phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh đắc lắc

Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

s

NGUYỄN VĂN BỐN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT

SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

NGUYỄN VĂN BỐN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT

SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào

khác

Người cam ñoan

Nguyễn Văn Bốn

Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn:

Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tơi trong suốt thời gian thực tập và hồn thành luận văn này

Cơ TS Võ Thị Phương Khanh, thầy TS Ngơ Đại Nghiệp đã cĩ nhiều ý kiến quý báu đĩng gĩp, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này

Quý thầy cơ giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phịng Đào tạo Sau đại học, ban giám hiệu nhà trường đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt thời gian khố học

Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được, Thảo, Hồi, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 đã tham gia tích cực trong quá trình tơi thực hiện đề tài này

Các thầy cơ trong bộ mơn Sinh học thực nghiệm đã tạo mọi điều kiện về thời gian, động viên tinh thần cho tơi trong suốt khĩa học

Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 đã đồn kết giúp đỡ, chia sẻ và động viên tơi trong suốt 3 năm học cao học

Cuối cùng, tơi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia đình: Bố, mẹ, Các anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia đình bố mẹ vợ đã là chỗ dựa vững chắc cho tơi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tơi cĩ nghị lực để cơng tác,

và phấn đấu

Nguyễn Văn Bốn

- HTch: Hoạt tính chung chitinase

- HTr: Hoạt tính riêng chitinase

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.2.4.2 Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11

1.2.4.5 Chất tăng hoạt, chất ức chế 12

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.8 Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp 29

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.2 Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37

3.3 Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42 3.3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43

3.4 Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc

3.5 Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc

3.5.3 Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54 3.5.4 Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56

Bảng 3 1 Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 34

Bảng 3.2 Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc 37

Bảng 3.3 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nồng ñộ chitin khác nhau 43

Bảng 3.4 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung các nguồn nitơ khác nhau 44

Bảng 3.5 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nhiệt ñộ khác nhau 46

Bảng 3.6 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các pH khác nhau 47

Bảng 3.7 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các tốc ñộ lắc khác nhau 48

Bảng 3.8 Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong các khoảng thời gian khác nhau 49

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 55

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57

Bảng 3.12 Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của chitin 3

Hình 2.1 Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 25

Hình 2.2 Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS 25

Hình 3.1 Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 39

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 43

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase 44

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 47

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến hoạt tính chitinase 49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 49

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 52

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng ñến hoạt tính chitinase 53

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chitinase 54

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 55

Hình 3.12 Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57

Hình 3.14 Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex 59

Hình 3.15 Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr của chitinase 60

Hình 3.16 Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin 60

Hình 3.17 Hình 3.17 Vòng phân giải chitin 60

Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 37 Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 41

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn ñề

Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin)

ñã ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu ñược sử dụng ñể chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày, Ngoài ra, Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn [1] Chính vì có ñặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N – acetyl – Glucosamine ñang ñược quan tâm

Oligo N – acetyl – Glucosamine ñược thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới

sự xúc tác của enzyme chitinase Trong tự nhiên, chitinase có thể ñược tách chiết

từ nhiều nguồn khác nhau: ñộng vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc sên; ), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt, ), các loài chân khớp

(arthropods) [17] Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá

phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hoá [25][26], do ñó giá thành chế phẩm cao

và cũng không thể ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tế

Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme Đó chính là vi sinh vật Trong số các ñối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá phổ biến ñể thu nhận nhiều loại enzyme, trong ñó có chitinase [25]

Trong nước cũng như trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về chitinase [13] Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật

tại Tây Nguyên, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng

nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”

2 Mục tiêu của ñề tài

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải chitin

- Xây dựng quy trình tách chiết chitinase và xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase tách chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Cấu trúc của chitin

1.1 T ổng quan về chitin và chitinase

1.1.1 Chitin [17][23]

1.1.1.1 Cấu tạo chitin

Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong ñó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37% Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô ñịnh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận

Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)])

là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc],

còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside

Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ Sự khác nhau này biểu hiện ở sự sắp xếp các chuỗi Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β-chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược Dạng chiếm nhiều nhất là α-chitin

bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein Tỉ lệ chitin : protein thông thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay ñổi trong suốt quá trình phát triển và khác

nhau giữa các loài Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất dinh dưỡng Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng ñốt (Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria) Ở các loài thực vật, chitin và

ñường amin ñóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao ñổi chất hay về cấu trúc hình thái

Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin) Chitin ñứng ở vị trí thứ hai sau cellulose Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều ñiểm về cấu tạo và chức năng Về chức năng, chúng ñều là những polysaccharide cấu trúc Về cấu trúc phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm -OH ở C2 ñược thay thế bằng một nhóm acetylamine Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo

1.1.1.3 Đặc ñiểm khác

Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm loãng và thuốc thử Schweitzer Chitin có thể tan trong một số dung dịch như HCl ñậm ñặc, HNO3, acid fomic khan

và một số muối trung tính Nếu ñun nóng chitin trong dung dịch kiềm mạnh, một

phần nhóm N-acetyl bị khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan Ngược lại, trong

dung dịch HCl ñậm ñặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các nối glycoside làm [α]D từ -14o dần ñổi sang +56o, sau ñó là sự thay ñổi ở các nhóm acetyl Độ nhớt của chitin trong dung dịch acid nitric là 14,3.10-3 ñối với chitin nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10-3 ñối với chitin từ nấm Các giá trị này xấp xỉ như nhau chứng tỏ khối lượng của chúng gần như nhau

β-1,4-Trong việc ñịnh tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật, ñộng vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy nhất có

ý nghĩa và có giá trị Trong khi ñó, các phương pháp ñịnh lượng chitin ñều có ñộ chính xác giới hạn, những ñiều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin có khả năng làm thay ñổi polysaccharide này, vì vậy khó ñạt ñược chitin tinh khiết Ngoài ra,

người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-D-Glucosamine

nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích từ nấm

1.1.1.4 Ứng dụng

Với kỹ thuật chế biến hiện ñại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm năng to lớn ñặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm

Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo ñộ bền dai cho

thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…) Chitin làm chất mang trong cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào, làm chất mang tạo các giá thể

trồng cây cảnh Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có ñộ bền dai, ñàn hồi, có thể tạo thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan ñể bảo quản các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp xưởng…) còn làm nguyên liệu ñể cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào vi sinh vật Chitosan ñược ñánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng

bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân

tố ổn ñịnh liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch

Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng

Các ñơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và

glucosamine, là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột

và viêm dạ dày Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối

u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác

Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng ñã ñược xuất bản cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế ñã ñược lưu hành tại Mỹ Các công trình nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng ñã xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong ñó có Mỹ và Nga ñã tập trung lại 3 năm một lần ñể trao ñổi các bài báo, nghiên cứu khoa học mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng Những ñiều ñó cho thấy chitin và

các dẫn xuất của chúng rất ñược quan tâm trên thế giới vì khả năng ứng dụng rất rộng cùng với những ñặc tính ñặc biệt của chúng

Hàng năm chitin ñược sản xuất ra khoảng 5.11 triệu tấn trên toàn thế giới Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ ñược thải ra hằng ngày từ ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất Trong vỏ tôm cua, chitin chiếm từ 20-50% khối lượng khô, khoảng 12% trong tôm nước ngọt, còn lại

là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci Nếu tận dụng ñược nguồn cung cấp chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo thành các sản phẩm thực

sự có giá trị [4]

1.2 Chitinase (EC 3.2.1.14) [17][23][25][26]

1.2.1 Khái niệm

Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các N-acetylglucosamine,

chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,4-glycoside

giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên kết với nhau trong chitin

Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, ñộng vật không xương sống, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus Chân khớp và nấm cần chitinase trong sự phân chia tế bào ñể tăng trưởng Chitinase ñược tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm Đối với nấm mốc, chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, ñồng hóa chitin và ký sinh

Ở vi khuẩn, chitinase ñược tạo ra ñể sử dụng chitin làm nguồn carbon và năng lượng Ở thực vật, chitinase là một thành phần của phản ứng chống lại sự xâm nhiễm và stress, phối hợp hoạt ñộng với các protein phòng vệ khác

Chitinase thương phẩm có giá rất ñắt, ñặc biệt là chitinase tinh sạch Vì vậy việc sử dụng chitinase thô trở nên phổ biến, thú vị hơn trong việc sản xuất GluNAc

và các oligomer có nguồn gốc từ chitin

1.2.2 Phân loại chitinase

1.2.2.1 Dựa vào cấu trúc phân tử

Chitinase ñược sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân ñường):

- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác ñịnh gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, ñược tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase

và N-acetylglucosamineidase Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2 motif trình tự ngắn ñược bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic ñược bảo tồn) giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau) Tuy nhiên, cả 2 loại chitinase ñều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8 Trong cả 2 enzyme, rãnh gắn cơ chất ñều nằm ở ñầu C của sợi trong cấu trúc barrel (βα)8 và gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tương ñương Không giống với các glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm

việc tác ñộng lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer Việc này

dẫn ñến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết hợp với vòng 5 oxazoline

- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở

thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), ñậu Hà Lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn

Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme

(EC 3.2.1.17) của ñộng vật và phage, bao gồm motif cuộn α+β và hoạt ñộng thông qua cơ chế nghịch chuyển

Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi

côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18

1.2.2.2 Dựa vào trình tự amino acid

Dựa vào trình tự ñầu amin (N), sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

- Nhóm I: là những ñồng phân enzyme trong phân tử có vùng ñầu N giàu cysteine chứa khoảng 40 amino acid (giống với vùng ñầu N ở hevein và các

enzyme khác có ái lực ñối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác

thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu carboxyl (C)(peptid nhận biết) Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt ñộng xúc tác Các vùng gắn chitin này không phải luôn ñóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà chúng cần ñể tạo các ñặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở ñầu C giúp ñịnh vị chitinase trên thành tế bào nấm men, ñóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em

Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và ñược cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus Chitinase nhóm I của thuốc lá

có vùng ñầu C giàu cystein ñóng vai trò là vùng gắn chitin

- Nhóm II: là những ñồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu ñoạn giàu cysteine ở ñầu N

và peptid nhận biết ở ñầu C Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn Chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài Ở thực vật, các protein nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và ñược tế bào tiết ra dưới nhiều ñiều kiện stress khác nhau

- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II,

nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang

hoạt tính lysozyme Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh

và ñược tiết ra ngoại bào

- Nhóm IV: là những ñồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và khá giống với chitinase vi khuẩn Trong phân tử cũng có ñoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase nhóm I

41 Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.2.2.3 Dựa vào phản ứng phân cắt

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase,

chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase) và chitobiase

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các ñoạn oligosaccharide, ñã ñược nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy

nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2

và M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8)

Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ ñầu không khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này

ñược thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2)

N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme

phân cắt chitin từ một ñầu cho sản phẩm chính là các monomer

Enzyme chitinase ñược tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium,

Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và ñặc biệt là ở nhóm Streptomycetes

Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta ñều cho thêm chitin-cơ chất của enzyme chitinase ñể làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, ñồng thời ổn ñịnh hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách Vi khuẩn tổng hợp

enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn carbon cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển

1.2.3.2 Chitinase nấm

Chitinase cũng ñược tạo ra bởi các loài nấm sợi Các chủng nấm mốc cho

enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, … ñặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus …

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng ñóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt ñộng của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm

1.2.3.3 Chitinase thực vật

Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea

brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), lúa

mạch ñen, cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, ñậu Hà Lan, ñậu nành, củ từ … và ñặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase Chitinase thực vật tồn tại chủ yếu ở các mô nhất ñịnh hoặc cơ quan sinh sản như hạt giống, củ, hoa và ñược cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân gây hại trên thực vật Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các enzyme chống bệnh khác Ví dụ các endochitinase mang tính base trong lá ñậu tập trung trong không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào Nhờ vậy, không bào thực vật ñược xem tương tự như tiêu thể ở ñộng vật Bởi vì bản thân thực vật không có chứa cơ chất của những enzyme phân giải như chitinase và β-1,3-glucanase, sự tồn tại của những enzyme này cho thấy chúng có vai trò kháng khuẩn, kháng nấm ký sinh gây bệnh và cả côn trùng

Các protein kháng khuẩn (pathogenesis-related protein) khác nhau ñược phân lập từ thực vật bao gồm thionin, protein bất hoạt ribosome, defensin, nsLTP

và các enzyme phân giải như β-1,3-glucanase và chitinase Nhiều chitinase, giống như các protein khác ñóng vai trò bảo vệ, có thể chịu ñược các protease ngoại bào, hoặc mang tính acid hoặc mang tính base (thông thường các protein mang tính acid ñược tiết vào apoplast hoặc môi trường ngoại bào, trong khi dạng base thường tập

trung nội bào trong các không bào) Trình tự của các chitinase acid giống với các chitinase base, chỉ khác ở chỗ chúng không có vùng ñầu N hevein

Xét về ñặc tính phân cắt, chitinase thực vật thường là endochitinase phân cắt ngẫu nhiên Một số chitinase thực vật có hoạt tính lysozyme cắt liên kết β-1,4 giữa

acid N-acetylmuramic và các gốc N-acetylglucosamine trong peptidoglycan Ví dụ như chitinase phân lập từ ñu ñủ, Rubus hispidus và Parthenocissus quinquefolia

1.2.3.4 Chitinase ñộng vật

Từ một số ñộng vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài ñộng vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân

ñốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận ñược

enzyme chitinase Đối với ñộng vật có xương sống, enzyme chitinase ñược tiết ra

từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ

Ngoài ra, enzyme chitinase còn ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân ñốt vào thời ñiểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác

1.2.4 Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase

1.2.4.1 Khối lượng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có khối lượng phân tử khoảng 25-40kDa [23] Một số chitinase có khối lượng phân tử khoảng 40-90kDa Enzyme chitinase của các loài thân mềm, chân ñốt, ñộng vật có xương (cá, lưỡng cư, thú) có khối lượng phân tử cao hơn, khoảng 120kDa Khối lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến ñổi rộng, từ 30 ñến 120kDa Một số enzyme chitinase có khối lượng phân tử thấp có thể ñược tạo

ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần protein

1.2.4.2 Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị pI thay ñổi rộng: 3,0-10,0 ở thực vật bậc cao và tảo, 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, 3,5-8,8 ở vi sinh vật

Hệ số hấp thu E280mg/ml=1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng ñơn 280nm

Hằng số Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml)

1.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nhìn chung, nhiệt ñộ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt ñộng là

40oC, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp enzyme chitinase hoạt ñộng trên cơ chất

là glycol chitin có nhiệt ñộ tối thích là 50oC Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt ñộ tối ưu khác nhau Thí dụ, nhiệt

ñộ tối ưu của chitinase từ khoai tây ngọt là 25oC [12] Ở các enzyme từ củ từ

Diosscorea opposita THUNB nhiệt ñộ tối ưu là 45-70oC [5]

Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus

licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chịu ñựng nhiệt

ñộ cao ñến 80oC Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn ñịnh ở nhiệt

ñộ 40oC vì côn trùng phát triển ở nhiệt ñộ 25oC Do ñó, nhiệt ñộ tối ưu của enzyme chitinase côn trùng không cao

có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme chitinase của

Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng 6,3, giá trị này ở khoai tây ngọt Ipomoea batatas là 5,0 Ở các enzyme từ củ từ Diosscorea opposita THUNB pH

tối ưu là 3,5-4,0 Tùy mục ñích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin

và N-acetyl-chitooligosaccharide ñược sử dụng thay thế cho chitin pH tối ưu của

enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin thuộc khoảng pH kiềm yếu Hoạt tính enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH<4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ dày của ñộng vật có xương sống vẫn hoạt ñộng ở pH 3,0

1.2.4.5 Chất tăng hoạt, chất ức chế

- Allosamidin

Allosamidin là một pseudotrisaccharide gồm 2 ñơn vị N-acetylallosamin gắn

với nhau nhờ liên kết β-1,4 và một nhóm allosamizoline Nhóm allosamizoline

tương tự như chất trung gian phản ứng oxocarbonium, cấu tạo bao gồm 1 cyclopentane và một vòng aminooxazoline Về cấu tạo, allose chỉ khác glucose ở

C3 trong ñó nhóm hydroxyl nằm thẳng trong allose và nằm ngang trong glucose

Allosamidin là chất ức chế chitinase ñầu tiên ñược phân lập từ khuẩn ty của

Streptomyces sp No.1713 Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế enzyme

chitinase ñược tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces

communis, Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis) Ngoài ra,

allosamidin cũng ñược phát hiện có khả năng gắn kết với các enzyme chitinase thực vật như hevamine và ức chế các enzyme chitinase thực vật (ña số thuộc họ Glycohydrolase 18) Điển hình nó ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID 50 (liều lượng 50% chất ức chế là 44,7µM) Nói chung, allosamidin ức chế mạnh chitinase

họ 18 và không ức chế protein lòng trắng trứng gà hay lysozyme người

Về cơ chế ức chế, allosamidine ức chế chitinase theo cơ chế cạnh tranh nhóm allosamizoline gắn vào tâm của trung tâm hoạt ñộng chitinase, giả làm chất trung gian phản ứng oxocarbonium nằm giữa C1 của N-acetyl-D-glucosamine và oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2 trong quá trình thủy giải Trong ñó ñiện tích dương ở C1 ñược ổn ñịnh bằng oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2

Allosamidin khá ñắt và khó tổng hợp Mặc dù các oligomer carbohydrate và những dẫn xuất của chúng có thể dùng ñể thiết kế chất ức chế glycoside hydrolase, chúng thường khó tổng hợp và quá lớn ñể ñi qua màng tế bào

- Các ion kim loại

Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế Đối với ion Cu+, có 2 dạng enzyme chitinase: một bị ức chế và một ñược tăng cường nhờ Cu2+ ñược tìm thấy ở

một số loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa

- Các chất khác

Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên ñược tổng

hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208 CI-4 ức chế việc phân tách tế bào

Saccharomyces cerevisiae và ngăn cản sự tạo khuẩn ty của nấm bệnh Candida albicans ở người Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 vì chúng có cấu trúc

giống chất trung gian phản ứng Các chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh hưởng ñến

chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền ký sinh trùng sốt rét

(Plasmodium falciparum) từ vật chủ ñến côn trùng

2 peptide ức chế glycoside hydrolase khác là argifin và argadin có thể ức chế chitinase ở nồng ñộ nano hay micro mole Các peptide này gắn trực tiếp lên các gốc ở tâm hoạt ñộng của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1 và +2 mặc dù những chất ức chế này là peptide nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như acetyl hay vòng thơm

Ngược lại, huyết thanh albumin có vai trò làm tăng hoạt ñộng của enzyme chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ ñầu của phản ứng

1.2.5 Các loại cơ chất của enzyme chitinase

1.2.5.1 Chitin

Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác, chitin ñược gắn kết với protein Trong một vài trường hợp, lớp biểu bì này ñược làm cứng bởi các liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose, mannan, glucan…) Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein, cấu trúc polymer hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn

1.2.5.2 Các dẫn xuất của chitin

Enzyme chitinase có thể tác ñộng lên một số dẫn xuất của chitin như

glycol-chitin, carboxymethylglycol-chitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl-tri

N-acetylchitotrioside (MUC-phát huỳnh quang)

Enzyme chitinase không hoạt ñộng trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin

1.2.6 Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và

chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có khối lượng phân

tử khác nhau, nhưng chiếm ña số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính

endochitinase không thể phân cắt thêm ñược nữa Hầu hết chitinase thuộc loại này

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp

lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n≥3] từ ñầu không khử và chỉ phóng thích

diacetylchitobiose (GlcNAc)2

β-N-acetylhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách

liên tục từ ñầu không khử và chỉ phóng thích các ñơn phân N-acetylglucosamine

Ngoài ra, ñể khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng

N-acetyl-chitooligosaccharide làm cơ chất Các oligosaccharide thường ñược thủy phân bên

trong trên một vài vị trí xác ñịnh hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enzyme

chitinase có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không Cũng có 2

dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharide

và trisaccharide, một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide và

tetrasaccharide Tóm lại, chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên

1.3 Tổng quan về nấm mốc [4]

1.3.1 Khái niệm

Nấm mốc (fungus) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào

không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu

tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloza và một số thành phần khác có hàm

lượng thấp Nấm học (Mycology) ñược khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên

là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova

Plantarum Genera) nhưng theo Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên

cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984)

nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài ñược mô tả, tuy nhiên, ước tính có

trên 100.000 ñến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái ñất Nhiều loài nấm mốc có

khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như ñộng vật, thực vật, ñặc biệt trên con người,

cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc ñã qua chế biến, bảo quản

Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật ñã ñược ñưa vào sản xuất công nghiệp và có một

số nấm ñược dùng làm ñối tượng nghiên cứu về di truyền học Nấm nói chung và vi sinh vật thuộc một giới riêng biệt Nấm mốc có chung 7 ñặc ñiểm sau ñây:

+ Cơ thể nấm là một tản (thalus) tức là một cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa phân hóa thành các cơ quan riêng biệt Tản có thể ñơn bào hoặc ña bào , ña số có dạng sợi gọi là sợi nấm hay khuẩn ty, sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn + Các vách ngang ở sợi nấm ngăn vách ñều có lỗ thông Tùy loại nấm mà lỗ thông có thể là 1 lỗ thông khá lớn ở chính giữa hoặc là có nhiều lỗ thông tương ñối nhỏ

+ Nấm có rất nhiều ñiểm chung với các sinh vật có nhân thật nhất là về cấu tạo của nhân Nấm khác hẳn cấu tạo với các vi sinh vật thuộc nhóm nhân nguyên thủy như vi khuẩn và vi khuẩn lam

+ Nấm có những ñặc ñiểm riêng biệt về mặt hóa học tế bào Nấm không có cấu trúc thống nhất giữa các nhóm về thành phần thành tế bào Chỉ có một số ít nấm chứa cellulose trong thành tế bào Chất dự trữ của nấm không phải là tinh bột

mà là glycogen như ở ñộng vật

+ Nấm không chứa diệp lục vì thế chúng chỉ có thể sống hoại sinh, kí sinh hoặc cộng sinh

+ Nấm sinh sản bằng bào tử vô tính và bào tử hữu tính

+ Nấm không có một chu trình phát triển chung

1.3.2 Hình dạng và kích thước

Đa số nấm có hình sợi (filamentous fungi - nấm sợi), sợi có ngăn vách (ña bào) hay không có ngăn vách (ñơn bào) Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm,

có khi ñến 10µm, thậm chí ñến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường ñặc và trên một số

cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một ñoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất ñịnh gọi là khuẩn lạc nấm

1.3.3 Cấu tạo tế bào sợi nấm

Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có celluloz Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina Những vi sợi chitin ñược hình thành nhờ vào enzim chitin synthase

Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội chất (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), ñặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rỏ chức năng

Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố ñặc trưng mà Matsueda (1978) ñầu tiên ly trích ñược và gọi là neocercosporin (C2H26O10) có màu tím ñỏ ở nấm Cercosporina kikuchi

Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của

tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng ñôi, bên trong màng nhân chứa RNA, phospholipid và protein dầy 0,02µm

1.3.4 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc

Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950) Nhiệt ñộ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 20oC ñến 50oC, tối hảo từ 22oC ñến

27oC và nhiệt ñộ tối ña mà chúng có thể chịu ñựng ñược là 35oC ñến 40oC, cá biệt

có một số ít loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH 6) nhưng pH tối ưu là 5 – 6.5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967)

Oxy cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển

Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần ñược cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể ñộng vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay ñịa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất ñịnh

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm ñược xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, Bo, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và

Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ ñơn giản như muối ammonium sẽ ñược nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp ñể cắt các ñại phân tử này thành những phân tử nhỏ ñể dễ hấp thu vào trong tế bào

1.3.5 Vị trí và vai trò của nấm mốc

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu ñến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trong chế biến, bảo quản Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo hay gây bệnh cho người, ñộng vật khác và cây trồng Tuy nhiên, các qui trình chế biến thực phẩm có liên quan ñến lên men ñều cần ñến sự có mặt của vi sinh vật trong ñó có nấm mốc Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acid hữu cơ (oxalic acid, citric acid, gluconic acid ), vitamin nhóm B, kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y dược, ñã ñược sử dụng rộng rãi trên thế giới Ngoài ra, nấm còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại

ñộ mầu mỡ cho ñất trồng

Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người,

Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá Những loài nấm gây bệnh trên

cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora ñặc biệt nấm Aspergilus flavus

và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong ñiều kiện thuận lợi sinh ra ñộc

tố aflatoxin

Bên cạnh tác ñộng gây hại, một số loài nấm mốc rất hữu ích trong sản xuất và

ñời sống như nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin ), nấm

Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua ñó có

thể dùng làm thiên ñịch diệt côn trùng Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với

thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút ñược nhiều hơn lượng phân

vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng

Nấm còn là ñối tượng nghiên cứu về di truyền học như nấm Neurospora crassa, nấm Physarum polycephalum dùng ñể tổng hợp DNA và những nghiên cứu khác

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trên thế giới ñã có rất nhiều công trình nghiêng cứu về chitinase với nhiều mức ñộ và lĩnh vực ứng dụng:

Nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết và tinh sạch chitinase từ nhiều nguồn khác nhau ñã ñược công bố như Izabela S Santos và cộng sự (2004) ñã tách chiết, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase thu nhận từ hạt

Adenanthera pavonina L [29]; Wen-Chi Hou và cộng sự (1998) ñã nghiên nghiên

cứu hoạt tính chitinase của khoai lang Ipomoea batatas [L.] Lam var Tainong57

[30]; Xiuyun Ye, Tzi Bun Ng (2005) nghiên cứu chitinase tách chiết từ ñậu (mung bean) với hoạt tính kháng nấm [31]; Woo-Jin Jung và cộng sự (2006) nghiên cứu

tinh sạch và xác ñịnh tính chất của exo-B-glucosaminidase từ Aspergillus

fumigatus S-26 [32]; Jayme A Souza-Neto và cộng sự (2003) cũng ñã nghiên cứu

hoạt tính chitinase trong ấu trùng muỗi [33],

Vấn ñề tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính chitinase cao và tối ưu môi trường cũng như ñiều kiện nuôi cấy chúng ñể thu nhận chitinase ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu: El-Katatny và cộng sự (2000) ñã nghiên cứu

sản xuất chitinase và B-1,3-glucanase từ Trichoderma harzianum ñể kiểm soát nấm

Sclerotium rolfsii [34]; N.N Nawani, B.P Kapadnis (2005) ñã nghiên cứu tối ưu

sản xuất chitinase bằng phương pháp dùng thống kê dựa trên thiết kế thực nghiệm

[35]; Parameswaran Binod và cộng sự (2005) ñã tối ưu sản xuất và tinh sạch

chitinase từ Pennicillum aculeatum NRRL 2129 bằng phương pháp lên men lỏng

[36] Gần ñây, Yano, S NopakRNA Rattanakit ñã nghiên cứu thu nhận, tinh sạch

và xác ñịnh tính chất chitinase của Streptomyces cyaneus SP-27,

Những nghiên cứu sâu hơn như phân lập tạo dòng và biểu hiện gen cũng ñã ñược thực hiện nhằm tăng khả năng tổng hợp chitinase của sinh vật: Chien-Jui Huang và Chao-Ying Chen (2005) nghiên cứu biểu hiện gen ở mức cao và xác

ñịnh tính chất của hai chitinase: ChiCH và ChiCW của Bacillus cereus 28-9 trong

Escherichia coli [37]; Yong-Seok Lee và cộng sự (2006) cũng ñã nghiên cứu tạo

dòng, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase từ Bacillus sp DAU101,

Bên cạnh những nghiên cứu trên, một loạt các nghiên cứu về chitinase ñịnh hướng ứng dụng công nghệ sinh học trong nông, lâm, ngư, y ñã ñược công bố: Wen-Teish Chang và cộng sự (2007) nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ môi trường

(có chứa bột vỏ tôm, cua sản xuất từ chất thải biển) nuôi cấy Bacillus cereus QQ308 ñể ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum, Fusarium solani và Pythium

ultimum làm tăng sự phát triển của cây [28]; Pernille H.B Poulsen và cộng sự

(2007) ñã bổ sung chitin vào phân compost ñể xử lý chất thải (hữu cơ) hộ gia ñình, kết quả ñã làm tăng hoạt tính chitinase trong ñống ủ, tăng sự ña dạng di truyền của

vi sinh vật ñồng thời tăng khả năng khoáng hóa chất thải hữu cơ so với ñối chứng [27]; Laura Ramı´rez-Coutin’o, Marı´a del Carmen Marı´n-Cervantes và cộng sự

(2006) ñã sử dụng chitinases từ Lecanicillium fungicola ñể thủy phân chitin nhằm

sản xuất oligosaccharides [18]; năm 2002 có một nghiên cứu khá thú vị: Mongkol Sukwattanasinitt và cộng sự ñã thử nghiệm ứng dụng enzyme thương mại không

có chitinase từ nấm sợi thủy giải B-chitin ñể thu nhận glucose [38],

2-acetamido-2-deoxy-D-Tại Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase phát triển mạnh trong những năm gần ñây Có hai hướng nghiên cứu chủ ñạo:

Hướng nghiên cứu khá phổ biến là tách chiết, tinh sạch, xác ñịnh ñiều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp và phản ứng của chitinase từ nhiều nguồn khác nhau dựa trên sự ña dạng về chủng loại sinh vật bản ñịa:

Chitinase từ thực vật: có nghiên cứu của Đặng Trung Thành (2008) về thu

nhận enzyme chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hòa [15]; Tại Đăk Lăk, Nguyễn Quang Nhân và cộng sự (2009) ñã nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase từ mủ cao su (Hevea

Phương Nhuệ và cộng sự (2010), ñã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tối khả

năng sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus Circulans HT11 [14];

Phạm Thị Ngọc Lan và Hoàng Quốc Anh (2010), tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn phân hủy chitin và khảo sát ñiều kiện sinh tổng hợp chitinase [8]; Cũng trong năm 2010, Nguyễn Văn Bốn ñã nghiên cứu tách chiết và xác ñịnh tính chất chitinase từ môi trường nuôi cấy nấm mốc phân lập tại Buôn Ma Thuột,

Một hướng nghiên cứu mới mang tính ñịnh hướng cho việc ứng dụng các vi sinh vật có hoạt tính chitinase hoặc chế phẩm chitinase trong việc khống chế dịch hại cho cây trồng: Nguyễn Văn Nam (Đại học Tây Nguyên) và cộng sự ñã nghiên

cứu sâu về cơ chế ñối kháng của các dòng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại cây

trồng: Năm 2009 nhóm tác giả ñã công bố hai công trình nghiên cứu về Cơ chế

thủy phân của enzyme Chi32 và Chi46 tinh sạch từ nấm Paecilomyces variotii lên chitin cấu thành trong sợi nấm Fusarium solani [11] và Vai trò của các enzyme này trong quá trình ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyme incognita [12]; Năm 2010,

nhóm tác giả tiếp tục ñăng tải một nghiên cứu về chức năng chitinase của nấm

Trichoderma harzianum T1 trong quá trình ñối kháng với nấm bệnh Fusarium

solani [10] Gần ñây (2011), Trần Thị Thu Hà (Đại học Nông Lâm Huế), cũng ñã

nghiên cứu vai trò của chitinase tái tổ hợp từ Trichoderma trong phòng trừ bệnh

hại cây trồng

Hiện nay, vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực Tây Nguyên,

cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật tại Tây Nguyên,

chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng chủng nấm mốc có