pEGFP-N1 that was used for screening candidate compounds extracted from Vietnamese herbal medicines in the future

Keywords: neurokinin-1 receptor (NK1-R), agonists of NK1-R, antagonists of NK1-R, P ligand,

transmembrane G protein-coupled receptors.