Phân lập, tuyển chọn và tách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc

Phân lập, tuyển chọn và tách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

LỜI MỞ ĐẦU 3

PHẦN I TỔNG QUAN 4

1.1 XYLAN 4

1.2 PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN 5

1.3 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE 7

1.3.1 Khái niệm về xylanase 7

1.3.2 Phân loại xylanase 8

1.4 CẤU TRÚC CỦA XYLANASE 9

1.5 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE 11

1.6 NGUỒN THU XYLANASE 13

1.6.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn 13

1.6.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc 14

1.7 ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE 17

1.7.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 17

1.7.2 Trong sản xuất bánh 17

1.7.3 Trong sản xuất rượu vang 18

1.7.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu 18

1.7.5 Trong chất hoạt động bề mặt 18

1.7.6 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy 19

1.8 TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE 19

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 VẬT LIỆU 21

2.1.1 Nguồn phân lập 21

2.1.2 Hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Phương pháp phân lập 23

2.2.2 Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc 23

2.2.3 Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS 24

2.2.4 Phương pháp định tên nấm mốc 25

2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA 26

2.2.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 27

2.2.7 Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR 28

2.2.8 Phương pháp tinh sạch một đoạn DNA 28

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH XYLANASE CAO 31

3.2 ĐỘNG HỌC SINH TỔNG HỢP ENZYM XYLANASE CỦA CHỦNG C1 VÀ B7 34

3.3 ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOI HÌNH THÁI 36

3.4 ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 38

3.4.1 Tách chiết DNA tổng số 38

3.4.2 Khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng phản ứng PCR 39

3.4.3 Giải trình tự đoạn được khuếch đại và phân tích trình tự 41

3.5 THIẾT KẾ ĐOẠN MỒI ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HOÁ XYLANASE.46 3.6 KHUẾCH ĐẠI GEN MÃ HOÁ XYLANSE 47

3.7 GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ĐÃ ĐƯỢC KHUẾCH ĐẠI VÀ KIỂM TRA ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG TRÊN NGÂN HÀNG GEN THẾ GIỚI 50

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 62

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khốikhổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn Tất cả mọi hoạt động của con người cũngnhư các loài động vật đều cần đến thực vật Chúng là nguồn lương thực để nuôisống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu chocác ngành công nghiệp Để thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào cho phù hợp vớisản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc của thành tế bào thựcvật Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose,hemicellulose và lignin cho nên để phá hủy một phần hoặc toàn bộ chúng thì người

ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh hay kiềm mạnh Do đó chi phí

để sản xuất các sản phẩm như giấy thường cao và nhất là gây ảnh hưởng nghiêmtrọng đến môi trường sinh thái Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay thế bằngcác phương pháp an toàn hơn đối với môi trường Và giải pháp cho vấn đề này làcác loại enzym thủy phân các polyme sinh học kể trên

Một loại enzym hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm làxylanase Enzym này có khả năng thủy phân hiệu quả các xylan – là thành phần chủyếu của hemicellulose trong thành tế bào thực vật Xylanase có rất nhiều ứng dụngtrong công nghệ chế biến giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sảnxuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanolsinh học) từ phế thải nông nghiệp

Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng việc sử dụngxylanase còn hạn chế do hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật tự nhiênsinh enzym này chưa cao Thông qua đề tài nghiên cứu "Phân lập, tuyển chọn vàtách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc" hy vọng sẽ lựa chọn được gen

mã hóa xylanase có hoạt tính cao, tiếp tục những nghiên cứu để sản xuất đượcxylanase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu thị trường

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 XYLAN

Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấytrong thành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose [1] Thuậtngữ hemicellulose được dùng để chỉ những polysaccharide thành tế bào thực vật màkết hợp chặt chẽ với cellulose và glucan Trong thực tế, thành tế bào thực vật là mộtvật liệu phức tạp trong đó cellulose (35-50%), hemicellulose (20-30%) - một nhómcacbonhydrat trong đó dạng xylan là loại chủ yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặtchẽ với nhau

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl,4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạobởi các gốc xylopyranose Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4-glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốccủa axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2, 3]

Hình 1 Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [10]

Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu của thành tế bào của thực vật sống lâunăm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm.

Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methylglucuronic và arabinose Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3-glycozit Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm Tỷ lệ arabinose

so với xylose thường là 0,6 [4]

Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic,axit acetic và axit uronic Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-D-xylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methylglucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit Xấp xỉ 60-70% các đơn vịxylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3

và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết vớigốc xylose theo kiểu α-1,2-glycozit [2, 4, 5]

1.2 PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN

Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzym trong

đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiệnnhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylantạo ra các oligosaccharide Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylanxylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer Cácnhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase

Hình 2 Vị trí tấn công của các enzym vào xylan của cỏ [2]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân oligosaccharide bằng cách loại bỏ thành công xylose từ đầu không khử Có nhiều

β-1,4-D-xylo-công bố về Bacillus sp [6] và một số nấm [7] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào

Enzym α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùngkhông khử α-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan.Một lượng lớn các vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuẩn được

công bố là có khả năng sinh tổng hợp α-arabinosidase Rhodothermus marinus là

loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [8]

Enzym α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidicgiữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl Sự thủy phânliên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan Tương tựnhư liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase

với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinhtổng hợp α-glucuronidase [9].

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kếtcủa các axit acetic và axit phenolic với xylose Esterase phá vỡ liên kết của xylosevới axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose vớiaxit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p-coumaroyl esterase) Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thìthuận lợi cho sự loại bỏ lignin Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sựphân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose Nếu sử dụng cùng vớixylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase

có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [2]

1.3 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE

1.3.1 Khái niệm về xylanase

Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có:

 Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

 Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trongxylan

 Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D-xylanase

endo-1,4- Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase [10]

1.3.2 Phân loại xylanase

Wong và các cộng sự [11] phân loại xylanase thành hai nhóm dựa vào đặctính lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặctính xúc tác khác nhau của chúng Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giátrị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ ‘F’), trong khi đó cácendoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thànhglycanase họ 11 (trước đây là họ G) [12, 13]

Biely và các cộng sự [14] sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khácbiệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của

họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kếtglycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử [15] Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế Theo đócác endo-xylanase của họ 10 có nhiều các hoạt động xúc tác, cái mà tương ứng vớiβ-xylosidase Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tậncùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độaryl-β-D-xylosidase

Sau khi kiểm tra một nghiên cứu phân tích tác nhân rộng rãi, Sapag và cáccộng sự [12] đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tíchtrình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhómchính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzym của nấm Các enzym nhóm I và IIthường là các enzym có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ

Ascomyceta và Basidiomyceta Các enzym nhóm I có giá trị pI bazo trong khi đó

nhóm II có giá trị pI ở phía axit Các enzym của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởicác nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành banhóm là A, B và C Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ

Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương.

Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương,những loài thường sống trong dạ cỏ [12]

1.4 CẤU TRÚC CỦA XYLANASE

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt

các enzym, từ cả vi khuẩn và nấm mốc Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans

có nét đặc trưng của họ 11 [16,17] Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạothành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn vàtương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [12] Sự khác nhau trong hoạtđộng xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhautrong cấu trúc bậc ba của chúng Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu đượcsắp xếp từ các mảnh β [18, 19] Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase

họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β [20] Vị trí liên kết

cơ chất của endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ

11 Điều này cùng với tính linh động hình thể lớn hơn của các enzym lớn hơn so vớicủa những enzym nhỏ hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chấtthấp hơn của endo-xylanse họ 10 [16, 17]

Hình 3 Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus

halodurans [21]

Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp βcái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác Vũng lõm nàyđược so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngóncái của tay phải Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân

tử isoleusin [16, 17]

Hình 4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [22]

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí

xúc tác Meagher và các cộng sự [23] nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei

có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liênkết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác Các vị trí cho các gốcxylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởitryptophan [19, 24]

1.5 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động củaxylanase Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan Sự thủy phân nhìnchung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomericcủa các monomer đường khử của cacbonhydrat Đề xuất này bao gồm một hoặc haitrạng thái chuyển tiếp hóa học Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sựthay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sựduy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric Hầu hết các enzym thủy phânpolysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các

cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1 Có sự liên quan của

cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm [2] Cơ chế dịchchuyển kép bao gồm các đặc điểm:

 Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất

 Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động

 Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym vớicacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kếtnày đối lập với đường của cơ chất

 Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [2].(hình 5)

Hình 5 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans

(1 XNB).

(a) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69 Glu 172

là tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân (b) Glycone liên kết với Glu 78 Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl (c) Nước chiếm chỗ của nucleophile (d) Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho phép sự di chuyển của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất Xylanase của họ 11 biểu lộ một cơ chế endo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt Điều này là bởi vì aglycone được giải phóng ở bước (b) và glycone ở bước (d) [16, 17].

Leggio và các cộng sự [20] đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:

1 Xylanase nhận biết và liên kết với xylan

2 Gốc xylosyl ở vị trí -1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốcxúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộnghóa trị enzym-cơ chất trung gian

3 Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó cơchế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng[20]

1.6 NGUỒN THU XYLANASE

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật; nhiều loại vi khuẩn

và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [11,25] Tuy nhiên, có nhiềunghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả Cleemput và cáccộng sự [26] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu Một số loài động vật thân mềm dưới nướccũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase [27]

1.6.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quátrình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó Một số loài

sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp.

Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong

môi trường tối ưu Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans

tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml Nó hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40%

hoạt độ được duy trì ở pH 9,2 Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng

hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có cảm ứng zeolit và có

hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80 Một chủng khác là Bacillus circulans AB16

tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm gạo

Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml.

Các sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 1 [28]

1.6.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc

Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưuthấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn Giá trị pH tối ưu củaxylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổnđịnh ở pH 5 (bảng 2)

Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưucủa xylanase từ nấm Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụngxylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ítđược dùng hơn so với vi khuẩn Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác,như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại

là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzym hoạt động làmôi trường axit Gomes và các cộng sự đã công bố thu được hoạt độ xylanase là

188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride Tương tự với T viride, T.

reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960

U/ml Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune cũng là một trong

những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml Nằm trongnhóm nấm mùn trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là

Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi

trường nuôi cấy Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày

lên men Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuấtenzym trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thườngthấp hơn thực tế Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng cácsợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trình tiếp xúc với chất dinh dưỡng

và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bịphá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được [28]

Bảng 1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [28]

Bacillus circulans AB 16 19,28

Thermoactinomyces thalophilus sub group C 42

Bảng 2 Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [28]

Vi sinh vật

KLPT (KDa)

Điều kiện tối ưu Độ bền pI Km

(mg/ml)

Vmax (µmol / phút /

-3137 25 5,0-6,0 60-65 5,0-6,0 55 10.26 11.2

-Thermotoga thermarum 266 b 6 80 - - - 0,36 1,18

35 c 7 90- - - - 0,24 19,5

1.7 ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE

1.7.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Việc sử dụng enzym xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự quantâm của các nhà khoa học Sự kết hợp của xylanase với thức ăn của gà con làmgiảm độ nhớt trong ruột, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn Kết quả là cải thiện đáng kểtrọng lượng của chúng [29] Theo Feoli và các cộng sự thì việc bổ xung xylanasevào bột mì gia súc và bột đậu tương với một tỷ lệ nhất định cũng cải thiện đượcnăng suất và hiệu suất tiêu thụ thức ăn của lợn [30] Các nghiên cứu khác cũng chỉ

ra rằng việc bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏling lăng, ngũ cốc ) đã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suấttrong chăn nuôi [31]

1.7.2 Trong sản xuất bánh

Các xylanase cũng được cho rằng có thể cải thiện chất lượng của bánh mì vớiviệc làm tăng thể tích đặc trưng của bánh Điều này càng được nâng cao khi sử

dụng chung với amylase Xylanase có tính axit từ Aspergillus oryzae được sử dụng

để sản xuất thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loạirượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì) Người ta chỉ ra rằng hiệuquả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệuthô và làm giảm lượng bã ép lọc đậu tương Multifect và Enzeko là tên thương mạicủa một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh.Novozyme đưa ra một số các enzym xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym

khác, để cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ Một số cácenzym xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX, FungamylSuper MA and the Pentopan® [31].

1.7.3 Trong sản xuất rượu vang

α-L-arabinofuranosidase và β-D-glucopyranosidase được sử dụng trong quátrình sản xuất thực phẩm cho các chất thơm, rượu vang và nước hoa quả Vi sinhvật bám trên quả nho với mật độ vừa phải sẽ làm tăng các chất hóa học phức tạp vàtăng chất lượng cảm quan của rượu vang Điều này do các vi sinh vật này sinhxylanase, enzym này được cho rằng có khả năng giúp đỡ sự phá hủy thành tế bàocủa nho và vì thế làm tăng lượng monoterpenyldiglycoside, chất mà tạo mùi thơm.Hiện nay, chưa có một enzym thương mại nào có tiềm năng để sử dụng trong sảnxuất rượu vang và nó vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển [31]

1.7.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu

Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thếtừng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường vàphải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng Để thu được bioethanolcần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau

đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặchóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinhchế bioethanol [32] Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giáthành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường Do đó mà các nhànghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzym để thực hiện quá trình này, việcnghiên cứu tạo ra các loại enzym có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzymnhư xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu

1.7.5 Trong chất hoạt động bề mặt

Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạtđộng bề mặt Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơnnhư là glucose và một rượu béo Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì

dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân củapolysaccharide và các bước tiếp theo có thể được bỏ qua Xylanase từ

Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol

and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-D-xylobioside, xyloside and xylobioside tương ứng [31]

2-ethylhexyl-β-D-1.7.6 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy

Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuấtgiấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây Mộttrong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase chobước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit Dựa trên nghiên cứu củamột lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử

lý cho bột giấy kraft với xylanase đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩytrắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo Lợiích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase làlàm nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao,

và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng Hiệu quả của tiền xử

lý bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu vớimột bột giấy kraft gỗ mềm Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứaxylanase 12% Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảmgiá trị kappa của bột giấy đi 3% Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tửpolysaccharide khối lượng phân tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại

bỏ [33]

1.8 TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE

Mặc dù tính chịu nhiệt có thể tốt cho quá trình sản xuất của các enzym bềnnhiệt, nhưng nó thường không có tính thực tế bởi năng suất thấp và quá trình lênmen có nhiệt độ cao cần các trang thiết bị đặc biệt Kỹ thuật gen đã tạo ra được cácsản phẩm mang tính thương mại nhờ việc chuyển gen vào các cơ thể chủ thích hợp

để sản xuất Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ thông prokaryoteđược sử dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở mức cao, cả trongnhững nghiên cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại Thêm vào đó, tốc độ sinh

trưởng nhanh và sự dễ dàng trong việc nuôi cấy của E coli khiến nó rất được quan

tâm và trở thành loài được sử dụng để biến nạp gen chủ yếu dùng để sản xuất các

sản phẩm chuyển gen hiện nay Ngoài E coli nấm men cũng được sử dụng khá

nhiều để biểu hiện gen

Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trongcác vật chủ vi khuẩn và nấm men khác nhau Một số ví dụ, xylanase được tách dòng

vào trong E coli bao gồm A oryzae (Kimura cs., 2002), A pullulans var melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee, 2001), Clostridium thermocellum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum

saccharolyticum (Lüthi cs., 1990) Một số xylanase từ A pullulans var melanigenum (Tanaka cs., 2004), T lanuginosus IOC-4145 (Damaso cs., 2003) và

A niger (Berrin cs., 2000) được biểu hiện trong Pichia pastoris [31].

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Nguồn phân lập

Mẫu dùng để phân lập nấm mốc là mẫu mốc tương của thị trấn Bần, tỉnhHưng Yên, mẫu nước thải nhà máy giấy tại Quảng Ninh và mẫu gỗ mục tại ThanhTrì, Hà Nội

nước thải nhà máy

giấy

14-12-200709-03-2008

Quảng Ninh

23-05-200816-06-2008

men, saccharose, aga, axit 3,5-dinitrosalisilic, CH3COOHNa,… từ TrungQuốc

 Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số, điện di DNA, của hãng sigma,Merk: Tris base, Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), CTAB, NaCl, β-mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulphate (SDS), Natri axetat, etanol 100%,etanol 70%, Clorofoc:isoamyalcohol (24:1), agarose, ethydium bromide(EtBr),

 Hóa chất dùng trong khi thực hiện phản ứng PCR gồm: 4 loạideoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), MgCl2 và Taq polymerase

(Fermentas), primer được tổng hợp từ công ty Sigma

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh và kỹ thuật di truyền vàphòng thí nghiệm công nghệ cao thuộc Viện công nghệ Sinh học-công nghệ thựcphẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm:

 Các loại cân điện tử

 Nồi khử trùng (Nhật bản)

 Tủ cấy vô trùng

 Máy khuấy trộn Vontex (Rotolab, OSI)

 Micropipet các loại (Biohit)

 Máy đo pH (Mettler Toledo)

 Máy ổn nhiệt

 Máy li tâm (Eppendorf, CHLB Đức)

 Máy li tâm lạnh (Avanti TM 30 Centifuge Beckman)

 Hệ thống điện di (Bio-Rad)

 Bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật bản)

 Máy soi chụp ảnh gel

 Máy PCR Biorad, USA.

thanh trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút

Các mẫu phân lập được nghiền bằng cối vô trùng sau đó hòa tan bằng nướccất thanh trùng Pha loãng rồi hút khoảng 100 µl dịch, trang đều trên mặt thạch.Nuôi ở 30oC trong thời gian 48 giờ Sau đó chuyển các chủng nấm mốc có khuẩnlạc riêng rẽ vào các ông nghiệm thạch nghiêng của môi trường Czapek

2.2.2 Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc

Chủng nấm mốc được cấy chấm điểm trên môi trường Czapek trong đósaccharose được thay thế bằng xylan với hàm lượng 2 g/l Nuôi ở 30oC trong 3 ngàysau đó sử dụng lugol và congo đỏ để xác định đường kính thủy phân của enzymxylanase Các chủng nấm mốc được lựa chọn dựa vào tỷ lệ giữa đường kính phânhủy cơ chất và đường kính khuẩn lạc

2.2.3 Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử vớithuốc thử axit dinitro salicylic Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ đường khử Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu,dựa vào đồ thị chuẩn xylose với thuốc thử này suy ra hàm lượng đường khử củadịch nghiên cứu

Từ hàm lượng đường khử ta suy ra được hoạt độ của endo-β-1,4-xylanasevới cơ chất là xylan 0,5% pha trong đệm citrate pH=4,5 Phản ứng enzym được tiếnhành ở 50oC trong 15 phút

“Một đơn vị hoạt độ của enzym xylanase được định nghĩa là lượng enzym có khả năng thủy phân xylan tạo 1 µmol xylose trong thời gian 1 phút ở điều kiện 50 o C”.

Công thức tính hoạt độ enzym xylanase:

) (

(U/ml)Trong đó H: hoạt độ enzym xylanase, U/ml

ODtn: giá trị OD của mẫu thí nghiệm đo ở bước sóng 540nm

ODkc: giá trị OD của mẫu kiểm chứng đo ở bước sóng 540nm

0,0036: hệ số của đường chuẩn

15: thời gian phản ứng, phút

0,1: lượng dịch enzym tham gia phản ứng, ml

f: hệ số pha loãng dịch enzym

2.2.4 Phương pháp định tên nấm mốc

Định tên theo phương pháp xác định hình thái:

Nuôi nấm mốc trên môi trường Czapek, quan sát màu sắc bào tử, đặc điểmkhuẩn lạc bằng mắt thường và quan sát hệ sợi, bào tử dưới kính hiển vi quang học

Định tên theo phương pháp sinh học phân tử:

Khuếch đại đoạn DNA chứa vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 Trong đó ITS1 làđoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoá protein 18S và 5,8S của ribosom, 5,8 S làđoạn gen mã hoá protein 5,8S còn ITS2 là đoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoáprotein 5,8S và 28S của ribosom ITS1 và ITS2 là đoạn rất biến đổi đối với các loàikhác nhau nên có thể dựa vào trình tự của nó mà xác định được loài nấm mốc

2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA

Nguyên tắc:

Tách chiết được DNA cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ liên kết của cácprotein với DNA Và khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzym phân hủyDNA

Các bước tiến hành:

 Nấm mốc nuôi thu sinh khối trên môi trường lỏng 48 giờ

 Cân 0,2-0,3 gam sinh khối nấm mốc Bổ sung 1ml đệm lysis (100mMTris-HCl pH 8, 10mM EDTA, 2% SDS, 1% β-mecaptoethanol, 100µgprotease K)

2.2.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Qui trình (cho gel agarose 1%)

 Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tanhoàn toàn Để nguội 45-50oC rồi đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bịsẵn Sau 20-30 phút, khi gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khaychứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện

di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm

 Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếngtrên gel

 Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nốivới bộ nguồn với chế độ chạy 100V và 90mA

 Nhuộm gel: Bản gel sau khi chạy điện di xong được nhuộm trong dungdịch EtBr 0,5 g/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nước trước khi soi gel

 Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờliên kết với EtBr

2.2.7 Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR

Nguyên tắc:

Taq polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt được dùng để

tổng hợp các đoạn DNA trong môi trường có 4 loại dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,dTTP) và 2 primer trên khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưabiết trình tự

Tiến hành:

Thành phần của phản ứng PCR chuẩn với thể tích phản ứng 100 µl là:

 DNA khuôn (105 – 106 phân tử)

 50 pmol mỗi mồi

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chuẩn:

 Biến tính ở chu kỳ đầu ở 94oC trong 5 phút Các chu kỳ sau biến tínhtrong 1 phút

 Bắt cặp mồi ở nhiệt độ khoảng 50oC – 60oC trong 30 giây

 Kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút

Thực hiện 25 – 40 chu kỳ Chu kỳ cuối thực hiện ở 72oC trong 5 phút Kết thúcphản ứng hạ nhiệt độ xuống 4oC

2.2.8 Phương pháp tinh sạch một đoạn DNA

 Cho vào ống eppendoff 1,5mL 50µL sản phẩm phản ứng PCR:

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nhằm tách dòng được gen mã hoá enzym xylanase có hoạt tính cao, quá trìnhnghiên cứu thực hiện qua các bước theo sơ đồ hình 7

Hình 7 Sơ đồ quy trình thí nghiệm