Phân lập và tuyển chọn một số chủng clostridium sp kị khí ưa ấm có khả năng sinh hydro từ phân gia súc tại miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Huệ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG Clostridium sp KỊ KHÍ ƯA ẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH HYDRO TỪ PHÂN GIA SÚC TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Huệ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG Clostridium sp KỊ KHÍ ƯA ẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH HYDRO TỪ PHÂN GIA SÚC TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành Mã số : Vi sinh vật học : 60.42.01.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, người giúp tiếp cận đề tài, tận tâm bảo, hướng dẫn tơi q trình thực đề tài, tạo điều kiện giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tới thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN dạy dỗ, cung cấp cho kiến thức tảng, kinh nghiệm quý báu trình học tập để hồn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời tơi xin chân thành cảm ơn phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh vật học, Phịng thí nghiệm Nano ứng dụng, Khoa Sinh học Khoa Môi trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Viện vi sinh vật Công nghệ sinh học – ĐHQGHN, Trung tâm kiểm định môi trường – Cục cảnh sát môi trường Hà Nội giúp đỡ tận tình tạo điều kiện tốt cho tơi q trình nghiên cứu Cuối cùng, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè ln động viên, khuyến khích, giúp đỡ tơi suốt q trình hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn!!! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Hồng Huệ Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng nguồn lượng giới nhu cầu tìm nguồn lượng thay 1.1.1 Dầu mỏ 1.1.2 Khí tự nhiên .5 1.1.3 Than 1.2 Đặc điểm số nguồn lượng thay 1.2.1 Năng lượng nguyên tử .6 1.2.2 Năng lượng mặt trời 1.2.3 Năng lượng gió 1.2.4 Năng lượng thủy triều .7 1.2.5 Năng lượng thủy điện 1.2.6 Năng lượng sinh khối 1.3 Đặc tính ưu việt hydro 1.4 Một số phương pháp sản xuất hydro 11 1.4.1 Sản xuất hydro điện 11 1.4.2 Sản xuất hydro khí metan (SMR) 11 1.4.3 Sản xuất Hydro nước oxy hóa hydrocacbon 11 1.4.4 Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng .12 1.4.5 Lên men tối sinh hydro 12 1.5 Sản xuất H2 sinh học theo đường lên men tối 14 1.6 Một số loài vi khuẩn sản xuất hydro thông qua đường lên men tối 15 1.7 Sản xuất hydro sinh học từ chi Clostridium 19 1.7.1 Phân loại, đặc điểm .19 1.7.2 Quá trình sản xuất hydro sinh học 22 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 1.8 Một số nguồn nguyên liệu tái sinh 25 1.8.1 Bã đậu .25 1.8.2 Bột ngô 26 1.9 Tính cấp thiết đề tài 26 CHƯƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Nguyên liệu thiết bị 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Thiết bị 28 2.1.3 Các dụng cụ 28 2.2 Môi trường 29 2.2.1 Môi trường PY 29 2.2.2 Môi trường PYA 30 2.2.3 Môi trường với nguồn chất bã đậu 30 2.2.4 Môi trường với nguồn chất bột ngô 30 2.2.5 Các môi trường khác .32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Xử lý mẫu nuôi cấy .34 2.3.2 Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey .35 2.3.3 Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen rDNA 16S .38 2.3.4 Định danh khối phổ Protein 39 2.4 Các phương pháp phân tích 39 2.5 Nghiên cứu trình sản xuất hydro sinh học chủng Clostridium sp 40 2.5.1 Đánh giá khả sinh trưởng sinh hydro chủng phân lập 41 2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng sinh khí 41 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất đến khả sinh trưởng sinh khí 41 2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất đến khả sinh trưởng sinh khí 41 2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh khí 41 2.5.6 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh khí .41 2.5.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng sinh khí 42 2.5.8 Khảo sát ảnh hưởng muối Natri khả sinh trưởng sinh khí 42 2.5.9 Khảo sát ảnh hưởng muối Kali đến khả sinh trưởng sinh khí 42 2.5.10 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng sinh khí .42 2.6 Thăm dị số nguồn sản - phụ phẩm nông nghiệp làm nguyên liệu đầu vào cho trình sản xuất hydro sinh học nhờ lên men vi khuẩn kị khí ưa ấm Clostridium sp 42 2.6.1 Nguồn chất bã đậu 42 2.6.2 Nguồn chất bột ngô 42 2.7 Nghiên cứu khả sinh khí hydro điều kiện ni cấy kết hợp chủng Clostridium sp với chủng vi khuẩn khác 43 2.8 Phương pháp xử lý số liệu……………………………………………….43 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .44 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Clostridium sp ưa ấm lên men kị khí có khả tạo khí sinh học từ mẫu phân động vật 44 3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào .45 3.1.2 Định danh dựa vào khóa phân loại Bergey 47 3.1.3 Định danh lồi phân tích 16S rDNA 47 3.1.4 Định danh loài khối phổ Protein 50 3.2 Khảo sát điều kiện tối ưu sinh hydro 50 3.2.1 Khả sinh trưởng sinh khí chủng vi khuẩn 50 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng sinh khí 52 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng sinh khí 53 3.2.4 Ảnh hưởng hàm lượng glucose tới khả sinh trưởng sinh khí 55 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả sinh trưởng sinh khí 57 3.2.6 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh khí 59 3.2.8 Ảnh hưởng muối Natri đến khả sinh trưởng sinh khí hydro 62 3.2.9 Ảnh hưởng muối Kali đến khả sinh trưởng sinh khí hydro 63 3.2.10 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh trưởng sinh khí hydro 65 3.3 Thăm dò số nguồn sản - phụ phẩm nông nghiệp làm nguyên liệu đầu vào cho trình sản xuất hydro sinh học nhờ lên men vi khuẩn C beijerinckii CB3 67 3.3.1.Nguyên liệu đầu vào - phụ phẩm trình sản xuất sản xuất đậu phụ: bã đậu .67 3.3.2 Nguyên liệu đầu vào – sản phẩm trình sản xuất nơng nghiệp: bột ngơ .69 3.4 Nghiên cứu khả sinh khí hydro điều kiện nuôi cấy kết hợp chủng Clostridium beijerinckii CB3 với Enterobacter cloacae MCE64A9 71 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ .74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sự tạo thành hydro sinh học số vi sinh vật 16 Bảng 1.2: Một số loài thuộc chi Clostridium 21 Bảng 1.3: Sản lượng hydro từ chất khác số loài thuộc chi Clostridium 24 Bảng 3.1: Sản lượng khí hydro mẫu làm giàu lần 45 Bảng 3.2: Tính chất sinh lý hóa sinh chủng phân lập từ phân gia súc 47 Bảng 3.3: Kết định danh kỹ thuật sinh học phân tử 49 Bảng 3.4: Sản lượng hydro từ chủng phân lập 51 Bảng 3.5: Ảnh hưởng thời gian tới khả sinh trưởng sinh khí .52 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng sinh khí 54 Bảng 3.7: Ảnh hưởng hàm lượng glucose tới khả sinh trưởng sinh khí 56 Bảng 3.8: Ảnh hưởng nguồn Nitơ tới khả sinh trưởng sinh khí .57 Bảng 3.9: Giá trị pH ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh hydro .59 Bảng 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng sinh khí 61 Bảng 3.11: Ảnh hưởng NaHCO3 đến khả sinh trưởng sinh khí 62 Bảng 3.12: Ảnh hưởng K2HPO4 đến khả sinh trưởng sinh khí .64 Bảng 3.13: Ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả sinh trưởng sinh khí 65 Bảng 3.14: Các điều kiện tối ưu cho q trình sinh trưởng sinh khí chủng C beijerinckii CB3 66 Bảng 3.15: Các đặc điểm bã đậu thô bã đậu qua xử lí 67 Bảng 3.16: Sản lượng hydro môi trường chất bã đậu thơ bã đậu qua xử lí 67 Bảng 3.17: Hàm lượng đường khử bột ngô thô bột ngô qua xử lý 69 Bảng 3.18: Sản lượng hydro môi trường chất bột ngô thô bột ngô qua xử lí 69 Bảng 3.19: Sản lượng hydro chủng nghiên cứu 72 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học DANH MỤCHÌNH Hình 1.2: Lượng khí thải CO2 sinh sử dụng lượng hóa thạch [4] .4 Hình 1.1: Mức tiêu thụ nguồn lượng giới 1970-2025 (đơn vị nghìn triệu Btu) [4] Hình 1.3: Mức tiêu thụ khí tự nhiên giới 1970-2025 (nghìn tỷ feet khối)[4] Hình 1.4: Trữ lượng than phát giới (tỷ tấn) [4] Hình 1.5: Các đường sản xuất hydro sinh học [65] 13 Hình 1.6: Ảnh hiển vi điện tử C beijerinckii NCIMB 8052 (Lou Ann Miller and Scott Robinson, University of Illinois) .19 Hình 1.7: Sơ đồ lên men Clostridium Con đường dẫn tới sản lượng tối đa theo lý thuyết mol H2/ mol glucose tồn chất chuyển hóa thành axit acetic theo đường màu đỏ [65] .22 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro 34 Hình 2.2: Phương pháp sục khí nitơ 35 Hình 2.3: Nguyên lý phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh từ bể phân hủy kỵ khí (Lettinga, 1995) 40 Hình 3.1: Hình thái tế bào chủng CB2, CB3, CT4, CT5 .46 Hình 3.2: Hình thái tế bào chủng CB1 46 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm nhân gen 16S rDNA kĩ thuật PCR 48 beijerinckii CB3 51 Hình 3.5: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng sinh khí 53 Hình 3.6: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng sinh khí 54 Hình 3.7: Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả sinh trưởng sinh khí .57 Hình 3.8: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh khí 58 Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng sinh khí .61 Hình 3.11: Ảnh hưởng NaHCO3 đến khả sinh trưởng sinh khí 63 Hình 3.12: Ảnh hưởng K2HPO4 đến khả sinh trưởng sinh khí .64 Hình 3.13: Ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả sinh trưởng sinh khí 66 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học Hình 3.14: Ảnh hưởng bã đậu đến khả sinh trưởng sinh khí 68 Hình 3.15: Ảnh hưởng bột ngơ đến khả sinh trưởng sinh khí 70 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học Nhìn vào bảng số liệu thấy tương tự sử dụng chất bã đậu, với bột ngô thô qua xử lý sau nuôi cấy sản lượng hydro sinh Điều cho thấy khả tăng trưởng chậm chủng nghiên cứu so với môi trường sử sụng nguồn chất đơn giản với glucose, lactose… Sử dụng chất bột ngô thô, khả sinh trưởng sản lượng hydro thu tương đối thấp, đạt giá trị cao 77,53 ml/L môi trường, giá trị OD thấp 0,306 thời điểm 48 nuôi cấy Khi sử dụng bột ngơ qua xử lí làm chất cho thấy sinh trưởng sản lượng hydro cao nhiều so với sử dụng bột ngô thô làm chất Lượng hydro thu tăng lên khoảng 2,34 lần đạt giá trị cao 295,26 ml/L môi trường thời điểm 48 nuôi cấy Sau 48 khả sinh trưởng sinh khí chủng giảm dần Tương tự sử dụng chất bã đậu, điều qua trình tiền xử lý làm tăng khả phân giải nguồn carbonhydrat có mặt chất, tăng tỷ lệ loại đường đơn giản giúp chủng nghiên cứu dễ dàng tiêu thụ để tăng sinh khối sản lượng hydro 350 0.9 0.8 300 0.7 0.6 0.3 Sản lượng (ml) BNT Sản lượng (ml)BNXL OD BNT 0.2 OD BNXL 200 0.5 150 0.4 100 50 OD600 Sản lượng (ml) 250 0.1 0 12 18 24 30 36 42 Thời gian (giờ) 48 54 60 Hình 3.15: Ảnh hưởng bột ngô đến khả sinh trưởng sinh khí Trên giới có nhiều nghiên cứu sử dụng ngô nguồn chất cho trình lên men sản xuất hydro vi sinh vật [79] Arooj et al nghiên cứu sản xuất hydro sinh học lò phản ứng liên tục với bể kỵ khí sử dụng tinh bột ngơ làm chất 158 ngày Liu Shen nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ pH, nitơ, sắt hàm lượng tinh bột ban đầu cho sản xuất hydro sinh học Fan et al nghiên cứu sản xuất hydro sinh học từ ni cấy kị khí sử dụng ngơ già làm nguồn chất 70 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học chất nuôi cấy Sản lượng hydro tối đa đạt 346 ml H2 /g chất [79] Hiện nhiều nhà nghiên cứu sử dụng loạt nguồn carbohydrate chất thải thực phẩm để lên men, từ loại đường đơn giản bao gồm glucose, sucrose, xylose… đến loại carbohydrate phức tạp tinh bột, nông sản gạo, ngô, sắn, lúa mì, lúa miến, khoai tây… chế phẩm phân hủy lignocellulose từ rơm rạ hay glycerol thô, nước thải từ nhà máy…để sản xuất nguồn lượng cho tương lai với giá thành rẻ, đồng thời góp phần giải vấn đề nhiễm môi trường ngày gia tăng giới [79] 3.4 Nghiên cứu khả sinh khí hydro điều kiện ni cấy kết hợp chủng C beijerinckii CB3 với Enterobacter cloacae CB1 Trong trình lên men tối sản xuất hydro có tối đa mol H2/mol glucose sản xuất đồng thời với việc sản xuất lượng Phần lại hydro hexose bảo tồn sản phẩm phụ acetate điều kiện khơng lí tưởng có hình thành nhiều sản phẩm khử ethanol, lactate alanine Tuy nhiên người ta nghiên cứu khắc phục nhược điểm việc cần thiết sử dụng sản phẩm cuối trình lên men tối, đặc biệt axit béo dễ bay Chúng chuyển hóa thành hydro nhằm nâng cao hiệu suất sinh khí q trình ni cấy Q trình thực nhờ vi khuẩn quang hợp Sử dụng sinh vật lên men tối sinh hydro nuôi cấy kết cấy hợp vi khuẩn quang hợp Sphaeroides Rhodobacter, Palustris, Rhodopseudomonas đạt 2,86 -6,07 mol H2/mol hexose [19,66] Trong vài kết hợp khác Caldicellulosiruptor, Clostridium, Klebsiella, Lactobacillus Thermotoga với R capsulatus, R.sphaeroides, Rhodobium marinum R palustris sử dụng cho sản xuất H2, dẫn đến suất lên đến 7,2 mol/mol hexose [81] Các vi khuẩn kị khí tùy tiện như Bacillus Enterobacter có khả sản xuất H2 so với vi khuẩn kị khí Clostridium Tuy nhiên chúng có khả tiêu thụ oxy tạo mơi trường kị khí nuôi cấy với Clostridium [35, 84] tạo môi trường thuận lợi cho q trình sản sinh khí hydro ni cấy kết hợp Trong q trình phân lập ngồi chủng Clostridium sp., chúng tơi phân lập thêm chủng Enterobacter cloacae, chủng vi khuẩn Gram âm, hiếu 71 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học khí tùy tiện Khi phát triển điều kiện kị khí có khả sinh khí hydro Trong q trình phân lập chúng tơi nhận thấy hai chủng xuất mẫu phân lập Chúng tiến hành nuôi cấy chủng Clostridium beijerinckii CB3 Enterobacter cloacae CB1 riêng rẽ kết hợp môi trường PY thu kết sau: Bảng 3.19: Sản lượng hydro chủng nghiên cứu Chủng nuôi cấy OD600 Sản lượng Hydro (ml/Lmôi trường) Clostridium beijerinckii CB3 1,458 ± 0,013 556,54 ± 23,11 Enterobacter cloacae CB1 0,489± 0,008 113,68 ± 6,54 Clostridium beijerinckii CB3 + 1,461 ± 0,017 572,25±9,86 Enterobacter cloacae CB1 Từ bảng số liệu thấy ni cấy riêng lẻ, C beijerinckii CB3 cho sản lượng hydro cao đạt 556,54 ml/L môi trường khả sinh trưởng tốt đạt giá trị OD 1,458 Trong đó, ni cấy riêng rẽ Enterobacter cloacae CB1 cho sản lượng hydro thấp đạt 113,68 ml/L môi trường Khi nuôi cấy môi trường PY kết hợp chủng vi khuẩn sản lượng hydro đạt cao hẳn nuôi cấy riêng lẻ Enterobacter cloacae CB1, xấp xỉ với sản lượng nuôi cấy riêng C Beijerinckii CB3, đạt 572,25 ml/L môi trường Trong điều kiện nuôi cấy kết hợp, chủng Enterobacter cloacae CB1 có khả loại bỏ lượng oxy cịn sót lại tạo điều kiện yếm khí tuyệt đối mơi trường ni cấy sinh khí hydro môi trường chất glucose Nên khả sinh khí hydro gần ni cấy riêng lẻ C beijerinckii CB3 Kết tương tự với nghiên cứu Haruhiko Yokoi cộng (2000), tiến hành nuôi cấy kết hợp C butyricum E aerogenes môi trường mà không bổ sung chất khử với nguồn chất bã khoai lang thu sản lượng hydro 2,4mol/mol chất tương tự với nuôi cấy riêng lẻ C butyricum Trong nghiên cứu này, phương pháp sản xuất hydro có suất cao từ bã khoai lang C butyricum, E aerogenes Rhodobacter sp M-19 thực [85] 72 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu bước đầu đạt được, rút số kết luận: - Đã phân lập, định danh chủng có khả sinh khí hydro thuộc chi Clostridiumvà Enterbacter: C beijerinckii CB3, Clostridium sp CB2, C bifermentans CT4 C bifermentans CT5, Enterobacter cloacae CB1 - Tuyển chọn chủng có khả sinh khí cao C beijerinckii CB3 Đã nghiên cứu khảo sát điều kiện thích hợp ni cấy chủng C beijerinckii CB3 để sinh lượng hydro tối đa, bao gồm: Cơ chất glucose - 10g/l, nhiệt độ - 370C, tốc độ lắc - 200 rpm, nguồn nitơ gồm pepton cao men, pH -8,5, thời gian – 48 giờ, NaHCO3 – 480mg/l, K2HPO4 – 32mg/l với sản lượng khí đạt 881,25 ml/L mơi trường - Bước đầu tìm hiểu số nguồn sản - phụ phẩm nông nghiệp bã đậu, bột ngơ…làm ngun liệu đầu vào cho q trình lên men sản xuất hydro sinh học Hàm lượng hydro đạt 261,02 295,26 ml/L môi trường từ nguồn chất tương ứng - Bước đầu tìm hiểu q trình ni cấy kết hợp chủng vi sinh vật làm tăng hiệu sản xuất hydro Nuôi cấy kết hợp C beijerinckii CB3 Enterobacter cloacae CB1cho sản lượng hydro cao đạt 556,54 ml/L môi trường khả sinh trưởng tốt đạt giá trị OD 1,458, xấp xỉ với sản lượng nuôi cấy riêng C Beijerinckii CB3 73 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học KIẾN NGHỊ - Tiếp tục sâu tìm hiểu điều kiện nuôi cấy chủng C beijerinckii CB3 để tối ưu hóa mơi trường ni cấy nhằm thu lượng khí hydro cao - Phát triển quy mô nuôi cấy từ nuôi cấy mẻ sang nuôi cấy liên tục thời gian dài để tìm hiểu khả sinh hydro có ứng dụng thiết thực quy mơ cơng nghiệp - Tiếp tực tìm hiểu nghiên cứu thêm nguồn chất hệ thứ hai (bã mía, lõi ngơ, rơm rạ, vỏ khoai tây luộc rỉ đường bã thải trình sản xuất tinh bột sắn…) để có thêm lợi ích mặt kinh tế - Hồn thiện quy trình sản xuất hydro sinh học từ nhiều nguồn nhiên liệu tái tạo, đặc biệt từ rơm, rạ, cellulose…cũng nâng cao hiệu suất tạo hydro để sản xuất nguồn nhiên liệu hydro sinh học quy mô lớn đến quy mô công nghiệp - Đánh giá hiệu suất hiệu mặt (kinh tế, xã hội, tác động môi trường…) sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo dồi Việt Nam để sản xuất nhiên liệu hydro - Nghiên cứu phương thức thu hồi hydro từ hỗn hợp khí tạo sau trình lên men… - Tiếp tực nghiên cứu trình nuôi cấy kết hợp chủng vi sinh vật nhằm nâng cao hiệu suất sinh hydro Đặc biệt kết hợp loài thuộc chi Clostridium với vi khuẩn có khả quang hợp, để chuyển hóa chất sinh q trình sinh khí hydro, đặc biệt axit béo dễ bay từ làm tăng hiệu suất sản xuất hydro 74 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1962), Giáo trình vi sinh vật học, Đại học Tổng hợp, Hà Nội Phạm Thùy Dương, "Hydrogen Pin nhiên liệu", Chuyên đề Năng Lượng VnGG, Chương 15 Bùi Thanh Huyền, "Bức tranh lượng giới” Chuyên đề lượng VnGG, Chương 11 Nguyễn Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga, Đặng Thị Yến, Nguyễn Thị Trang, Lại Thúy Hiền (2013), “Tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn có khả sinh hydro phân lập từ phân gia súc Việt Nam”, Tạp chí sinh học 35(3se), pp 79-87 Niên giám thống kê (1988), Nhà xuất Thống kê Trần Vạn Thọ, “Phân loại sơ lược”, Chuyên đề lượng – VnGG, Chương Nguyễn Thu Hoài (2015), Nghiên cứu vi sinh vật sinh methan ứng dụng cho sản xuất Biogas điều kiện môi trường nước lợ nước mặn, ĐHKHTNĐHQGHN Đặng Thị Yến, Vương Thị Nga, Lại Thúy Hiền, Nguyền Thị Thu Huyền (2016), "Ảnh hưởng yếu tố mơi trường đến khả tạo khí hydro sinh học chủng vi khuẩn Tr2 phân lập Việt Nam điều kiện vi hiếu khí", Tạp chí Khoa học Công Nghệ, 51c(5), pp 587-598 Tiếng Anh 10 Alalayah, Walid M, et al (2009), "Effect of environmental parameters on hydrogen production using Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564)", American Journal of Environmental Sciences, 5(1), pp 80-86 11 Ali, AZ and Kempf, W (1986), “On the degradation of photo starch during acid modification and hypochloride oxidation”, Starch Staerke, 38, pp 83 - 86 75 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 An, D., Li, Q., Wang, X., Yang, H., & Guo, L (2014), “Characterization on hydrogen production performance of a newly isolated Clostridium beijerinckii YA001 using xylose”, International Journal of Hydrogen Energy, 39(35), 19928–19936 13 Barry, D.Solomon, Abhijit Banerjee (2006), “A global survey of hydrogen energy research, development and policy ”, Energy Polic, 34, pp.781–792 14 Blackburn, James, Liang, Yanna, and Das, Debabrata (2009), "Biohydrogen from complex carbohydrate wastes as feedstocks—Cellulose degraders from a unique series enrichment", International journal of hydrogen energy, 34(17), pp 7428-7434 15 Cai, Jinling, et al (2013), “Fermentative hydrogen production by a new mesophilic bacterium Clostridium sp 6A-5 isolated from the sludge of a sugar mill “, Renewable energy, 59, pp 202-209 16 Calusinska M., Happe T., Joris B., Wilmotte A (2010), “The surprising diversity of clostridial hydrogenases: a comparative genomic perspective”, Microbial, 156, pp 1575-1588 17 Cappelletti B.M , Reginatto V., Amante E R and Antônio R V (2011), “Fermentative production of hydrogen from cassava processing wastewater by Clostridium acetobutylicum”, Renew Energy, vol 36, pp 3367-3372 18 Carol L Wells and Tracy D Wilkins, “Chapter 18 Clostridia: Sporeforming Anaerobic Bacilli”, Medical Microbiology,4th edition 19 Cheng J, Su H, Zhou J, Song W, Cen K (2011), “Hydrogen production by mixed bacteria through dark- and photo-fermentation”, Int J Hydrogen Energy, 36, pp 450–457 20 Cheng, Chieh-Lun, et al (2011), “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”, Bioresource technology, 102(18), pp 8514-8523 21 Chong, Mei-Ling, et al (2009), “Effects of pH, glucose and iron sulfate concentration on the yield of biohydrogen by Clostridium butyricum EB6” , International journal of hydrogen energy, 34(21), pp 8859-8865 76 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Collins M D., Lawson P.A., Willems A., Cordoba J J., Fernandez – Garayzabal J., Garcia P., Cai J., Hippe H., Farrow J A (1994), “The phylogeny of genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations”, Int J Syst Bacterial, 44, pp 812-826 23 Das, Debabrata and Veziro lu, T Nejat (2001), "Hydrogen production by biological processes: a survey of literature", International Journal of Hydrogen Energy, 26(1), pp 13-28 24 Elam, Carolyn C, et al (2003), "Realizing the hydrogen future: the International Energy Agency's efforts to advance hydrogen energy technologies ", International Journal of Hydrogen Energy, 28(6), pp 601-607 25 Elsayed Elbeshbishy, Hisham Hafez, Bipro Ranjan Dhar, George Nakhl,(2011), “Single and combined effect of various pretreatment methods for biohydrogen production from food waste”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 1379 - 1387 26 Evvyernie, Dwierra, et al (2000), "Identification and characterization of Clostridium paraputrificum M-21, a chitinolytic, mesophilic and hydrogenproducing bacterium", Journal of bioscience and bioengineering, 89(6), pp 596-601 27 Fang, Herbert HP, Li, Chenlin, and Zhang, Tong (2006), "Acidophilic biohydrogen production from rice slurry", International Journal of Hydrogen Energy, 31(6), pp 683-692 28 Ferchichi, Mongi, et al (2005), "Influence of culture parameters on biological hydrogen production by Clostridium saccharoperbutylacetonicum ATCC 27021", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(6-7), pp 855862 29 Gray, Clarke T and Gest, Howard (1965), “Biological Formation of Molecular Hydrogen: A “hydrogen valve” facilitates regulation of anaerobic energy metabolism in many microorganisms”, Science, 148(3667), pp 186-192 77 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Guwy, AJ, et al (2011), “Fermentative biohydrogen production systems integration”, Bioresource technology, 102(18), pp 8534-8542 31 Harun, Irina, et al (2012), “Hydrogen production performance by Enterobacter cloacae KBH3 isolated from termite guts”, International journal of hydrogen energy, 37(20), pp.15052-15061 32 Heyndrickx, M, De Vos, P, and De Ley, J (1990), "H2 production from chemostat fermentation of glucose by Clostridium butyricum and Clostridium pasteurianum in ammonium-and phosphate limitation", Biotechnology Letters, 12(10), pp 731-736 33 Hung C-H, Cheng C-H, Guan D-W, Wang S-T, Hsu S-C, Liang C-M, Lin C-Y (2011), “Interactions between Clostridium sp and other facultative anaerobes in a self-formed granular sludge hydrogen-producing bioreactor”, Int J Hydrogen Energy, 36, pp 8704–8711 34 Jannasch, Holger W, et al (1988), "Thermotoga neapolitana sp nov of the extremely thermophilic, eubacterial genus Thermotoga", Archives of Microbiology, 150(1), pp 103-104 35 Kamalaskar, Leena B, et al (2010), "High biohydrogen yielding Clostridium sp DMHC-10 isolated from sludge of distillery waste treatment plant", International journal of hydrogen energy, 35(19), pp 10639-10644 36 Kapdan, Ilgi Karapinar and Kargi, Fikret (2005), “Bio-hydrogen production from waste materials”, Enzyme and microbial technology, 38(5), pp 569-582 37 Kataoka, Naoaki, Miya, Akiko, and Kiriyama, Koichi (1997), "Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria", Water Science and Technology, 36(6), pp 41-47 38 Kims., Dale BE.,(2004), “global potential bioethanol production from wasted crops and crops residues”, Biomass and Bioenergy, 26, pp.361-375 39 Kumar, P., Sharma, R., Ray, S., Mehariya, S., Patel, S K S., Lee, J K., & Kalia, V C (2015), “Dark fermentative bioconversion of glycerol to hydrogen by Bacillus thuringiensis”, Bioresource Technology, 182, pp 383–388 78 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 40 Lars G Ljungdahl, Michael W Adams Larry L Barton, James G Ferr, Michael K Johnson (2003), Biochemistry and Physiology of Anaerobic Bacteria, Springer 41 Lee, Duu-Jong, Show, Kuan-Yeow, and Su, Ay (2011), "Dark fermentation on biohydrogen production: pure culture", Bioresource technology,102(18), pp 8393-8402 42 Leja Katarzyna, Kamila Myszka, et al (2014), "Selection and characterization of Clostridium bifermentans strains from natural environment capable of producing 1,3-propanediol under microaerophilic conditions", African Journal of Microbiology Research, 8(11), pp 1187-1197 43 Levin, David B, Pitt, Lawrence, and Love, Murray (2004), "Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application", International journal of hydrogen energy, 29(2), pp 173-185 44 Li, Ming, et al (2008), "Bio-hydrogen production from food waste and sewage sludge in the presence of aged refuse excavated from refuse landfill", Renewable Energy, 33(12), pp 2573-2579 45 Lu, Jingquan, et al (2008), "Improving anaerobic sewage sludge digestion by implementation of a hyper-thermophilic prehydrolysis step", Journal of Environmental Management, 88(4), pp 881-889 46 Maniatis, K (2003), "Pathways for the production of bio-hydrogen: opportunities and challenges", Oil, Gas & Energy Law Journal (OGEL) 1(5) 47 Mars A E , Veuskens T, Budde M A , van Doeveren P F N M, S, Lips J, Bakker R R, de Vrije T and Claassen P A M (2010), “Biohydrogen production from untreated and hydrolyzed potato steam peels by the extreme thermophiles Caldicellulosiruptor saccharolyticus and Thermotoga neapolitana”, Int J Hydrogen Energy,vol 35, pp 7730-7737 48 M’leod, JW and Gordon, J (1923), “Catalase production and sensitiveness to hydrogen peroxide amongst bacteria: with a scheme of classification base on 79 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học these properties”, The Journal of Pathology and Bacteriology, 26(3), pp 326331 49 Nandi, R and Sengupta, S (1998), "Microbial production of hydrogen: an overview", Critical reviews in microbiology, 24(1), pp 61-84 50 Narayanaswamy, S (1994), Plant cell and tissue culture, Tata McGraw-Hill Education 51 Ngo, Anh Tien (2010), Biohydrogen Production from Glycerol wastes of Biodiesel Manufacture by Thermotoga neapolitana DSM 4359, The Graduate School 52 Ngo, Tien Anh, Kim, Mi-Sun, and Sim, Sang Jun (2011), "High-yield biohydrogen production from biodiesel manufacturing waste by Thermotoga neapolitana", International journal of hydrogen energy, 36(10), pp 5836-5842 53 Nielsen, Annika T, et al (2001), "Hydrogen production from organic waste", International Journal of Hydrogen Energy, 26(6), pp 547-550 54 Nima Nasirian, Morteza Almassi, Saeid Minaei, Renatus Widmann, (2011), “Development of a method for biohydrogen production from wheat straw by dark fermentation”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 411 – 420 55 Noparat, P., Prasertsan, P., & O-Thong, S (2011), “Isolation and characterization of high hydrogen-producing strain Clostridium beijerinckii PS3 from fermented oil palm sap”, International Journal of Hydrogen Energy, 36(21), 14086–14092 56 Oh, You-Kwan, et al (2003), “Isolation of hydrogen-producing bacteria from granular sludge of an upflow anaerobic sludge blanket reactor”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 8(1), pp 54-57 57 Patrik R.Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2-production by engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy, Vol 33, pp 5122–5130 80 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 58 Perego P , Fabiano B, Ponzano G P and Palazzi E (1998), “Experimental study of hydrogen kinetics from agroindustrial by-product: optimal conditions for production and fuel cell feeding”, Bioprocess Eng, vol.19, pp 205-2011 59 Qureshi N., Blaschek H.P (2001), “Recent advances in ABE fermentation: hyperbutanol producing Clostridium beijerinckii BA101”, J Ind Microbiol Biotechnol, 27(5), pp 278-291 60 Reith, JH, Wijffels, René H, and Barten, H (2003), “Bio-methane and biohydrogen: status and perspectives of biological methane and hydrogen production”, Dutch Biological Hydrogen Foundation 61 Seelert, T., Ghosh, D., & Yargeau, V (2015), “Improving biohydrogen production using Clostridium beijerinckii immobilized with magnetite nanoparticles”, Applied Microbiology and Biotechnology, 99(9), pp 4107– 4116 62 Shinha, Pallavi and Pandey, Anjana (2011), “An evaluative report and challenges for fermentative biohydrogen production”, International Journal of Hydrogen Energy, 36(13), pp 7460-7478 63 Sinha, Pallavi and Pandey, Anjana (2014), "Biohydrogen production from various feedstocks by Bacillus firmus NMBL-03", International journal of hydrogen energy, 39(14), pp 7518-7525 64 Shinsuke Sakai, Tatsuo Yagishita (2007), “Microbial Production of Hydrogen and Ethanol From Glycerol-Containing Wastes Discharged From a Biodiesel Fuel Production Plant in a Bioelectrochemical Reactor With Thionine”, Biotechnology and Bioengineering, 98(2), pp 340-348 65 Sikora, A., & Błaszczyk, M (2013), “Lactic Acid Bacteria in HydrogenProducing Consortia : On Purpose or by Coincidence ?”, Lactic Acid Bacteria R & D for Food, Health and Livestock Purposes, pp 488-514 66 Su H, Cheng J, Zhou J, Song W, Cen K (2009), “Improving hydrogen production from cassava starch by combination of dark and photo fermentation”, Int J Hydrogen Energy, 34, pp 1780–1786 81 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 67 Suellen A Van Ooteghem, Stephen K Beer, Paul C Yue (2001), “Hydrogen Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana”, National Energy Technology Center, U.S Department of Energy 68 Susan E Childers, Madeline Vargas, Kenneth M Noll (1992), “Improved Methods for Cultivation of the Extremely Thermophilic Bacterium Thermotoga neapolitana”, American Society for Microbiology, 58(12), pp 3949-3953 69 Taguchi, Fumiaki, et al (1995), "Hydrogen production from continuous fermentation of xylose during growth of Clostridium sp strain No 2", Canadian journal of microbiology, 41(6), pp 536-540 70 Taguchi, Fumiaki, Takiguchi, Shuya, and Morimoto, Masayoshi (1992), "Efficient hydrogen production from starch by a bacterium isolated from termites", Journal of fermentation and bioengineering, 73(3), pp 244-245 71 Tanisho, S, Kuromoto, M, and Kadokura, N (1998), "Effect of CO2 removal on hydrogen production by fermentation", International Journal of Hydrogen Energy, 23(7), pp 559-563 72 Tanisho, S, Suzuki, Y, and Wakao, N (1987), "Fermentative hydrogen evolution by Enterobacter aerogenes strain E 82005", International journal of hydrogen energy, 12(9), pp 623-627 73 Tatsuo Yagishita, ShinsukeSakai, Bioelectrochemical Hydrogen and Ethanol Production from Glycerol as a By-Product of BDF Production, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) 74 Thauer, R.K., K Jungerman, K Decker (1977), “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriology Reviews, 41(3), pp 100-180 75 Thiruchitrambalam Valliyappan (2004), Hydrogen or Syn Gas Production from Glycerol Using Pyrolysis and Steam Gasification Processes, University of Saskatchewan Saskatoon, Saskatchewan, Master thessis 76 Tille, Patricia (2013), “Bailey & Scott’s diagnostic microbiology”, Elsevier Health Sciences 82 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 77 Van Andel, JG, et al (1985), "Glucose fermentation by Clostridium butyricum grown under a self generated gas atmosphere in chemostat culture", Applied microbiology and biotechnology, 23(1), pp 21-26 78 Van Groenestijn, JW, et al (2002), "Energy aspects of biological hydrogen production in high rate bioreactors operated in the thermophilic temperature range", International Journal of Hydrogen Energy, 27(11), pp 1141-1147 79 Vendruscolo, F (2014), “Biohydrogen Production from Starch Residues”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 8(12), pp 1400-1406 80 Vos P D., George M G.; Jones D, Noel R K, Ludwig W, Fred A R., Karl H S, William B W (2009), Bergey’s manual systematic bacteriology, Volume three, second edition, Ethens 81 Wang, CC, et al (2003), "Producing hydrogen from wastewater sludge by Clostridium bifermentans", Journal of Biotechnology, 102(1), pp 83-92 82 Wong, Yen Ming, et al (2014), “Draft genome sequence of C bifermentans strain WYM, a promising biohydrogen producer isolated from landfill leachate sludge”, Genome announcements, 2(2), pp e00077-14 83 Yokoi H, Maki R, Hirose J, Hayashi S (2002) “Microbial production of hydrogen from starch-manufacturing wastes”, Biomass Bioenerg, 22, pp 389– 395 84 Yokoi H, Mori S, Hirose J, Hayashi S, Takasaki Y (1998), “ H2 production from starch by mixed culture of Clostridium butyricum and Rhodobacter sp M19”, Biotechnol Lett, 20, pp 895–899 85 Yokoi, H., Saitsu, A., Uchida, H., Hirose, J U N., Hayashi, S., & Takasaki, Y (2001), “Microbial Hydrogen Production from Sweet Potato Starch Residue”, Biotechnol Lett, 91(1), pp 58–63 86 You-Kwan Oh, Subramanian Mohan Raj, Gyoo Yeol Jung, Sunghoon Park, (2011), “Current status of the metabolic engineering of microorganisms for biohydrogen production”, Bioresource Technology, 102, pp 8357–8367 83 Nguyễn Thị Hồng Huệ - CHK22- Luận văn cao học – Chuyên ngành Vi sinh vật học 87 Yung-Chung Lo, Yi-Chen Su, Chieh-Lun Cheng, Jo-Shu Chang (2011), “Biohydrogen production from pure and natural lignocellulosic feedstock with chemical pretreatment and bacterial hydrolysis”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 3955 – 3963 88 Zhao, Xin, et al (2011), "Hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii RZF-1108”, Bioresource technology, 102(18), pp 8432-8436 89 Ziv, Meira (2000), “Bioreactor technology for plant micropropagation”, Horticultural reviews, 24, pp 1-30 84 ... thực phân lập tuyển chọn số chủng Clostridium sp kị khí ưa ấm có khả sinh hydro từ phân gia súc Miền Bắc Việt Nam Đồng thời khảo sát điều kiện tối ưu cho việc sản xuất hydro sinh học từ chủng Clostridium. .. QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Huệ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG Clostridium sp KỊ KHÍ ƯA ẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH HYDRO TỪ PHÂN GIA SÚC TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM. .. nguồn lượng có nhiều ứng dụng tương lai khơng xa Do tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Phân lập tuyển chọn số chủng Clostridium sp kị khí ưa ấm có khả sinh hydro từ phân gia súc Miền Bắc Việt Nam? ?? với