DSpace at VNU: Tách dòng gen mã hóa một chất ức chế Tripxin của hạt bí đỏ (Cucurbita Maxima) CMTI-V và biểu hiện ở E.Coli

DSpace at VNU: Tách dòng gen mã hóa một chất ức chế Tripxin của hạt bí đỏ (Cucurbita Maxima) CMTI-V và biểu hiện ở E.Col...

rAP CHỈ KHOA HỌC DHQGHN KHTN & CN, T x x , sỏ' 3, 2004 TÁCH DỊNG GEN MẢ HỐ MỘT CHAT ứ c CHẺ TRIPXIN CỦA HẠT BÍ Đ ỏ { C U C U R B I T A M A X IM A ) CMTI-V VÀ BIẺƯ H IỆ N Ở E C O L I Đào Thị T h u ý, N g u y ể n Q uỳnh U yến, N g u y ển Thị B ích Hậu, Vò T hị T h n g Lan P h ạm Thị Trân Châu T rung tăm Công nghệ S in h học, Đại học Quốc gia Hà Nội Mở đ ầ u Các protein ức chê tripxin (TI) h t họ bầu bí (Cucurbitaceae) phát muộn TI thực v ậ t khác quan tâm nghiên cứu nhiêu chúng có đạc tính q m ặt khoa học có tiềm ứng dụng lớn Hạt háu hết loại bầu bí kê TI có cấu trúc vòng p h át từ h ạt gấc [4] đêu có TI với khơi lượng phân tứ vào khống kDa, có cầu clisunfua, chúng dược xếp thành họ mới, họ TI báu bí (squash inhibitor) [9) Trong sơ TI họ b ầu bí, TI phân tứ thấp hạt bí đỏ (CMTI-I, III) phát sớm ngồi tác dụng ức chế tripxin TI ức ch ế factor Xlla [6] (proteinaz-xerin xúc tác cho p h ản ứng đẩu tiên q trình đơng máu) Gần [7] người ta phát TI khác từ hạt bí dỏ, CMTl-V khác với CMTI biết, CMTI-V bao gồm 68 axit am in, chi có cẩu đisuníua, có khỏi lượng p h ân tử 7,lkD a, có tính kiềm có tác dụng ức chê đặc hiệu factor XIla Tuy nhiên hàm lượng TI h ạt bí đỏ tương đơi thấp, đà có scY cơng trình nghiên cứu sử dụn g kỹ th u ậ t ADN tái tơ hợp đê tách dòng gen mã hố chúng [ 1,2,13,14] với hy vọng có th ể sản x u ất biện pháp Cơng nghệ Sinh học Cơng trình tách gen mã hố CMTI-V từ h t bí đỏ, sử dụng kỹ th u ậ t ADN tái tô họp đế tách dòng biếu gen CMTI-V E.coli N gu yên liệu p h n g p h áp 2.1 Nguyên liêu - Lá bí đô (Cucurbita m axima) cần non tươi sử dụng làm nguyên liệu đê tách ADN tổng số - Chúng E.coli DHõcx (MBI Fermentas) dùng làm tế bào chủ đê n h â n plasmit tái tô hợp C hủng E.coli BL21 (DE3) Life Technologies (Mỹ) dùng đê biêu protein tái tố họp Các mồi clo Invitrogen life technologies tống hợp theo th iết kê chủng tơi Các hố chất thơng dụng Sinh học phân tử cáchãng Sigma, Bio.Rađ, Promega đNTPs, Mix ladder, Taq DNA polimeraz, X DNA ladder Finnzym es, BamHI, Tị DNA ligaz Promega Tripxin tuỵ tạng bò chât BApNA (Nu-benzoyl-DLarginine-p-nitroanilide hydrochloride) Sigma; Plasm it pET 14b h àn g Invitrogen; Kit để tách ADN tổng số tách plasm it Qiagen; X-gal (Bromo-4-chloro-3 indolyl-P-Dgalaetopyranoside) MBI F erm entas; Glass microfibre filters W hatm an, Anh Đ o T h ị T h ú y Nizuvcn Q u ỳ n h U ycn 2.2 Phương p h p - Tách ADN tồn phần từ bí đỏ: ADN tơng sơ bí đỏ non làm khn p h ản ứng PCR tách theo phương pháp Eija Pehu cộng [3] Kiêm tra hàm lượng độ ADN phương pháp đo độ hấp thụ ỏ bước sóng 260nm, 280nm; phương p h áp điện di gel agaroz - Tách dòng nhản gen CMTI-V Đà sử dụng cặp mồi sau: Mồi xi (forward primer) có chứa tru n g tâm n h ậ n biết Ndel: CAATGGATCCTCCTGCCCAGGTAAGTC Mồi ngược (reverse primer) có chứa tru n g tâ m n h ận biết BamH I: CGCGGATCCGCGTATACCG A TC CTC G G Phản ứng PCR đê tổng hợp kiếm tra lại gen CMTI-V thực sau: thê tích hỗn họp phản ứng 25f.ll bao gồm: 2f.ll ADN genom bí đỏ (520ng ADN), l,25|.il mồi xuôi (225ng), 1.25|il mồi ngược (22õng), 0.5fil dNTPs (200|.iM), 0.5|.il Taq polimeraz (0.5IU), 19,5|.il đệm PCR lần Chương trình chạy PCR: biến tính ADN khuôn 94°c phút, nhiệt độ gắn mồi 63"C phút, tổng hợp 72°c phút, tổng sô" 30 chu kỳ, nh ân lại gen CMTIV phút 72°c, cuôi sản phẩm PCR giữ 4°c kiêm tra agaroz Kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp điện di trê n agaroz 2%, tinh qua Glass Microfibre filters (GF/D, GF/C, W hatm an, UK) - Phương pháp điện di ADN gel poliacrilam it 5% [12]: Đệm điện di TAE, tiến hành diện di ỏ điều kiện 90 phút, 150V Sau điện di, cô định etanol 10% phút, rửa bàng dung dịch HNO.ị 3% phút, rửa nước Milli Q phút, nhuộm bàng AgNO;* 0,2% 20 phút, rửa AgNO nước Milli Q, cuối băng ADN dung dịch Na , c o ị 3% 0,1% focmaldehit tro ng khoảng phút, giữ gel axit acetic 10% - Điện di gel poliacrilamit 15% p h át băng TI theo phương pháp mô tả trước [8] 2.3 Thiết k ế v e c tơ tái tô hợp Plasmit pET-14b có chứa trung tâm n h ận biết Bam H I Nde I mở vòng cách xử lí với enzim điểu kiện: 37°c Tạp chi Khoa học Đ H Q G IIN K Ì I T N C K I XX So 2004 'lac'll ilònii *1011 m ã hóa mõi chãi ức chẽ San phàm PCR n hân bán ADN genom bí đỏ với mồi xuôi mồi ngược dạc hiệu (luộc tinh sạch, cat với BamH I Ncle I (ỏ điểu kiện 37“C £ÌỊ') đưa vào plasmit pKT-14b đà mỏ vòng enzim Phán Íiníí íỊan thực 4°c thòi gian 16 giò' nhò T liga/ [10] Vectơ tái tô họp pET-14b - CMTI-V viết tá t (pET-TI-V) biên nạp vào chủng E.coli DHõcx phương pháp sốc nhiệt [5] Các thê biên nạp sàng lọc môi trường thạch Luria-Bertani (LB) (l°b tripton, 0,5% cao nấm men, 1% NaCl) có bổ sung ampixilin (100|.ig/ml), nuôi qua đêm ỏ 'M"C Chọn k h u ẩn lạc m ầu trắ n g (có m ang AON ngoại lai) cấy chuyền sang đìa thạch mơi trường LB có ampixilin (100|.ig/ml) đê dùng cho thí nghiệm tièp theo Ni vi khn E.coli D H õa tái tô hợp, tách plasmit tái tô hợp, tinh (theo phương pháp Qiagen [11] Cat bang enzim giới h n BamH I Nde I, kiểm tra phương pháp PCR, sản phárn dược kiêm tra kích thước cách điện di gel agaroz 2°() với thang chu an ADN Dòng vectơ m ang gen CMTI-V đà qua kiểm tra trôn, giãi trình tự vùng có cADN theo phương pháp Sanger 2.4 Biêu protein tái tơ ìuỉp ỏ E.coli Vectớ tái tô hợp pET-14b-TI-V biến nạp vào chủng E.coli BL21 phương pháp sồc nhiệt [5] S àng lọc vi k h u â n tủi tô hợp mơi trường thạch LB có ampixilin, X-gal, khn lạc trán g ni trơn mơi trường lỏng có chứa ampixilin (100|Ag/ml) 37°c đến đạt g\{\ trị 00,;,,,,= 0,6 Thêm IPTG (isopropyl P-thiogalactoside) đê cảm ứng biếu protein (tích Thu sinh khơi tê bào, phá m àng tê bào b ằng siêu ám (máy Sonicprep 150 cua Đức), thể tích tê bào + 50 th ể tích dung dịch đệm TE (lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH=8,0), li tâm 12.000 vòng /ph út 4°c 30 phút, th u dịch giữ ỏ —20nc đê cho thí nghiệm tiỏp theo Kiếm tra h o ạt tính protein tái tơ hợp phương pháp PAGE có chứa ch ất [8] Kết th ả o lu ận 3.1 Tách tinh chê ADN tổng sơ Lá bí đỏ non nghiền nitơ lóng, chiết theo tỉ lệ 1:4 (mg/f.il) dung dịch AP, nồng độ RNAz cuôi lOO^g/ml, giữ 65°c 10 phút, thêm 130 Ị.il AP, giữ nước đá Tạp ('In Khoa học t ) Ỉ I Q ( i l / \ K / Ỉ T N cC C/V I XX, SỐ J 2004 Đ o T h ị T h ú y , N íĩu v ẻn Q u ỳn h U yên phút, li tám, thu dịch nổi, cho qua cột QIA shreder (QIAsMC), thu dịch qua cột Thêm dung dịch AP.J, etanol vào dung dịch nhận qua cột theo tỉ lệ thê tích 0,5:1:1, trộn cho tồn hỗn dịch qua cột Dneasy MC, rửa cột lần dưng dịch đệm AW Thôi ADN khỏi cột 100f.ll dung dịch đệm AE Kiêm tra nồng độ độ ADN tống số điện di agaroz máy quang phô (spectronic Unicam) Kết nhận tỉ lệ OD2(;o/ODJ8() 1,86-1,90, chứng tỏ chế phẩm có độ đạt yêu cầu Điện di gel agaroz 0,8% với thang chuẩn X ADN nồng độ khác cho thấy hàm lượng ADN tống số’ thu 260ng/ml Như vậy, ADN thu có chất lượng tốt hàm lượng đủ cho nghiên cứu tiếp 3.2 Nhản đoạn gen CMTỈ-V từ ADN genom bí đủ kỹ thuật PCR Sứ dụng ADN tinh làm khuôn phán ứng PCR, với mồi xuôi, mồi ngược điều kiện phản ứng nêu phần phương pháp Theo tính tốn lí thuyết sê nhận sản phẩm phản ứng có kích thước 230bp Kết q điện di gel poliacrilamit 5% (hĩnh 1) cho thấy sản phẩm PCR thu có băng với kích thước tính tốn lí thuyết vào khống 230bp H ì n h 1: Đ iệ n di đồ s n p h ẩ m P C R s ứ d ụ n g A D N g e n o m bí n g l m k h u ô n - Thang ADN chuẩn (1 0 - 0 0 b p ) - S ả n p h ẩm PCR - 230bp — 230bp Phân tích trình tự nưcleotit chứng tỏ gen CMTI-V (kết khơng trình bày đây) Ngồi ra, chúng tơi tống hợp gen mă hố CMT1-V theo phương pháp mơ tả trước [14] nhân đoạn gen tông hợp kỹ th u ậ t PCR với phản ứng PCR Tạp chi Khoa học Đ Ỉ I Q G I /N K ỈỈT N C N I XX Sò'3, 2004 Tách dònc gcn mã hóa chất ức chẽ nơi tiếp nhau, phản ứng sau sử dụng sản phẩm phản ứng trước làm khuôn, với mồi xuôi ngược Kết hình cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 230bp, theo tính tốn lí thuyết Sản phâm PCR tinh qua màng Recochip, nhận băng ADN sác nét, có kích thước tương ứng 230bp (hình 3) — 1353 — 1078 — 872 — 603 — 310 — 281 — 234 — 194 -►118 -*72 H ì n h 3: K ế t q u ả t i n h s c h s ả n p h ẩ m H ì n h 2: K ế t q u ả t n g h ợ p g e n C M T I-V - S ả n p h ẩ m P C R với n n g độ c ủ a m i m ồi 0 n g 2- S ả n p h ấ m P C R với n n g độ m ồi m ồi n g - T h a n g A D N c h u ấ n (lOObp) 4,5- S ả n p h ẩ m P C R 2, m ồi xuôi, mồi ngược, k h u ô n s ả n p h m P C R l P C R c ủ a g e n C M T I-V 1- T h a n g A D N c h u ẩ n (lOObp) 2- S ả n p h ẩ m P C R (c ủ a cột 4, ả n h 3) sau tin h 3- T h a n g A D N c h u ẩ n Â/Hae III (lOObp) 3.3 Tách dòng gen CMTI-V Đê thu đủ sô* lượng gen CMTI-V dùng biến nạp, sản phẩm PCR nhân từ genom bí đò tinh sạch, cắt BamHI Ndel, điện di gel agaroz 2% đê tách tinh gen CMTI-V, nôi vào plasmit pET 14b cắt với enzim BamHI Ndel Quá trình gắn gen vào plasmit thực nhờ T J ligaz Vectơ mang gen CMTI-V (được kí hiệu pET-TI-V) biến nạp vào tê bào khả biến E.coli chủng DHõa đê nhân vectơ tái tô hợp Kết biến nạp sàng lọc' mơi trường LB-agar có Tạp chi Khoa học D H Q G IIN K H I N Ầ CA/ T.xx, S ổ 3, 2004 Đ o T h ị T h ú y , N g u yễn Q u ỳ n h Uyên ampixilin, X-gal IPTG, khuẩn lạc màu trắng (khuẩn lạc dương tính) vi khuẩn tái tồ hợp có chứa pET-TI-V 3.4 Kiếm tra tiếp sản p h ẩ m biên nạp PCR Tách ADN plasmit từ k huẩn lạc dương tính dùng làm khuôn PCR với cặp mồi xuôi, ngược đặc hiệu gen CMTI-V Kết hình cho thấy sản phẩm PCR có băng ADN sắc nét nhân từ vectơ tái tổ hợp có kích thước tương ứng vối sản phẩm PCR sử dụng ADN genom bí đỏ làm khn, tách dòng E.coli Hình 4: - Đ i ệ n di đồ s ả n p h ẩ m P C R t r ê n P A G E 5% A D N p l a s m i t t c h t k h u â n lạc d n g t í n h £ 500 400 300 230bp 200 - T h a n g A D N c h u ẩ n ( 0 -1 0 0 b p ) 2S ả n p h ẩ m PC R sử d ụ n g ADN p lasm it t i tô h ợ p m k h u ô n với c ặ p mồi đặc h i ệ u c h o g e n C M T I-V 3- S ả n p h ẩ m P C R s d ụ n g A D N g e n o m b í đỏ m k h u ô n 100 Đế tiếp tục kiểm tra sản phẩm biến nạp, plasmit k h uẩn lạc dương tính tinh xác định trìn h tự nucleotit đoạn gen đích nối vào plasm it pETl4b Kết trình bày hình Tạp chí K lioa liọc Đ H Q G H N K IIT N & C N , r.xx, S ố ,2 0 Tách cỉòiìi! nen m hóa chất ức chê 10 G G i : ' 20 I í G SO I G c c c: Ũ C c c I G c C ] i: r V G c G c i: G »: i G c c i: G c I G \ VO H I c c 120 c c c ! c I* G c 80 I ft tì A 110 i: ì i: C 70 c c 1*0 30 C 60 c 100 ; c G C c G T i G G G G 130 c ' c r> c c n c •: c ‘ì f< c fi c G 11(0 G c G c c G I V c c G • i: c c( I C C c c atccgaacgttaaagctgttatcctggaagaaggtacaccagttaccaaggaettcaggt 120 gcaacagggttaggatctgggttaacaagagagtctggtagtatcaccaccgaggatcgg 180 ttaacgcggatcatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgat 240 Hình G 5: K ế t q u a x c đ ị n h t r ì n h t ự đ o n A D N p l a s m i t t i tố h ợ p có c h ứ a g e n C M T I-V 3.5 Biêu gen CMTI-V E.coli BL21 Plasmit tái tô hợp pET-TI-V biến nạp vào E.coli BL21 (DE3), kí hiệu BL21pET-TI-V Sau biến nạp, cấy trải vi khuẩn tái tổ hợp mơi trường LB đặc có ampixilin X-gal, chọn khuẩn lạc trắng (khuẩn lạc dương tính, biến nạp) nuôi cấy tiếp môi trường LB lỏng có ampixilin ỏ 37°c qua đêm, tách plasmit kiêm tra l ap chí Khoa học D H Q G ỈIN K IIT N & C N I XX So 3, 2004 Đ T h ị T h ú y , N g u yễn Q uỳnh U yển kỹ th u ật PCR Kết hình cho thấy kh uẩn lạc cho sản phẩm PCR kích thước dự tính 230bp 230b| 1011 Hình 7: Điện di đồ sản phẩm PCR PAGE 5% (sử dụng ADN plasmit H ì n h 6: Đ iệ n di đồ s n p h ấ m P C R t r ê n gel a g a r o z 2% (sứ d ụ n g A D N p l a s m i t tá i tô hợp t c h t c ác k h u â n lạ c k h c n h a u c ủ a B L - p E T -T I- V m k h u ô n ) 1- T h a n g A D N c h u ẩ n ( M a r k e r M ix: t 0 -1 0 0 b p ) 2-11: sản p h ẩm PCR AD N p lasm it c ủ a k h u â n lạc d n g t í n h k h c n h a u t i tô h ợ p t c h t c c k h u ẩ n lạc k h c n h a u c ủ a B L - p E T - T I - V m k h u ô n ) - Thang ADN chuẩn (Marker lOObp: từ 80-1031bp) 2,3 - Đôi chứng: sản phẩm PCR ban đầu (sử dụng ADN genom bí đỏ làm khn với mồi xi, ngược (1 Ị-il 0,5f.il) 4,5,6 - Sản phẩm PCR ADN p l a s m i t t c h t c c k h u ẩ n lạc k h c n h a u c ủ a B L - p E T -T I -V Các khuẩn lạc dương tính nuôi môi trường LB lỏng, cảm ứng IPTG đê biếu gen CMTI-V Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng, thòi gian, nhiệt độ ni cấy v.v đến q trình biểu (kết khơng trình bày đây) Ớ điều kiện lựa chọn tiến hành nuôi vi k huẩn máy lắc lên men Sau thu tê bào vi khuẩn, phá võ màng tê bào li tâm Kiểm tra hoạt tín h protein tái tổ hợp có dịch sau li tâm phương pháp điện di gel poliacrilamit SDS, có chất [8] Kết hình cho thây có băng TI chủ yếu (băng màu xanh trefi trắng) Tạp chí Khoa học Đ H Q G ỈỈN , K H I N & C N r.xx Sơ'3 2004 Tách dòiiíi ecu mã hóa chãi ức chc Hình 8: Điện di gel poliacrilamit 15% khơng SDS, có chất, băng TI có màu xanh Kết luận Đã tách tinh chế ADN genom bí đỏ có độ đạt tỉ lệ OD260/OD280 1,86-1,90 Gen mã hoá CMTI-V nhân lên kỹ th u ậ t PCR sử dụng ADN genom bí đỏ làm khn, tinh xác định trình tự Gen mã hoá CMTI-V tổng hợp th àn h công từ mồi gôl Đã thiết kê vectơ tái tố hợp mang gen CMTI-V (pET-TI-V) nhân dòng E.coli DH5a Biểu gen CMTI-V E.coli BL21, nhận protein tái tổ hợp có hoạt tính ức chê tripxin TÀI LIỆU THAM KHẢO Bolewska, K., Krowarsch, D., Otlewski, J., Jaroszewski, L., Bierzynski, A., Synthesis, cloning and expression in E.coli of a gene coding for the Met 8->Leu CMTI-I- a r e p r e s e n t a t i v e o f s q u a s h i n h i b i t o r s of s e r in e p r o t e i n a s e s F E B S L e t t e r s V 7 (1995), p p 172-174 Botes DP., Qobose MD., Corfield VA Synthesis of wild type and three mutant Cucurbita maxima trypsin inhibitor encoding genes by a single-strand approach Gene V 105 N" (1991), pp 243-247 Deana Namuth, Kimmo Koivu, Jelena Arbatova, Viktor Kuvshinov and Eija Pehu Advanced plant Molecular Biology Laboratory M anual, University of Helsinki, Finland (1998), pp 4-7 Hernandez, J.F., Gagnon, J., Chiche, L., Nguyen, T.M, xA.ndrieu, J.P., Heitz, A., Trinh H.T., Pham T.T Chau., and Le Nguyen D., V Squash trypsin inhibitors from Momordica cochinchinensis exhibit an atypical macrocyclic structure Biochemistry, V 39 (2000), pp 5722-5730 Hioraki Inoue, Hiroshi Nojima and Hiroto Okayama, Transformation of E coli with plasmids, Genef96 (1990), pp 23-28 Tạp chi Khou học Đ H Q G H N K H T N & C N r.xx So 3, 2004 Đ o T h ị T h ú y Nszuycn Q u ỳ n h U ycn 10 Hojima, Y., Pierce, J.V., and Pisano, J.J., Pumpkin seeds inhibitor of human Faxtor Xlla, (activated Hageman factor) and bovine trypsin Biochemistry V.21, (1982), pp 3741-3746 Krishnamoorthi, R., Gong, Y.-X., and Richardson, M A new protein inhibitor of trypsin and activated Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds FEBS Letter V 273, (1 9 ) p p - Pham Tran Chau, Konopska L., Leluk J., Trypsin inhibitors in the aleurone grains of Cucurbita pepo var patissonina (white bush) cotyledons Biochem Physiol, pflartz V 181 (1 ) , p p - Polanowski, A., Otlewski, J., Leluk, J., Wilimowska - Pelc, A., and Wilusz, T., A new family of serine proteinase inhibitors from squash seeds Biol Zentralbl V 107, (1988), pp -4 10 Promega Protocols and Applications Guide (1989), pp 52-56 11 Qiagen Mini Hand book (1999), p p - ll 12 Ulrike Schindler and Anthony R Cashmore Methods in Plant Molecular Biology A Laboratory Course Mannual, (1995), Cold Spring Harbor laboratory Press in USA, pp 275-277 13 Võ Thị Thương Lan, Phạm Thị Trân Châu, Phân lập gen mã cho tripxin inhibitor (TI-IV) từ sô thuộc họ bầu bí kỹ thuật PCR Di truyền ứng dụng Chuyên san CNSH ( 0 ), p p - 14 Wen L., Kim S-S., Tinn T.T., Hoang J-K., Krishnamoorthi Gong Y., Lwin Y N., and Kyin s C h e m ic a l s y n th e s is , M o le c u la r clo n in g , o v e re x p re s s io n a n d s ite - d ir e c te d m u t a g e n e s i s of th e gene coding for pumpkin (Cucurbita maxima) trypsin inhibitor CMTI-V Protein Expression and purification V.4 (1993), pp 215-222 VNU JOURNAL OF SCIENCE Nat., Sci., & Tech., T xx, N03, 2004 CLONING AND EXPRESION IN E.COLI OF THE GENE CODING FOR PUMPKIN (CUCURBITA MAXIMA) TRYPSIN INHIBITOR, CMTI-V Dao Thi Thuy, N gu y en Q uynh U yen, N gu yen Thi B ich Hau, Vo Thi T h u o n g Lan and P h am Thi Tran Chau Centre o f Biotechnology, Vietnam N ational U niversity, H anoi CMTI-V is a trypsin inhibitor discovered in 1990 from pum pkin seeds It consists of 68 amino acid residues in a single chain and one didulfide bridge, M r of T.lkDa The CMTIV also specifically inhibits factor Xlla However the content of CMTI-V in pumpkin seeds is rather low, therefore it is worthy to study the gene encoding CMTI-V, cloning and expression of the gene in E.coli For this purpose, the total genomic DNA from pumpkin (C ucurbita m axim a) was isolated and purified The CMTI-V gene was sucessfully cloned from genomic DNA of pumpkin by PCR technique, using its specific forward and reverse prim ers containing restriction enzyme specific sites The PCR amplified product was inserted into plasmid pET-14b to form pET-14b-CMTI-V and transformed into E.coli DH5a Selection and checking the positive clones by PCR and the target gene in recom binant vector was sequenced The obtained results indicated th a t the gene was sucessfully cloned The target gene was expressed in E.coli BL21 (DE3) and the recombinant protein was tested for inhibitory activity against trypsin on PAGE containing substrate One major TI band was found Tạp chí Khoa học D H Q G ỈỈN K i n N C N T.xx S ố 2004 ... (lOObp) 3.3 Tách dòng gen CMTI-V Đê thu đủ sô* lượng gen CMTI-V dùng biến nạp, sản phẩm PCR nhân từ genom bí đò tinh sạch, cắt BamHI Ndel, điện di gel agaroz 2% đê tách tinh gen CMTI-V, nôi vào plasmit... c atccgaacgttaaagctgttatcctggaagaaggtacaccagttaccaaggaettcaggt 120 gcaacagggttaggatctgggttaacaagagagtctggtagtatcaccaccgaggatcgg 180 ttaacgcggatcatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgat... khơng SDS, có chất, băng TI có màu xanh Kết luận Đã tách tinh chế ADN genom bí đỏ có độ đạt tỉ lệ OD260/OD280 1,86-1,90 Gen mã hoá CMTI-V nhân lên kỹ th u ậ t PCR sử dụng ADN genom bí đỏ làm khn,