Phân lập và tuyển chọn một số chủng lactobacillus có khả năng sinh axit lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - NGUYỄN MẠNH TUẤN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH AXÍT LACTIC CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thái Nguyên - 2012 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, với xu hướng đa dạng sản xuất hàng hố ngành chăn ni phạm vi nước nói chung có bước phát triển mạnh Cho đến nay, sản phẩm ngành chăn nuôi đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng nước mà xuất thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56] Tuy nhiên, với phát triển chăn ni dịch bệnh vật nuôi phát sinh phát triển, đặc biệt bệnh đường ruột làm tăng tỷ lệ chết, giảm suất nguồn nhiễm tiềm tàng cho sản phẩm, gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng Với phát khoa học hoạt chất có khả kháng khuẩn Alex Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi mở kỷ nguyên điều trị bệnh truyền nhiễm nhanh chóng áp dụng giới Ngồi ra, kháng sinh cịn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ năm 1950 kỷ 20 [56] Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cho vật nuôi nảy sinh tính kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh tồn dư lượng thuốc kháng sinh thực phẩm, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Chính vậy, nên nhu cầu tìm giải pháp nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi vấn đề ngày trở nên cấp bách [37] Trong tự nhiên trình cạnh tranh sinh học xảy thường xuyên loài sinh vật với dẫn tới sinh vật yếu bị giảm số lượng bị tiêu diệt khu vực cư trú [20], [45] Probiotic chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn sống, có tác động làm cân hệ vi sinh vật đường ruột, từ ảnh hưởng tốt cho động vật Cách thức hoạt động probiotic cạnh tranh, qua tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ công vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, chúng sinh hoạt chất kháng khuẩn men kích thích hệ thống miễn dịch vật nuôi [29] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lactobacillus nhóm vi khuẩn sử dụng rộng rãi chế tạo probiotics Các chủng Lactobacillus tìm thấy phân lập nhiều đường tiêu hóa động vật, phế phụ cơng nghiệp sản xuất bia, rượu, đường sản phẩm lên men, Các sản phẩm có chứa hàm lượng axít lactic cao tiềm để sản xuất probiotics [42] Các sản phẩm probiotic dùng chăn nuôi nước ta hạn chế, ngành chăn nuôi sử dụng phần lớn sản phẩm probiotic nhập Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa khẳng định rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ địa Mặt khác, nghiên cứu chế tạo probiotics dùng chăn nuôi nước ta hạn chế Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài “Phân lập, tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao từ sản phẩm lên men khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao, chống chịu tốt điều kiện in vitro làm sở cho việc chế tạo probiotic dùng chăn nuôi Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng Lactobacillus - Định lượng axít lactic sinh chủng Lactobacillus phân lập - Đánh giá số đặc tính probiotic chủng Lactobacillus phân lập điều kiện in vitro - Phân loại số chủng Lactobacillus phân lập Ý nghĩa khoa học đề tài: Kết nghiên cứu đề tài sở cho việc lựa chọn số chủng vi khuẩn lactic phân lập có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc Eubacteriales Nhóm khơng đồng mặt hình thái, song mặt sinh lý chúng tương đối đồng Tất có đặc điểm chung vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Chúng thu nhận lượng nhờ chuyển hóa hydrat cacbon sinh axít lactic Khác với số vi khuẩn khác vi khuẩn đường ruột sinh axít lactic, tất vi khuẩn lactic vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa cytocrom enzyme catalaza, sinh trưởng tùy tiện Hình dạng tế bào vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que Kích thước chúng thay đổi tùy lồi khác Tất khác hình thái tế bào phụ thuộc vào môi trường, thời gian có mặt oxy điều kiện nuôi cấy khác [12] 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon thành tố hợp chất hữu xây dựng lên thể lồi sinh vật Vì chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu q trình dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydratcacbon, từ hexose glucose, fructose, manose, galactose; loại đường đôi saccarose, lactose, maltose polysaccarit tinh bột, dextrin Nguồn lượng quan trọng cho vi khuẩn lactic monosaccarit disaccarit Các nguồn cacbon dùng để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào sinh axít hữu axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ sản phẩm thực phẩm sử dụng axít gluconic galacturonic tạo thành CO 2, axít axetic Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn axít lactic Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae Trong trình lên men chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic sử dụng axít amin axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp lượng Khi tạo q trình decacboxyl tạo CO Các loại vi khuẩn khác đòi hỏi nguồn cacbon khác Sự phát triển vi khuẩn lactic với loại đường khác tạo tế bào có đặc điểm hình thái sinh lý khác có khả chống chịu khác trước áp lực trình xử lý sau Khả sống sót L bulgaricus sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường bổ sung q trình ni cấy thu hồi chế phẩm, lên men từ manose tỉ lệ tế bào chết nhiều hẳn so với lên men từ fructose lactose Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12] 1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Nitơ nguyên tố cần thiết cho sống tất sinh vật Những vật chất tế bào protein, axít nucleic… chứa nitơ, nitơ đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Vi khuẩn lactic địi hỏi nhiểu axít amin khác chúng cần mơi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo phát triển Axít amin đồng hóa dạng peptit nhờ vào tác dụng enzyme protease ngoại bào hay nội bào Mỗi loài vi khuẩn khác lại có nhu cầu nguồn nitơ khác Phần lớn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp chất hữu phức tạp có chứa nitơ nên chúng địi hỏi nguồn nitơ có sẵn mơi trường Chỉ có số lồi vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp hợp chất hữu có từ nguồn nitơ vơ L helveticus chúng bị kích thích có mặt muối amoni mơi trường Để sinh trưởng phát triển bình thường, ngồi nitơ dạng hỗn hợp axít amin, vi khuẩn lactic cịn cần hợp chất hữu chứa nitơ sản phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây nguồn nitơ thường xuyên sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu nguồn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu sản xuất Trong nấm men thủy phân sử dụng nhiều [12] 1.1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng vitamin Các vi khuẩn lactic, đặc biệt giống Lactobacillus, cần vitamin cho sinh trưởng Axít nicotinic axít pantotenic cần cho sinh trưởng tất loài vi khuẩn lactic Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng nhiều yếu tố nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu oxy hóa khử môi trường [12], [32] 1.1.2.4 Các chất hữu khác cần thiết cho sinh trưởng vi khuẩn lactic Axít axetic axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập bảo quản chủng vi khuẩn lactic Axetat có tác động quan trọng đến sinh trưởng tế bào Axetat dung làm chất đệm cho môi trường ni cấy nhiều lồi vi khuẩn lactic Một loại axít hữu quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng hầu hết loài vi khuẩn lactic axít oleic, dẫn xuất axít oleic dụng Tween 80 thành phần môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn lactic Một vài loài vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus) cần axít béo khơng no cho phát triển [12], [50] 1.1.2.5 Nhu cầu muối khoáng Để đảm bảo cho sinh trưởng vi khuẩn lactic cần hợp chất vô đa lượng vi lượng đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan magiê Đặc biệt mangan có tác dụng ngăn cản trình tự phân hủy tế bào cần thiết cho trình sống bình thường vi khuẩn Đối với Lactobacillus mangan, magiê sắt có tác động tích cực lên sinh trưởng vi khuẩn lactic [12], [45] 1.1.3 Đặc điểm phân loại vi khuẩn lactic Theo khóa phân loại vi khuẩn Bergey’s [21] Lactobacillus phân loại sau: Ngành: Lớp: Firmicutes Bacilli Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bộ: Họ: Giống: Eubacteriales Lactobacillaceae Lactobacillus Lactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic gồm số giống ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính vi khuẩn Gram dương lên men carbohydrate thành lượng axít lactic Giống Lactobacillus đa dạng Sự đa dạng chúng đánh giá hàm lượng G+C ADN loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn giống khác dạng hình que khả tạo axít lactic sản phẩm cuối chủ yếu Bên cạnh đó, Lactobacillus cịn vi khuẩn Gram dương, khơng hình thành bào tử di động Người ta thấy tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, đơi trơng chúng gần giống hình cầu (coccoid) điều kiện thường hình thành dạng chuỗi tồn đơn độc Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus mơi trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục không nhuộm màu Những tế bào địi hỏi mơi trường ni cấy phức tạp, có khả lên men phân hủy saccharose Ít nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon lactose [25] Về nhu cầu ôxy, chúng vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, phát triển tốt điều kiện khơng có ơxy Nhìn chung, lồi giống phát triển tốt điều kiện có 5% CO2 [22] Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt Chúng phát triển tốt môi trường nhiều phức chất Nhiệt độ phát triển tối ưu chúng 30-400C, sinh trưởng phạm vi từ 5-530C Chúng có khả chịu đựng mơi trường có tính axít, pH tối ưu cho phát triển 5,5-5,8 nhìn chung sinh trưởng pH [12] 1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình trao đổi chất vi khuẩn lactic 1.1.4.1 Ảnh hưởng oxy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn hơ hấp tùy tiện, khơng có hệ enzyme hô hấp xitocrom hệ catalaza Tuy vậy, chúng có khả oxy hóa nhiều hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit) Các nghiên cứu cho thấy, số chất mơi trường sử dụng có mặt oxy Chẳng hạn Pediococcus sp L plantarum đồng hóa glyxerin điều kiện hiếu khí Một số lồi Leuconostoc cần có mặt oxy giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase L brevis L buchneri phát triển tốt 30 oC điều kiện yếm khí, 37 oC chủng phát triển điều kiện hiếu khí kị khí tùy tiện Hiện tượng tương tự gặp số chủng thuộc loài S pyogenes Các nghiên cứu cho thấy, hệ enzyme peroxylase có vi khẩn lactic thực chức thay cho hệ enzyme dehydrogenase, oxy sử dụng chất nhận hydro Quá trình oxy hóa vi khuẩn lactic thường kèm tlợn việc tạo thành H 2O2 Đồng thời số vi khuẩn lactic (S brevis, L mesenteroides) khử H 2O2 thành nước với tham gia số chất oxy hóa Như vậy, vi khuẩn lactic có hệ peroxydase sử dụng NADH làm chất nhận điện tử phân giải H 2O2 Phương trình phản ứng sau: NADH2 + H+ + H2O2 → NAD+ + 2H2O Trong điều kiện hiếu khí, lượng sinh lớn nhiều so với điều kiện yếm khí (hơn 20 lần phân hủy mol glucose) Quan hệ với oxy loài vi khuẩn khác có khác Trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt, trực khuẩn lên men dị hình chậm sinh trưởng Các vi khuẩn lactic lên men dị hình lên men arabinoase đạt tối ưu điều kiện kị khí, cịn lồi khác khơng sử dụng pentose lại sinh trưởng điều kiện Trong trình lên men lactic, lượng oxy vượt giới hạn làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, q trình tạo thành axít lactic khơng xảy Trong trình lên men bảo quản loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá, thịt,…), vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường sử dụng, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn bảo quản bao gói chân khơng Hình thức bảo quản này, mặt tránh oxy hóa sản phẩm, mặt khác tránh sinh trưởng vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm Trường hợp vi khuẩn lactic ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ sản phẩm trao đổi chất [12], [18] 1.1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho giống vi khẩn lactic [12] Nhóm vi khuẩn lactic Nhiệt độ sinh trƣởng (0C) Bình thƣờng Tối ƣu Giống Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium Leuconostoc, Vogococcus, Ưa ấm - 45 20 - 40 Lactococcus Ưa nhiệt 20 - 60 40 - 45 Str Streptococcus Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic Ưa lạnh - 27 10 - 15 Khoảng nhiệt độ sinh trưởng vi khuẩn rộng, số lồi sinh trưởng 55oC số khác sinh trưởng 50C Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic sinh trưởng khoảng nhiệt độ từ 15 – 400C (Bảng 1.1) 1.1.4.3 Ảnh hưởng pH Hoạt động vi khuẩn lactic, đặc biệt hệ enzyme chúng, chịu tác động mạnh thay đổi pH mơi trường Mỗi enzyme có vùng pH tối ưu mà hoạt tính sinh học cao Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp chi vi khuẩn lactic [12] pH tối thích pH sau lên men Lactobacillus 5,6 - 6,2 3,2 - 3,5 Lactococcus 5,6 - 6,5 4,0 - 4,5 Leuconostoc 5,6 - 6,5 5,0 Enterococcus 7,0 4,0 - 4,6 Pediococcus 5,6 - 6,5 3,2 - 3,5 Chi Tuy nhiên, pH nội bào vi khuẩn lactic lại không tương ứng với pH tối ưu enzyme nội bào Giá trị pH tối ưu cho sinh trưởng Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc 5,6 - 6,2; 5,6 - 6,5 5,6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 6,5 Giá trị pH thấp mà giống vi khuẩn lactic chịu khác Chẳng hạn Lactobacillus chịu pH = 3,2 - 3,5, Pediococcus chịu pH = 3,2 - 3,5 đó, Leuconostoc chịu pH = 5,0 (Bảng 1.2) Trong trình lên men lactic, axít lactic sinh có tác dụng ức chế hoạt động vi sinh vật khác Sau đó, lượng axít tích lũy đủ lớn vi khuẩn lactic bị ức chế, axít hóa tế bào chất gây tích lũy nội bào axít lactic [12] 1.1.4.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất vi khuẩn Với nồng độ NaCl lớn 5%, sinh trưởng phần lớn chủng vi khuẩn lactic bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch áp suất thẩm thấu nội bào ngoại bào vi khuẩn lactic tăng, đồng thời ức chế hoạt tính enzyme tế bào Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với NaCl vi khuẩn Gram dương, nguyên nhân enzyme vi khẩn bị ức chế ion Cl- Một số chủng P pentosaceus sinh trưởng nồng độ NaCl 9-10% [12], [45] 1.1.4.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose Đường nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axít lactic Nồng độ đường mơi trường cao lượng axít sinh nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào vi khuẩn lactic giảm axít lactic tạo [12], [18] 1.1.5 Lên men lactic Lactobacillus Lên men lactic q trình chuyển hóa đường thành axít lactic nhờ vi sinh vật, điển hình vi khuẩn lactic Lactobacillus có khả lên men nhiều loại đường đơn đường đơi khơng có khả lên men loại glucid phức tạp tinh bột Sự phát triển chúng cần có có mặt peptone, axít amin hay muối amơn Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt chất dinh dưỡng giàu vitamin, axít amin khống chất Q trình lên men xảy tốt mơi trường axít pH từ 5,5÷6, pH 5,5 q trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nghiên cứu động học lên men chủng Lactobacillus plantarum TL4, Lactobacillus pentosus NS1, Lactobacillus fermentum BC tạo chế phẩm sinh học sử dụng cho vật nuôi TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Hoài Anh (2008), “Probiotic – lợi ích triển vọng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn nuôi 1, tr 37-39 Hồ Lê Quỳnh Châu, Hồ Trung Thông, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh (2010), “Đánh giá khả bám dính kháng khuẩn mức độ in vitro số chủng vi sinh vật có tiềm sử dụng làm probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57, tr 5-13 Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, Huỳnh Xuân Phong (2011), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học 19a, tr 176-184 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Tập 1, Nhà xuất KHKT Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Sư phạm, Hà Nội Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), “Thu nhận bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định chất mang cellulose vi khuẩn (BC) ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Tạp chí Phát triển Khoa học & Cơng nghệ, tập 11, số 9, tr.100-109 Phạm Thị Ngọc Lan (2007), Ảnh hưởng chủng có tính chất probiotic lên khu hệ vi khuẩn đường ruột tăng trọng gà điều kiện bình thường chịu stress nhiệt, Luận án tiến sỹ khoa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Mai Thị Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phân lập địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ (24), tr 221-226 Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nơng nghiệp cho gia súc nhai lại”, Tạp chí di truyền ứng dụng- Chuyên san Công nghệ sinh học (6), tr 1-6 10 TCN – TQTP 0013:2006, “Thường quy kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn Lactic thực phẩm”, Tiêu chuẩn Ngành y tế 11 TCVN 5860–1994 Phương pháp xác định độ axít chung 12 Nguyễn Thế Trang (2011), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm bảo quản cá, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Việt Nam 13 Hồng Tồn Thắng, Cao Văn (2006), “Giáo trình sinh lý học vật nuôi”, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 14 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ vi sinh môi trường”, Công nghệ sinh học tập 5, NXB Giáo dục, 2006 15 Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả sống mơi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vật nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 55, tr 81-94 16 Lê Hoàng Bảo Vi, Trương Thị Quỳnh Như, Vương Nam Trung, Phạm Huỳnh Ninh, Trần Thu Hoa, Phan Văn Sỹ (2006), “Sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic) sử dụng thức ăn chăn ni” Tạp chí Chăn ni số 12, tr 21-25 17 Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp Vũ Thành Lâm (2009), “Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn ni”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16, tr 1-12 II Tiếng Anh 18 Arti Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar Gokhale (2008), “Utilization of molasses sugar for lactic acid production by 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Mutant Uc-3 in batch fermentation”, Applied and environmental microbiology vol 74 (1), pp 333–335 19 Arturo A , Mario Rosa M., Maria A.M (2006), “Probiotic for animal nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments, 45, pp 91-95 20 Begon M., Harper J L., Townsend C R (1996), “Ecology: Individuals, populations and communities”, Blackwell Science 21 Bergey's manual of systematic bacteriology (1984), Williams & Wilkins, Vol 2, pp 158-168 22 Bielecki S., Krystynowics A , Turkiewicz M., Kalinowska H., “Bacteria cellulose”, Technical University of Lodz, Stefanowskiego Poland, pp 37-46 23 Boylston T.D., Vinderola C.G., Ghoddusi H.B and Reinheimer J.A (2004), “Incorporation of Bifidobacteria into cheese: challenges and rewards”, International Dairy Journal 14, pp 375-387 24 Coconnier M.H., Klaenhammer T.R., Kerneis S., Bernet M.F and Servin A.L (1992), “Acidophilus BG2FO4 on human enterocyte and Protein-mediated adhesion of Lactobacillus mucus-secreting cell lines in culture” Applied and Environmental Microbiology 58(6), pp 2034-2028 25 Corzo G., Gilliand S.E (1999), “Bile salt hydrolase activity of three strains of Lactobacillus acidophilus”, Journal of dairy science Vol 82, No 26 Du Toit M., Franz C., Schillinger U., Warles B and Holzapfel W (1998), “Characterization and selection of probiotic lactobacilli for a preliminary mini pigfeeding trail and their effect on serum cholesterol level, faeces moisture contents”, International Journal of Food Microbiology 40, pp 93-104 27 FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Argentina 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 FAO/WHO (2002), “Guidelines for the Evaluation of Probiotic in Food”, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotic in Food London, Ontario, Canada 29 Fuller R (1989), “Probiotic in man and animals”, Journal of applied bacteriology (66), pp 365-378 30 Fuller R (1992), “History and development of probiotic”, In: R Fuller (Ed.) Probiotic: The Scientific Basis, Chapman & Hall, London pp 1−8 31 Gilliland S.E., and Walker D.K (1990), “Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans”, Journal of Dairy Science 73, pp 905911 32 Glenn R., Gibson, Helena Parracho, Anne L., McCartney (2007), “Probiotic and prebiotics in infant nutrition”, Proceedings of the Nutrition Society, 66, pp 405– 411 33 Haddadin M.S.Y., Awaisheh S.S and Robinson R.K (2004), “The production of yoghurt with probiotic bacteria isolated from infants in Jordan”, Pakistan Journal of Nutrition (5), pp 290-293 34 Hollang K.T., Knapp J.S., Shoesmith J.G (1987), “Anaerobic Bacteria”, CVM6202: Microbiology ,1st ed Blackie and Son, Ltd., London 35 Hoque M.Z., Akter F., Hosain K.M., Rahman M.S.M., Billah M.M and Islam K.M.D (2010) “Isolation, identification and analysis of probiotic properties of Lactobacillus spp from selective regional yoghurts”, World Journal of Dairy & Food Sciences (1) pp 39-46 36 Liong M.T., Shah N.P (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains”, Journal of Dairy Science 88, pp 55-66 37 Newman M.G (2002), “Antibiotics resistance is a reality: novel techniques for overcomingantibiotic resistance when using new growth promoters”, Nutritional biotechnology in the feed and food industries, proceedungs of alltech’s 18th annual symposiumm, nottingham unversity press, pp 98-106 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 Mandal S., Puniya A.K and Singh K (2006), “Effect of alginate concentration on survival of encapsulated Lactobacillus casei NCDC-298”, International Dairy Journal 16, pp 1190-1195 39 Michail S (2005), “The Mechanism of Action of Probiotic”, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio 40 Mishra C., Lambert J (1996), “Production of anti-microbial substances by probiotic”, Asia Pacific J Clin Nutr 5, pp 20–24 41 Patricia Neysens, Winy Messens, Luc De Vuyst (2003), “Effect of sodiumchloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471”, International Journal of Food Microbiology, 88, pp 29– 39 42 Pedersen C., Jonsson H., Lindberg J.E., Roos S (2004), “Microbiological characterization of wet wheat – distillers’ grain, with focus on isolation of lactobacillus with potential as probiotic”, Environment microbiolagical, pp 1522-1527 43 Prasad J., Gill H.S., Smart J and Gopal P.K (1998), “Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics”, International Dairy Journal 8, pp 993-1002 44 Ross G.R., Gusils C., and Gonzalez S.N (2008), “Microencapsulation of Probiotic Strains for Swine Feeding”, Biol Pharm Bull, 31(11), pp 2121 - 2125 45 Sahney S., Benton M.J and Ferry P.A (2010) “Links between global taxonomic diversity, ecological diversity and the expansion of vertebrates on land”, Biology Letters (4): 544–547 46 Sambrook J., Russell DW (2001) Molecular cloning a vi khuẩn lacticoratory manual, 3rd Cold, Spring Harbor Vi khuẩn lacticoratory, Cold Spring Harbor, NY 47 Sameh H.M (2003), “Influence of Different Capsule Materials on the Physiologycal Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus”, Dessertation at the University of Bonn, pp 49-50 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 SCAN (2000), “Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition”, European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General 49 Sahadeva R.P.K., Leong S.F., Chua K.H., Tan C.H., Chan H.Y., Tong E.V., Wong S.Y.W and Chan H.K (2011), “Survival of commercial probiotic strains to pH and bile”, International Food Research Journal 18(4), pp 15151522 50 Srikanjana Klayraung, Helmut Viernstein, Jakkapan Sirithunyslug, Siriporn Okonogi (2008) “Probiotic Properties of Lactobacilli Isolated from Thai Traditional Food” Scientia Pharmaceutica 76, pp 485–503 51 Tambekar D.H., Bhutada S.A (2010), “ An Evaluation of probiotic potential of Lactobacillus sp from milk of domestic animals and commercial avaivi khuẩn lacticle probiotic preparations in prevention of enteric bacterial infections”, Recent Research in Science and Technology, 2(10), pp 82-88 52 Xiao-Hua Guo, Jong-Man Kim, Hyang-Mi Nam, Shin-Young Park, Jae-Myung Kim (2010), “Screening lactic acid bacteria from swine origins for multistrain probiotic based on in vitro functional properties”, Anaerobe 16, pp 321-326 53 Yavuzdurmaz (2007), “Isolation, characterization, determination of probiotic properties of latic bacteria from human milk”, Graduate school of engineering and sciences of Izmir Institute of technology 54 Yazid A.M., Suhaimi, M., Ali, A.M., Ghazali, M.H Normah, J., Fatimah, A.B., Nur Atiqah, N.A and Reezal, A (1999), “Survival of bifidobacteria in simulated gastric pH and growth in the presence of bile”, Journal of Molecular Biology and Biotechnology 7(2): 185-190 55 Zavaglia A.G., Kociubinski G., Perez P., Disalvo E and de Antoni G (2002), “Efect of bile on the lipid composition and surface properties of bifidobacteria”, Journal of Applied Microbiology 93, pp 794-799 III Các website 56 www.vcn.vnn.vn 57 www en.wikipedia.org/wiki/Antibacterial 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 www.OzScientific.com 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .4 1.1.3 Đặc điểm phân loại vi khuẩn lactic 1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình TĐC vi khuẩn lactic .7 1.1.5 Lên men lactic Lactobacillus 10 1.1.6 Sự phân bố vi khuẩn Lactobacillus tự nhiên .11 1.2 Một số đặc tính probiotic Lactobacillus 11 1.2.1 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh 11 1.2.2 Khả chịu mặn .12 1.2.3 Khả tồn đường tiêu hóa 12 1.3 Probiotic 12 1.3.1 Định nghĩa probiotic .12 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu probiotic 13 1.3.3 Vai trò probiotic .14 1.3.4 Cơ chế tác động probiotic 15 1.3.5 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic .16 1.3.6 Các vi sinh vật probiotic .17 1.3.7 Tính an tồn probiotic động vật 18 1.4 Một số ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus 19 1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm 19 1.4.2 Trong công nghiệp 20 1.4.3 Trong nông nghiệp môi trường 20 1.4.4 Trong chăn nuôi thú y 21 1.4.5 Probiotic .21 1.5 Hệ vi sinh vật đƣờng ruột tác động hệ VSV tới sức khỏe vật chủ 22 1.6 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 24 1.6.1 Trên giới 24 1.6.2 Ở Việt Nam 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 26 2.2.1 Hóa chất 26 2.2.2 Thiết bị dụng cụ .27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu 28 2.3.2 Phương pháp hoạt hóa mẫu 28 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập 28 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm catalaza 29 2.3.5 Phương pháp nhuộm Gram 29 2.3.6 Phương pháp thử khả di động 30 2.3.7 Phương pháp định lượng vi khuẩn lactic 30 2.3.8 Phương pháp định lượng axít lactic sinh 31 2.4 Các phƣơng pháp lựa chọn chủng Lactobacillus có tính chất probiotic 31 2.4.1 Phương pháp đánh giá khả tồn mơi trường pH axít thấp pH kiềm 31 2.4.2 Phương pháp đánh giá khả chống chịu muối mật 32 2.4.3 Phương pháp xác định khả ức chế chủng kiểm định 32 2.4.5 Phương pháp nghiên cứu tính kháng chủng Lactobacillus 32 2.5 Phƣơng pháp định danh Lactobacillus 33 2.5.1 Tách ADN vi khuẩn lactic 33 2.5.2 Khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S phản ứng PCR .34 2.5.3 Phương pháp điện di ADN gel agarose 35 2.5.4 Đọc trình tự gen mã hóa ARNr 16S 36 2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết phân lập chủng Lactobacillus 37 3.2 Kết định lƣợng axít lactic sinh từ chủng phân lập 38 3.3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 3.3.1 Đặc điểm hình thái 40 3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng TL4, NS1, BC BB2 40 3.4 Kết khảo sát số đặc tính probiotic chủng TL4, NS1, BC BB2 điều kiện in vitro 46 3.4.1 Khả tồn mơi trường pH axít thấp pH kiềm .46 3.4.2 Khả chống chịu chủng TL4, NS1, BC BB2 môi trường muối mật 0,3% .50 3.4.3 Khả ức chế vi sinh vật chủng TL4, NS1, BC BB2 52 3.4.4 Kết kiểm tra tính đối kháng chủng TL4, NS1, BC BB2 53 3.5 Kết phân loại chủng Lactobacillus tuyển chọn 55 3.5.1 Tách ADN tổng số chủng TL4, NS1, BC 55 3.5.2 Khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S chủng TL4, NS1, BC 55 3.5.3 Kết xác định trình tự gen ARNr 16S chủng TL4, NS1, BC 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận: 61 Kiến nghị: 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 I Tiếng Việt 62 II Tiếng Anh 63 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự gen mã hóa ARNr 16S chủng TL4 Phụ lục Trình tự gen mã hóa ARNr 16S chủng NS1 Phụ lục Trình tự gen mã hóa ARNr 16S chủng BC Phụ lục Trình tự gen mã hóa ARNr 16S chủng L plantarum TL4 đăng ký Genbank GenBank flat file: LOCUS JQ937330 1341 bp DNA linear BCT 16-JUL-2012 DEFINITION Lactobacillus plantarum strain TL4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence ACCESSION JQ937330 VERSION JQ937330 KEYWORDS SOURCE Lactobacillus plantarum ORGANISM Lactobacillus plantarum Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus REFERENCE (bases to 1341) AUTHORS Nguyen,M.T., Nguyen,Q.T., Tran,V.P., Vu,V.L., Phan,T.H.T and Phi,Q.T TITLE Isolation and selection of some Lactobacillus strains capable of generating high lactic acid from fermentation products of Thai Nguyen city to manufacture biological products for animals JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1341) AUTHORS Nguyen,M.T., Nguyen,Q.T., Tran,V.P., Vu,V.L., Phan,T.H.T and Phi,Q.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (13-APR-2012) Institute of Life Sciences, Thai Nguyen University, Quyet Thang, Thai Nguyen, Thai Nguyen, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1341 /organism="Lactobacillus plantarum" /mol_type="genomic DNA" /strain="TL4" /db_xref="taxon:1590" /collection_date="2011" rRNA 1341 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN gtcagtgatg tgctgctcat gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg 61 tgggaaacct gcccagaagc gggggataac acctggaaac agatgctaat accgcataac 121 aacttggacc gcatggtccg agcttgaaag atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc 181 cgcggcgtat tagctagatg gtggggtaac ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac 241 ctgagagggt aatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag 301 cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga 361 agggtttcgg ctcgtaaaac tctgttgtta aagaagaaca tatctgagag taactgttca 421 ggtattgacg gtatttaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 481 acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt 541 aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg 601 agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag 661 aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg 721 gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt 781 gggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta 841 cggccgcaag gctgaaactc aatggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 901 ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa 961 gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1021 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc 1081 attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1141 tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg 1201 agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg 1261 ctgcaactcg cctacatgaa gtaggaatcg gtagtatctc ggactgcagc tattgcacag 1321 tcgatccgcg gccgccgcgt a Phụ lục Thành phần môi trƣờng MRS sử dụng phân lập Thành phần Hàm lƣợng Thành phần Hàm lƣợng Pepton 10g CH3COONa 5g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.H2O 0,06g Glucose 20g Triammonium citrate Tween 80 1ml Nước cất KH2PO4 2g pH Agar 20g Hấp khử trùng 1210C 15 phút lít 6,2 – 6,5 Phụ lục Thành phần dung dịch đệm PBS Thành phần Hàm lƣợng NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14,4g KH2PO4 2,4g pH 7,2 Hấp khử trùng 1210C 15 phút 2g ... ? ?Phân lập, tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao từ sản phẩm lên men khu vực thành phố Thái Nguyên? ?? với mục tiêu tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao, ... thấy từ 10 sản phẩm lên men thu thập khu vực thành phố Thái Nguyên phân lập 24 khu? ??n lạc nghi ngờ thuộc chi Lactobacillus Theo khóa phân loại Bergey’s (1984) [21] mơ tả vi khu? ??n lactic có khu? ??n... Phân lập chủng Lactobacillus - Định lượng axít lactic sinh chủng Lactobacillus phân lập - Đánh giá số đặc tính probiotic chủng Lactobacillus phân lập điều kiện in vitro - Phân loại số chủng Lactobacillus