C: Nồng độ protein (mg/ml).
• Nồng độ protein được xác định theo phương pháp Bradford [9]
- Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất cĩ màu cĩ khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sĩng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp cĩ độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µgprotein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
- Tiến hành:
Chuẩn bị dung dich albumin chuẩn: cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml nước cất lắc đều cho tan hết và giữ ở 200C. Khi dùng pha lỗng 100 lần để được dung dịch Albumin 0,1mg/ml. HTch = X . K . V v . t (Cơng thức 1) HTr = C HTch (Cơng thức 2)
Pha thuốc thử Bradford: cân 50mg Coomassie Brilliant Blue và 25ml Ethanol 990 và 50ml acid phosphoric 85%, định mức tới 500ml bằng nước cất. Đựng trong chai nâu cĩ nút đậy kín.
Tiến hành lập đồ thị chuẩn: lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đĩ các chất theo bảng sau: Ống số Dung dịch Albumin 0,1 mg/ml (ml) Nước cất (ml) Nồng độ Albumin (µg/ml ) Thuốc thử Bradford (ml) 1 0,0 1,0 0,0 5,0 2 0,2 0,8 20 5,0 3 0,4 0,6 40 5,0 4 0,6 0,4 60 5,0 5 0,8 0,2 80 5,0 6 1,0 0,0 100 5,0
Lắc đều và để yên một lúc, sau đĩ đem đo độ hấp thu ở bước sĩng 595 nm, từ đĩ xây dựng phương trình đường protein.
Xác định protein trong mẫu dịch chiết: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, rồi thêm vào đĩ 5ml thuốc thử Bradford, đo OD595. Thế giá trị OD595 của mẫu vào phương trình đường chuẩn protein.
2.3.6. Phương pháp định danh các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase cao
+ Định danh sơ bộ dựa vào mơ tả hình thái các chủng nấm mốc [4].
+ Định danh theo phương pháp sinh học phân tử: giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase cao nhất [10].
2.3.7. Tối ưu hĩa mơi trường và điều kiện nuơi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase cĩ hoạt tính cao
Mơi trường Czapek lỏng được lựa chọn để tối ưu thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuơi cấy chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase mạnh nhất.
Thành phần dinh dưỡng của mơi trường nuơi cấy: Khảo sát nồng độ chitin (từ 0,1 đến 1%w/v), nguồn dinh dưỡng nitơ (peptone, amonium sulfate, natri nitrate và urea 1%w/v) bổ sung vào mơi trường nuơi cấy [34][22][36][40].
Điều kiện nuơi cấy: Khảo sát các kiều kiện nuơi cấy như nhiệt độ (từ 28 - 55oC); pH của mơi trường nuơi cấy (pH từ 4 đến 10) dùng HCl 5% và NaCO3 5% để điều chỉnh pH; tốc độ lắc được khảo sát ở ba mức 0; 150 và 300 (vịng/phút); ngưỡng thời gian nuơi cấy được khảo sát từ 5 đến 20 ngày[19][34].
Chỉ tiêu theo dõi: HTch (UI/ml).
2.3.8. Nghiên cứu xác định tác nhân tủa phù hợp [13]
- Tiến hành: tủa dịch nuơi cấy với các tác nhân tủa: ethanol, acetone, và amonium sulfate với tỷ lệ như sau:
Thể tích dịch nuơi cấy/thể tích ethanol = 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5
Thể tích dịch nuơi cấy/thể tích acetone = 1/1, 1/2, 1/3 và 1/4
(NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hịa: 70%, 80%, 90% và 95%
Cho tác nhân tủa từ từ vào dịch nuơi cấy, khuấy đều, để yên ở nhiệt độ thấp (2-6oC) trong khoảng 2 giờ để enzyme tủa hết. Ly tâm hoặc lọc để thu tủa. Hồ tan tủa trở lại với nước cất (thí nghiệm định lượng protein) hoặc đệm citrate pH5 (thí nghiệm xác định HTch) rồi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử bằng thuốc thử DNS.
- Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất tủa protein và HTch, tác nhân tủa nào phù hợp sẽ tủa được nhiều protein và cho enzyme cĩ hoạt tính chitinase cao.
- Phương pháp thẩm tích: Sử dụng màng thẩm tích cellophane, cắt màng theo chiều dài mong muốn, ngâm trong acid acetic 1% trong 1 giờ, sau đó chuyển qua nước cất. Tiếp tục luộc ống trong dung dịch EDTA kiềm (1% sodium carbonate, 10-3M EDTA) trong 1 giờ, sau đó thay bằng nước cất. Màng được bảo quản trong nước cất ở 4oC có bổ sung một ít sodium azide (NaN3). Cột chặt một đầu túi, rĩt
dung dịch enzyme cần loại muối vào túi, chừa lại một khoảng không khí (khoảng 10% thể tích), buộc chặt đầu còn lại. Túi thẩm tích được đặt vào dung dịch đệm citrate pH 5,0 trong một becher to, cột một đầu túi vào đũa thủy tinh gác ngang miệng becher. Dùng máy khuấy từ khuấy nhẹ nhàng liên tục. Thay dịch đệm vài
lần để loại muối. Sử dụng phương pháp này đối với các mẫu tủa bằng muối (NH4)2SO4.
2.3.9. Xác định tính chất cơ bản của chitinase
+ Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng xác định hoạt tính chitinase được tiến hành ở pH 5 trong 7 giờ với các mức nhiệt độ: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC 60oC và 65oC, rồi xác định HTch [7].
+ Xác định pH tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng xác định hoạt tính chitinase được tiến hành ở nhiệt độ tối ưu trong 7 giờ với dãy pH 3,0; 3,6; 4,2; 4,8; 5,4 và 6, rồi xác định HTch. Thí nghiệm cĩ sử dụng đệm citrate (pH 3,0 – 6,2) [7].
+ Xác định nồng độ cơ chất tối tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng xác định hoạt tính chitinase được tiến hành ở pH và nhiệt độ tối ưu trong 7 giờ với các các nồng độ huyền phù chitin: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 và 80 mg/ml, rồi xác định HTch [13].
+ Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính chitinase: khảo sát ảnh hưởng của 4 ion kim loại: Mn2+, Mg2+, Cu2+, Fe2+ với ba nồng độ 3; 5 và 7mM. Lấy 1ml enzyme trộn với 1ml dung dịch huyền phù chitin và 2 ml các dung dịch muối với 3 nồng độ 6; 10 và 14mM pha trong đệm citrate pH5 và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 7 giờ. Mẫu đối chứng được tiến hành trong điều kiện tương tự như vậy nhưng khơng cĩ mặt dung dịch muối. Từ kết quả xác định HTch, cĩ thể kết luận ảnh hưởng hoạt hĩa hay ức chế của các ion kim loại đến hoạt tính chitinase [13][7].
+ Xác định thời gian phản ứng tối ưu: tiến hành phản ứng thủy phân huyền phù chitin ở điều kiện tối ưu với thời gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5; 6 và 7 ngày rồi xác định HTch của từng ngày [7].
+ Tinh sạch chitinase bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex [7],
•Nguyên tắc:
Phương pháp lọc gel Sephadex dùng để tách các phân tử trong một hỗn hợp theo kích thước, hình dáng và khối lượng phân tử. Các phân tử cĩ kích thước nhỏ đủ lọt vào bên trong lỗ gel thì bị giữ lại, di chuyển chậm qua cột. Trong khi đĩ các phân tử cĩ kích thước lớn nằm ở kẽ hở giữa các hạt gel sẽ di chuyển nhanh hơn và được giải phĩng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
•Dụng cụ và hĩa chất:
- Ống nghiệm loại nhỏ (được ngâm tẩy trùng trong dd sulfo-cromic trong 24 giờ, rửa sạch, tráng nước cất và sấy khơ).
- Máy quang phổ 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway) - Dung dịch NaN3 0,02%.
- Gel Sephadex G50 (Kích thước lỗ 20 – 80 µm, khoảng khối lượng phân tử protein phân tách 1500 – 30000Da, hệ số trương nở 9-11ml/g gel khơ): Cân 2g gel khơ ngâm trong lượng thừa NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hồn tồn.
- Dung dịch đệm citrate pH 5,0. - Dung dịch HNO3 50%.
•Tiến hành
Rửa cột bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng acetone, để khơ.
Cho vào đáy cột lớp bơng gịn thủy tinh và lớp giấy lọc bên trên để tạo mặt phẳng. Đĩng khĩa cột, dùng becher cho từ từ dung dịch gel ngâm trong NaN3 0,02% vào cột. Gel cho vào cột phải liên tục, tránh hiện tượng phân lớp.
Khi gel đã cao hơn 10cm cĩ thể mở khĩa từ từ để cho lượng nước dư trong gel chảy bớt đi. Tiếp tục nhồi cột cho đến khi lớp gel cao khoảng 4/5 chiều dài cột.
Sau khi nhồi cột xong, cắt một miếng giấy lọc đặt lên trên mặt lớp gel nhằm tránh hiện tượng xáo trộn bề mặt gel khi cho mẫu vào cột. Cho dung dịch đệm vào để chạy ổn định cột trong 30 phút. Chỉnh tốc độ dịng khoảng 2ml/ 9-10 phút.
Chọn mẫu enzyme cĩ hoạt tính tốt nhất để qua gel, trước khi nạp cần chỉnh lại nồng độ protein cho thích hợp khoảng 0,5 – 1 mg/ml. Đợi lớp dung dịch bên trên vừa chạm bề mặt gel thì khĩa cột. Hút 0,5ml dung dịch enzyme cho vào cột. Mở khĩa cho dung dịch chạy tiếp. Khi mẫu enzyme vừa thấm hết vào bề mặt gel, cho dung dịch đệm liên tục vào cột gel để rửa giải. Dịch rửa giải bên dưới được hứng vào các ống nghiệm. Hứng khoảng 20-40 ống, mỗi ống 2ml. Đem các ống đo OD ở bước sĩng 280nm. Dựa vào giá trị đo được, vẽ thành các đỉnh (peak), gồm
các ống nghiệm thuộc cùng một peak. Chọn những peak cao đem xác định hàm lượng protein và xác định hoạt tính enzyme.
+ Tinh sạch chitinase bằng phương phápsắc ký ái lực dùng cột chitin [39]:
•Nguyên tắc:dựa trên nguên tắc tương tác đặc hiệu giữa enzyme và cơ chất. Dùng pH thích hợp để tạo ra ái lực giữu protein đích (chitinase) với cơ chất (chitin) và sự rửa giải protein dích ra khỏ cơ chất.
• Dụng cụ và hĩa chất:
- Ống nghiệm loại nhỏ (được ngâm tẩy trùng trong dd sulfo-cromic trong 24 giờ, rửa sạch, tráng nước cất và sấy khơ).
- Máy quang phổ 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway). - Bột chitin tinh sạch, bơng thủy tinh.
- Các loại đệm:
+ NaCl 0.5M trong đệm phosphate 20mM (pH6.0) (1). + Natri acetate 20mM (pH5,0) (2).
+ Natri acetate 20mM (pH4,0) (3). + Phosphate 1mM (pH6,0) (4).
•Tiến hành:
- Cân khoảng 7-10 gram bột chitin rồi ngâm trong nước cất, sau12 giờ khuấy lắc chiết bỏ phần dịch nổi, tiếp tục bổ sung nước cất rồi chiết bỏ phần dịch nổi cho đến khi loại bỏ được hết các phần tử chitin cĩ kích thước nhỏ.
- Chuẩn bị cột: rửa cột bằng dung dịch đệm (3), dùng 1 ít bơng thủy tinh nhồi ở đáy cột, sau đĩ tiếm hành nhồi chitin đã trương nở vào cột. Sau khi nhồi cột xong, cắt một miếng giấy lọc hoặc bơng thủy tinh đặt lên trên mặt lớp chitin nhằm tránh hiện tượng xáo trộn bề mặt cột khi cho mẫu vào cột. Cho dung dịch đệm (1) vào để chạy ổn định cột trong khoảng 15-30 phút. Chỉnh tốc độ dịng khoảng 4s/giọt.
- Nạp mẫu: trước khi nạp cần chỉnh lại nồng độ protein cho thích hợp khoảng 10 – 15 mg/ml bằng cách tủa rồi hịa tan trở lại bằng đệm (1). Đợi
lớp dung dịch bên trên vừa chạm bề mặt chitin thì khĩa cột. Hút khoảng 2-3 ml dung dịch enzyme cho vào cột. Mở khĩa cho dung dịch chạy tiếp. - Chạy sắc ký: lần lượt chạy các dung dịch đệm sau:
+ Đệm (1) chạy 3 cột: chitinase bắm vào cột.
+ Đệm (2) chạy 3 cột: rửa rải các protein ngoại trừ chitinase. + Đệm (3) chạy cho đến khi kết thúc nhằm rửa giải chitinase.
- Dịch rửa giải bên dưới được hứng vào các ống nghiệm. Hứng khoảng 40- 60 ống, mỗi ống 2ml. Đem các ống đo OD ở bước sĩng 280nm. Dựa vào giá trị đo được, vẽ thành các đỉnh (peak), gom các ống nghiệm thuộc cùng một peak. Chọn những peak cao đem xác định hàm lượng protein và xác định hoạt tính enzyme.
- Trước khi xác định hoạt tính chitinase cần tiến hành thẩm tích bằng đệm (4).
2.3.9. Xử lý số liệu: số liệu thực nghiệm được xử lý trên phần mềm Microsoft Execel 2007 và MSTATC 2003.
Chương 3
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk
Mơi trường Czapek cĩ bổ sung huyền phù chitin được dùng để phân lập các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase trong đất tại Đăk Lăk. Kết quả đã phân lập được 34 chủng nấm mốc ký hiệu từ D1 đến D34 trong đĩ 19 chủng (D1 – D19) được phân lập từ đất đỏ và 15 chủng (D20 – D34) từ đất xám. Các khuẩn lạc mọc lên được quan sát và mơ tả trong bảng 3.1.
Bảng 3 .1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk
STT
Ký hiệu chủng
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Màu sắc Rìa khuẩn
lạc Độ nổi
Sắc tố hịa
tan
1 D1 Trịn cĩ vành ở mép Trắng Nhung Gồ ghề
2 D2 Trịn cĩ vành ở mép Xanh rêu Lơng Lồi nhọn
3 D3 Rễ Trắng Lượn sĩng Gồ ghề
4 D4 Rễ Xám tro Rễ Gồ ghề
5 D5 Rễ Xám tro Lơng Lõm
6 D6 Trịn, mép viền răng cưa Xám Nhung Bằng phẳng
7 D7 Trịn cĩ vành ở mép Trắng Nhung Lồi nhọn
8 D8 Trịn cĩ vành ở mép Xanh rêu Lơng Lồi nhọn Nâu đen
9 D9 Dạng đồng tâm Ttrắng,
xanh, cam Nhung Phẳng
10 D10 Trịn cĩ vành ở mép Nâu Lơng Lồi nhọn
11 D11 Rễ Vàng Lượn sĩng Gồ ghề
12 D12 Rễ Đen Cành Ăn sâu vào
thạch
13 D13 Đồng tâm Xanh Lơng Gồ ghề
14 D14 Mép dạng rễ Cam Lơng Lồi cong
15 D15 Rễ Trắng, đen Cành Dạng nĩn Nâu đen
17 D17 Trịn cĩ vành ở mép Nâu Lơng Lồi cong
18 D18 Khơng đều Nâu Mép cĩ múi Phẳng Đen
19 D19 Rễ Trắng Lượn sĩng Gồ ghề
20 D20 Trịn cĩ viền ở mép Trắng Nhung Lồi cong Nâu đen
21 D21 Trịn cĩ viền ở mép Xanh Cành Dạng nĩn
22 D22 Trịn cĩ viền ở mép Nâu Lơng Lồi nhọn
23 D23 Trịn cĩ viền ở mép Xanh Lơng Phẳng
24 D24 Trịn đồng tâm Đen, trắng Nhung Lõm
25 D25 Trịn, viền răng cưa Xanh nâu Bằng phẳng Lồi cong
26 D26 Rễ Nâu Cành Gồ ghề
27 D27 Trịn cĩ viền ở mép Xám tro Lơng Lồi cong
28 D28 Trịn cĩ viền ở mép Trắng Lơng Lồi cong
29 D29 Rễ Trắng Cành Bằng
phẳng
30 D30 Trịn, viền mép răng cưa Xám tro Lơng Lồi cong
31 D31 Trịn cĩ vành ở mép Xanh rêu Lơng Lồi nhọn
32 D32 Rễ Xanh trắng Lơng Gồ ghề
33 D33 Rễ Trắng Lượn sĩng Gồ ghề
Ảnh 3.1. Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk
3.2. Tuyển chọn và định danh các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase cao 3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase cao
Các chủng nấm mốc cĩ hoạt tính chitinase được phân lập tại Đăk Lăk (34 chủng) tiếp tục được nuơi cấy đồng loạt trong mơi trường cảm ứng (cĩ chitin) để so sánh HTch. Kết quả thực nghiệm được ghi nhận trong bảng 3.2 và hình 3.1.
Bảng 3.2.Hàm lượng đường khử trong dịch nuơi cấy và hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Gía trị OD540nm Hàm lượng đường khử trong dịch nuơi cấy (mg/ml) Hoạt tính chung chitinase (UI/ml) D1 0,050 40,24 0,11i D2 0,047 39,33 0,11i D3 0,032 34,79 0,10i D4 2,450 767,52 2,13b D5 0,010 28,12 0,08i D6 0,016 29,94 0,08i D7 0,016 29,94 0,08i D8 0,011 28,42 0,08i D9 2,935 914,48 2,54a
D10 0,018 30,55 0,08i D11 0,022 31,76 0,09i D12 0,013 29,03 0,08i D13 0,015 29,64 0,08i D14 0,330 125,09 0,35efg D15 0,030 34,18 0,09i D16 0,015 29,64 0,08i D17 0,280 109,94 0,31fgh D18 0,940 309,94 0,86d D19 0,430 155,39 0,43ef D20 0,024 32,36 0,09i D21 0,810 270,55 0,75d D22 0,170 76,61 0,21ghi D23 0,019 30,85 0,09i D24 1,810 573,58 1,59c D25 0,030 34,18 0,09i D26 0,030 34,18 0,09i D27 0,540 188,73 0,52e D28 0,016 29,94 0,08i D29 0,013 29,03 0,08i D30 0,009 27,82 0,08i D31 2,300 722,06 2,01b D32 1,752 556,00 1,54c D33 0,011 28,42 0,08i D34 0,070 46,30 0,13hi ANOVAz / CHỦNG NẤM ** CV(%) 15,38 Z* khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức P<0,01.
Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau trong cùng một cột khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Ducan’s Multiple Rang test.
Các chủng nấm mốc được nuơi cấy trong mơi trường cảm ứng sẽ sinh ra chitinase. Enzyme này thực hiện phản ứng thủy phân, cắt huyền phù chitin thành