Phân lập và tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axit Lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực th

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, với xu hướng đa dạng và sản xuất hàng hoá ngành chăn nuôi trong phạm vi của cả nước nói chung đã có những bước phát triển khá mạnh Cho đến nay, các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56] Tuy nhiên, cùng với sự phát triển chăn nuôi thì dịch bệnh ở vật nuôi cũng phát sinh và phát triển, đặc biệt là bệnh đường ruột làm tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và là nguồn nhiễm tiềm tàng cho các sản phẩm, gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng

Với phát hiện khoa học về hoạt chất có khả năng kháng khuẩn của Alex Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đã mở ra một kỷ nguyên mới trong điều trị các bệnh truyền nhiễm và nhanh chóng đã được áp dụng ở thế giới Ngoài ra, kháng sinh còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ những năm 1950 của thế kỷ 20 [56] Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cho vật nuôi đã nảy sinh ra tính kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh và tồn dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Chính vì vậy, nên nhu cầu tìm ra các giải pháp nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi là vấn đề ngày càng trở nên cấp bách [37]

Trong tự nhiên quá trình cạnh tranh sinh học xảy ra thường xuyên giữa các loài sinh vật với nhau dẫn tới các sinh vật yếu hơn bị giảm số lượng hoặc là sẽ bị tiêu diệt trong khu vực cư trú [20], [45] Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi [29]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn3

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo

probiotics Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường

tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và sản phẩm lên men, Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axít lactic rất cao là tiềm năng để sản xuất probiotics [42]

Các sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta hiện nay còn hạn chế, do vậy ngành chăn nuôi đang sử dụng phần lớn các sản phẩm probiotic nhập khẩu Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa được khẳng định rõ ràng Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa Mặt khác, các nghiên cứu chế tạo probiotics dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập,

tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các

sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn

được một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao, chống chịu tốt trong các điều kiện in vitro làm cơ sở cho việc chế tạo probiotic dùng trong chăn nuôi

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập các chủng Lactobacillus

- Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng Lactobacillus phân lập được

- Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập được trong điều kiện in vitro

- Phân loại một số chủng Lactobacillus phân lập được

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở cho việc lựa chọn một số chủng vi khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ

Eubacteriales Nhóm này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý

chúng tương đối đồng nhất Tất cả đều có đặc điểm chung là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển hóa hydrat cacbon và sinh ra axít lactic Khác với một số vi khuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra axít lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa các cytocrom và enzyme catalaza, sinh trưởng tùy tiện Hình dạng tế bào của vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài khác nhau Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này phụ thuộc vào môi trường, thời gian và sự có mặt của oxy cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [12]

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Cacbon là thành tố chính trong hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như glucose, fructose, manose, galactose; các loại đường đôi như saccarose, lactose, maltose cho đến các polysaccarit như tinh bột, dextrin

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu

trúc tế bào và sinh ra các axít hữu cơ như axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic

Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm có thể sử dụng các axít gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axít axetic và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn5

axít lactic như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae

Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axít amin như axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2 Các loại vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau

và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các

quá trình xử lý sau này Khả năng sống sót của L bulgaricus trong và sau sấy

đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỉ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần

quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12]

1.1.2.2 Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ

Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống tất cả các sinh vật Những vật chất cơ bản của tế bào như protein, axít nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiểu axít amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình Axít amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic

có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ có từ nguồn nitơ vô cơ như L helveticus

chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axít amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn

nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu quả sản

xuất Trong đó nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều [12]

1.1.2.3 Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự

sinh trưởng Axít nicotinic và axít pantotenic rất cần cho sự sinh trưởng của tất cả các loài vi khuẩn lactic Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt

độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [12], [32]

1.1.2.4 Các chất hữu cơ khác cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

Axít axetic và axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Axetat có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Axetat được dung làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Một loại axít hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axít oleic, một dẫn xuất của axít oleic được sự dụng là Tween 80 trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic Một vài loài vi

khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần axít

béo không no cho sự phát triển [12], [50]

1.1.2.5 Nhu cầu về các muối khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magiê Đặc biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần thiết cho

quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với Lactobacillus thì mangan, magiê

và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [12], [45]

1.1.3 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s [21] Lactobacillus được phân

loại như sau:

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn7

Bộ: Eubacteriales

Họ: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus

Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic gồm một số

giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram

dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axít lactic

Giống Lactobacillus rất đa dạng Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá

bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình que và khả năng tạo ra axít lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu Bên cạnh

đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm khi di động Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que,

với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, đôi khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành

dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi

trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu Những

tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy saccharose Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose [25]

Về nhu cầu ôxy, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có ôxy Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO2 [22]

Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt

Chúng phát triển tốt trong môi trường nhiều phức chất Nhiệt độ phát triển tối ưu

của chúng là 30-400C, nhưng cũng có thể sinh trưởng trong phạm vi từ 5-530C Chúng có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axít, pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5-5,8 nhưng nhìn chung có thể sinh trưởng ở pH 5 [12]

1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic

1.1.4.1 Ảnh hưởng của oxy

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, không có hệ enzyme hô hấp xitocrom cũng như hệ catalaza Tuy vậy, chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều

hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit)

Các nghiên cứu cho thấy, một số chất trong môi trường chỉ có thể được sử

dụng khi có mặt oxy Chẳng hạn Pediococcus sp và L plantarum có thể đồng hóa được glyxerin trong điều kiện hiếu khí Một số loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase L brevis và L buchneri

phát triển tốt ở 30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC chủng chỉ phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện Hiện tượng tương tự cũng gặp

ở một số chủng thuộc loài S pyogenes Các nghiên cứu cho thấy, hệ enzyme

peroxylase có trong vi khẩn lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm tlợn việc tạo thành H2O2 Đồng thời

một số vi khuẩn lactic (S brevis, L mesenteroides) có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia cùng một số chất oxy hóa Như vậy, vi khuẩn lactic

có hệ peroxydase sử dụng NADH2 làm chất nhận điện tử và phân giải H2O2 Phương trình phản ứng như sau:

NADH2 + H+ + H2O2 → NAD+ + 2H2O Trong điều kiện hiếu khí, năng lượng sinh ra cũng lớn hơn rất nhiều so với trong điều kiện yếm khí (hơn 20 lần khi cùng phân hủy 1 mol glucose) Quan hệ với oxy giữa các loài vi khuẩn khác nhau có sự khác nhau Trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt, các trực khuẩn lên men dị hình chậm sinh trưởng Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên men arabinoase đạt tối ưu trong điều kiện kị khí, còn các loài khác không sử dụng được pentose lại sinh trưởng rất kém trong điều kiện này Trong quá trình lên men lactic, lượng oxy vượt quá giới hạn sẽ làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, do vậy quá trình tạo thành axít lactic không xảy

ra Trong quá trình lên men bảo quản các loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá, thịt,…), các vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường được sử dụng,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn9

nhất là trong bảo quản bằng bao gói chân không Hình thức bảo quản này, một mặt tránh sự oxy hóa các sản phẩm, mặt khác tránh sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm Trường hợp này vi khuẩn lactic sẽ ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ các sản phẩm trao đổi chất của nó [12], [18]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khẩn lactic [12]

Nhóm vi

khuẩn lactic

Nhiệt độ sinh trưởng ( 0 C)

Giống Bình thường Tối ưu

Ưa lạnh 0 - 27 10 - 15 Enterococcus, Pediococcus,

Bifidobacterium

Ưa ấm 5 - 45 20 - 40 Leuconostoc, Vogococcus,

Lactococcus

Ưa nhiệt 20 - 60 40 - 45 Str Streptococcus

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn khá rộng, một số loài có thể sinh trưởng

ở 55oC trong khi một số khác có thể sinh trưởng được ở 50C Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ từ 15 – 400C (Bảng 1.1)

1.1.4.3 Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng, chịu tác động mạnh của sự thay đổi pH môi trường Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt tính sinh học cao nhất

Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp của các chi vi khuẩn lactic [12]

Chi pH tối thích pH sau lên men

- 6,5 Giá trị pH thấp nhất mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác

nhau Chẳng hạn Lactobacillus chịu được pH = 3,2 - 3,5, Pediococcus chịu được

pH = 3,2 - 3,5 trong khi đó, Leuconostoc chịu được pH = 5,0 (Bảng 1.2) Trong quá

trình lên men lactic, axít lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các hoạt động của

vi sinh vật khác Sau đó, khi lượng axít tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, sự axít hóa tế bào chất gây ra do sự tích lũy nội bào axít lactic [12]

1.1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất của vi khuẩn Với nồng độ NaCl lớn hơn hoặc bằng 5%, sự sinh trưởng của phần lớn các chủng vi khuẩn lactic

bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi khuẩn lactic tăng, đồng thời ức chế hoạt tính enzyme của tế bào Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với NaCl hơn vi khuẩn Gram dương, nguyên nhân là do các enzyme của vi khẩn bị ức chế bởi ion Cl- Một số chủng P

pentosaceus sinh trưởng ở nồng độ NaCl 9-10% [12], [45]

1.1.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axít lactic Nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng axít sinh ra càng nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng tế bào vi khuẩn lactic do

đó giảm axít lactic tạo ra [12], [18]

1.1.5 Lên men lactic ở Lactobacillus

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axít lactic nhờ vi sinh

vật, điển hình là vi khuẩn lactic Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại

đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp

và tinh bột Sự phát triển của chúng cần có sự có mặt của peptone, axít amin hay

muối amôn Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu

vitamin, axít amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axít pH từ 5,5÷6, khi pH 5,5 quá trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read