Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập, tuyển chọn một số xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và phân giải cellulose
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC NGUYỄN NHẬT TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN GIẢI CELLULOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Lạt TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN GIẢI CELLULOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn: Th.S Nguyễn Khoa Trưởng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Nhật Tiên Đà Lạt LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả và số liệu nghiên cứu hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu này. Đà Lạt LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn Th.S Nguyễn Khoa Trưởng – người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học này. Tôi chân thành cám ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt, các thầy cô Khoa Sinh học – trường Đại học Đà Lạt đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho tôi trong suốt 4 năm học vừa qua. Tôi chân thành cám ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hành để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. MỤC LỤC !"#$%%&'()*"+,- ./01+22"3435+6 3 57+6895*:53; .</01+22"3435+6 3 57+6895*:53 =5>?@A2#B*C5 DEFFGDHI/HJK% DANH MỤC BẢNG DEFFGDHI/HJK% DANH MỤC BIỂU ĐỒ DEFFGDHI/HJK% DANH MỤC HÌNH DEFFGDHI/HJK% MỞ ĐẦU Hiện nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực chế biến nông sản nhằm phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu, một lượng lớn phế phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, vỏ cà phê, rơm rạ, xơ dừa,… đã được tạo ra. Thành phần chính của các loại phế phụ phẩm này là cellulose. Đây là một chất hữu cơ rất khó phân hủy. Hầu hết các nguồn phế phụ phẩm này được thải bỏ trực tiếp vào môi trường ở dạng thô tự nhiên hoặc đốt, gây ô nhiễm môi trường trầm trọng. Quá trình phân hủy cellulose gồm một chuỗi các phản ứng phức tạp, xảy ra dưới tác động của enzyme cellulase. Tuy nhiên, chỉ có enzyme cellulase ở các loài vi sinh vật mới có khả năng phân hủy hoàn toàn cellulose. Mặt khác, Việt Nam là một nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các loài vi sinh vật gây bệnh cây trồng. Vì vậy, việc sử dụng các loại hóa chất bảo vệ thực vật từ lâu đã rất phổ biến ở nước ta. Song việc này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường cũng như sức khỏe con người. Do đó, việc sử dụng các tác nhân sinh học để ức chế các quần thể vi sinh vật gây hại đã và đang được chú trọng nghiên cứu. Trong đó, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase ngoại bào và khả năng kháng khuẩn cao. Đặc biệt, khi kết hợp với một số chủng vi khuẩn, nấm mốc sẽ cho hiệu suất phân giải cellulose và các dẫn xuất của cellulose như carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose khá cao. Hiện nay, trong số 8000 chất kháng sinh hiện được biết đến trên thế giới thì có đến trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [1]. Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Một số chất kháng sinh như streptomycin, neomycin, tetracylin, cloramphenicol, erythromycin… có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chúng còn có khả năng kháng nhiều loài vi khuẩn kháng penicillin. Chính vì vậy, các chất kháng sinh này được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong nhiều lĩnh vực như y học, chăn nuôi, thú y, thủy sản… Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và phân giải cellulose” nhằm tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh để xử lý phế phụ phẩm và phòng chống một số bệnh do vi sinh vật gây hại trong nông nghiệp. Nội dung nghiên cứu: 1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn tại Đà Lạt. 2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn. 3. Khảo sát khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn. 4. Khảo sát điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn. 1 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng tồn tại trong đất, nước, trong các cơ chất hữu cơ (phân chuồng, bùn, rác…), thậm chí trong cả những cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật trong đất [4]. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Ngoài ra, sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu (pH từ 6,8 - 7,5). Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. 1.1.2. Đặc điểm của xạ khuẩn 1.1.2.1. Đặc điểm chung Trước thế kỷ XIX, xạ khuẩn được xếp vào nhóm nấm. Về sau với những nghiên cứu sâu hơn về mặt tế bào học, người ta nhận thấy xạ khuẩn có nhiều nét khác biệt so với nấm mốc nhưng lại giống vi khuẩn: - Kích thước xạ khuẩn nhỏ bé tương tự kích thước của vi khuẩn. Đường kính sợi khoảng 1- 2μm (nhỏ hơn nhiều so với đường kính sợi nấm 7 - 9μm). - Nhân của xạ khuẩn giống với nhân của vi khuẩn, nhân chưa phân hóa. - Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitine mà chứa hợp chất điển hình của vi khuẩn là glucopeptide. - Xạ khuẩn sinh sản phân bào theo kiểu amitose (phân bào không tơ). Đây là một tính chất đặc trưng của vi khuẩn. - Xạ khuẩn không có giới tính, nghĩa là không phân thành tế bào đực và tế bào cái, có thể hình thành hợp tử từng phần nhờ tiếp hợp, tải nạp và biến nạp. - Xạ khuẩn cũng bị phage tấn công (Actinophage). Xạ khuẩn là một trong những loại vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong tự nhiên. Ngoài ra, xạ khuẩn có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme (cellulase, protease, amylase, chitinase, invertase…), một số vitamine và acid hữu cơ. Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích vẫn tồn tại một số xạ khuẩn sinh ra những chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật, hoặc có thể gây bệnh cho người và động vật [3]. 1.1.2.2. Khuẩn lạc 2 Cũng giống như vi khuẩn, nấm mốc và nấm men, khi nuôi cấy trên môi trường đặc xạ khuẩn cũng tạo thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, … Đường kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 - 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn [5]. Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài cùng có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp hơn, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh hóa khác nhau. Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như các chất kháng sinh, độc tố, các loại enzyme, các acid amine, các acid hữu cơ cũng được tích lũy một cách khác nhau ở mỗi lớp. Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, hồng, xám, trắng, tím tùy thuộc từng loài và điều kiện nuôi cấy [3]. 1.1.2.3. Khuẩn ty Khi nuôi cấy trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất (cắm sâu vào bề mặt thạch) có chức năng hút nước, chất dinh dưỡng và khuẩn ty khí sinh (phát triển trên bề mặt thạch) đảm nhận chức năng sinh sản. Một đặc điểm dễ nhận biết của xạ khuẩn đó là xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển giống như hệ khuẩn ty của nấm mốc, phân nhánh và không có vách ngăn. Tuy nhiên, khuẩn ty của xạ khuẩn mảnh hơn nhiều so với khuẩn ty của nấm mốc. Các loại xạ khuẩn đều có cùng một kiểu cấu tạo khuẩn ty, nhưng kích thước dài hay ngắn, thẳng hay lượn sóng, phân nhánh nhiều hay ít là tùy thuộc vào từng loài xạ khuẩn. Khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm. Nguyên nhân của hiện tượng này là do bản thân xạ khuẩn sản sinh ra các chất ức chế khuếch tán ra môi trường xung quanh và tạo thành các vùng bất lợi đối với sự sinh trưởng của xạ khuẩn. Tại những vùng này, khuẩn ty phát triển yếu ớt, chúng chỉ tạo thành những sợi mảnh, riêng lẻ. Các sợi này sau đó lan sang vùng môi trường không có chất ức chế và tiếp tục phát triển mạnh mẽ. Sau đó chúng lại tiếp tục sản sinh ra các chất ức chế. Khác với vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân nhánh. Đầu tiên, trên bề mặt sợi xuất hiện những mấu lồi, sau đó chúng lớn lên thành chồi và từ đây sẽ kéo dài ra thành nhánh mới [3, 21]. 1.1.3. Bào tử và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh (cuống sinh bào tử). Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất để phân loại xạ khuẩn. Cuống bào tử có thể khác nhau ở số vòng xoắn, đường kính của các vòng xoắn, mức độ xoắn và chiều xoắn. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmentation) hoặc do sự cắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử [8]. Bào tử hình thành có thể dạng hình cầu, hình ovan, hình viên trụ, hình que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông. 3 [...]... chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene Ngoài các gene chịu trách nhiệm sinh tổng hợp chất kháng sinh còn có các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor 1.4.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Đa số các chất kháng. .. Phương pháp phân loại Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất tại Đà Lạt Sử dụng khóa phân loại xạ khuẩn của Waksman (1961) 2.3.7.1 Phân loại dựa vào đặc điểm khuẩn lạc xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Gause 1 Mô tả các đặc điểm: tốc độ phát triển (đo đường kính khuẩn lạc), màu sắc mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc, sự biến đổi màu sắc khuẩn lạc trong... penicillin và những chất kháng khuẩn khác được cải tiến và đổi mới trong phòng thí nghiệm Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổng hợp hay bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus, tế bào ung thư… Tất cả các chất kháng sinh đều có tính độc chọn lọc, mỗi chất kháng. .. Có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn Gram (+) Đặc biệt có khả năng kháng các tụ cầu khuẩn đã kháng penicillin và một số chất kháng sinh khác [1, 20] Amphoterycin B: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces nodosus Được dùng để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [20] Dactinomycin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces antibiticus Có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các... với một nhóm vi sinh vật nhất định [7] 1.4.2 Cơ chế tác động của chất kháng sinh lên vi khuẩn Vi khuẩn là một tế bào hoàn chỉnh, có khả năng sống riêng biệt và phát triển không phụ thuộc vào tế bào chủ Mỗi thành phần trong cấu trúc tế bào vi khuẩn có cấu tạo thích hợp, trở thành “đích tác động” cho kháng sinh nhắm đến, gắn vào và cho tác dụng Dựa vào đặc tính này người ta nghiên cứu từng loại kháng. .. Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng xạ khuẩn phân lập Nuôi cấy 6 chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause 1 Sau đó, tiến hành quan sát, mô tả đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào xạ khuẩn 3.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng A1 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng A1 Hình thái tế bào Đặc điểm khuẩn lạc Hệ sợi - Khuẩn lạc có dạng hình tròn Màu trắng... Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p - aminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic 1.4.3 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Có nhiều quan... thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (plasmid) Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn Xạ khuẩn thuộc... chất kháng sinh này còn được sử dụng trong chăn nuôi, thú y và thủy sản [1] Erythromycin: là chất kháng sinh có phổ rộng đối với vi khuẩn Gram (+), có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus Được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [1] Novobicin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niverus Có hoạt tính kháng khuẩn. .. điều trị một số bệnh ung thư [20] Daunorubixin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces coeruleorubidus Được dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [20] 1.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.4.5.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát . Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và phân giải cellulose nhằm tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh để xử lý phế phụ phẩm và phòng chống một số. cứu: 1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn tại Đà Lạt. 2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn. 3. Khảo sát khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn. 4. Khảo. TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC NGUYỄN NHẬT TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN GIẢI CELLULOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33 NGÀNH: CÔNG