phân lập và tuyển chọn môt số chủng vi khuẩn cố định nito tự do azotobacter sp. trên một số loại đất ở đắc lắc

DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 Nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn 29 3.1 Ký hiệu, ñịa ñiểm phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby 34 3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

LÊ QUANG DŨNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO Azotobacter sp

TRÊN MỘT SỐ LOẠI ĐẤT Ở ĐĂK LĂK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Lê Quang Dũng

Những anh chị lớp cao học Sinh Học Thực Nghiệm khóa 3, ñã cùng tôi san

sẽ những buồn vui, cùng nhau học tập và trao ñổi kiến thức trong quá trình làm

ñề tài

Các em sinh viên CN Sinh K07 và các anh chị làm việc trong bộ môn sinh học thực vật, bộ môn khoa học về ñất, ñã sẵn sàng giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những nhà khoa học trong ngành, các ñồng nghiệp, bạn bè và người thân ñã ñộng viên giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp

Đăk Lăk, tháng 10 năm 2011

Tác giả

Lê Quang Dũng

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn 29 3.1 Ký hiệu, ñịa ñiểm phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby 34

3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn phân lập ñược 36

3.3 Khả năng cố ñịnh nitơ của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp 40

3.4 Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp 42

3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp ñến số lá cây cải ngọt 44

3.6 Ảnh hưởng các chủng vi khuẩn Azotobacter sp ñến chiều cao cây cải ngọt 45

3.7 Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp ñến khối lượng rễ cây cải 47

3.8 Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp ñến năng suất cây cải ngọt 48

3.9 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp ñến số lá cây cải ngọt 50

3.10 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp ñến chiều cao cây cải ngọt 52

3 11 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp ñến khối lượng rễ cây cải ngọt 53

3.12 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lên diện tích lá cây cải ngọt 55

3.13 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp ñến năng suất cây cải ngọt 56

3.14 Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp tuyển

chọn nuôi cấy từ các nguồn carbon khác nhau 58

3.15 Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp

tuyển chọn nuôi cấy ở các nồng ñộ glucose khác nhau 61

3.16 Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của bốn chủng vi khuẩn Azotobacter sp

tuyển chọn nuôi cấy trên các khoản nhiệt ñộ khác nhau 63

3.17 Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp

tuyển chọn ñược nuôi cấy ở các pH khác nhau 65

3.18 Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp

tuyển chọn nuôi cấy ở các thời gian khác nhau 67

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Giữa ñất, vi sinh vật và cây trồng có mối quan hệ tác ñộng qua lại lẫn nhau Quá trình hình thành ñất và ñộ phì của ñất chịu ảnh hưởng của các yếu tố vật lí, hóa học và vi sinh vật Vi sinh vật tổng hợp và giải phóng vào ñất những chất hữu cơ cần thiết tạo ñộ phì cho ñất, ngược lại ñất là môi trường sống cần thiết cho vi sinh vật, ñất và vi sinh vật cùng tác ñộng rất lớn ñến cây trồng, ñặc biệt cung cấp nguồn dinh dưỡng, một trong các nguồn dinh dưỡng quan trọng cho cây trồng là nguồn nitơ [8]

Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy ñi khỏi ñất khoảng 30 kg nitơ [3] Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy ñi khỏi ñất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G Colar và Greenland) [3] Trong khi ñó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù ñắp ñược một phần lượng nitơ mà cây lấy ñi khỏi ñất Lạm dụng quá mức việc

sử dụng phân hóa học làm ñất xấu ñi, mất cân ñối các chất dinh dưỡng và làm giảm hệ vi sinh vật có ích, hơn nữa việc sản xuất phân nitơ hóa học còn gặp nhiều khó khăn, giá thành khá cao Vấn ñề ñặt ra là làm thế nào ñể bổ sung lượng dinh dưỡng nitơ cho ñất một cách có hiệu quả nhất, vừa tiết kiệm ñược chi phí sản xuất, bảo vệ ñược môi trường

Một trong những giải pháp ñang ñược áp dụng ñể cải tạo ñất hiện nay là

sử dụng phân bón vi sinh vật Nhóm vi sinh vật trong phân có tác dụng cải thiện

ñộ phì, cân bằng dinh dưỡng trong ñất, cải thiện các tính chất lý, hóa của ñất, và ñặc biệt hạn chế ô nhiễm môi trường, cũng như ô nhiễm môi trường nước do quá trình rửa trôi [1]

Trong tự nhiên, ngoài nguồn nitơ ñược tạo ra cho ñất từ quá trình amon hóa, quá trình nitrat hóa, nguồn nitơ còn ñược tạo ra từ quá trình cố ñịnh nitơ phân tử ñược thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong ñất, trong ñó có sự ñóng góp của

nhóm vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp Các vi sinh vật thuộc nhóm

này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây trồng có khả năng hấp thụ ñược [3]

Azotobacter sp là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong ñất, chúng

có khả năng cố ñịnh ñạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ Ngoài ñặc ñiểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật) Chính nhờ ñặc ñiểm quan trọng ñó vi

khuẩn Azotobacter sp ñược ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi

sinh vật làm tăng năng suất cây trồng

Ở Việt Nam ñã có một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật cố ñịnh nitơ

tự do trên một số loại ñất ñể làm phân vi sinh, nhưng hiện nay chưa có một

nghiên cứu nào về thành phần loài thuộc chi Azotobacter sp trên một số loại ñất

ở Đăk Lăk

Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập

và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp trên một số loại ñất ở Đăk Lăk”

2 Mục tiêu của ñề tài

- Tuyển chọn ñược một số chủng Azotobacter sp cố ñịnh ñạm cao trên một

số loại ñất ở Đăk Lăk

- Đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp ñối với sự sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea)

3 Ý nghĩa của ñề tài

Ý nghĩa khoa học

Đề tài góp phần phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp

bản ñịa có khả năng cố ñịnh ñạm cao trên một số loại ñất ở Đăk Lăk, góp phần vào công công tác bảo tồn ña dạng vi sinh vật ở Đăk Lăk và Tây Nguyên

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter sp trên một số

loại ñất ở Đăk Lăk có hoạt tính cố ñịnh nitơ cao ñể sản xuất phân vi sinh có hiệu

quả, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên

Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH4+, NO2-, NO3- Trong ñất

có 2 dạng nitơ tồn tại ñó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác, chất bài tiết từ sinh vật Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết của ñộng vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải

Trong ñất amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat Phần lớn hợp chất nitrat ñược thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất ñi do mưa rửa trôi và tác dụng của phản nitrat hóa

Hợp chất ñạm mà thực vật hút từ ñất một phần như gốc rễ ñược trả lại ñất, phần còn lại ñược ñộng vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết trả lại ñất Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành ñạm ở dạng hữu hiệu

Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2) chiếm khoảng 80%, ở dạng nguyên tử kép (N2) ñược khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N) Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ ñược nitơ ở dạng NO3- và NH4+ [3] Để sử dụng ñược nguồn nitơ lớn

từ không khí có 2 con ñường chính là hóa học và sinh học

Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch ñã

giúp con người phá vỡ liên kết ba này Biện pháp này ñòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt ñộ rất cao (450 – 500oC), áp suất là 125 atm và Fe3+ là chất xúc tác Các hợp chất nitơ ñược tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn ñịnh Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân ñạm tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng ñem lại những tác hại cũng không nhỏ, vì trung bình chỉ có 40 – 50 % lượng ñạm bón ñược cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường ñất, nước, không khí… từ ñó gây hại thậm chí là tiêu diệt các sinh vật có lợi Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa

Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase ñể thực hiện

quá trình sinh học ñặc biệt - quá trình cố ñịnh nitơ Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này ñược gọi là các vi sinh vật cố ñịnh nitơ Việc sử dụng phân bón vi sinh làm ñất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo ñất do các hệ sinh vật có ích hoạt ñộng mạnh làm cho ñất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn Ngoài ra, còn có các con ñường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [12]

1.2 Vai trò của nitơ ñối với thực vật

Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao ñộng từ 1 – 3% Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý ñặc biệt quan trọng trong ñời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không ñược tổng hợp ñầy ñủ, lá vàng, ñẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt ñộng quang hợp nên năng suất giảm Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ ñổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn

1.3 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

1.3.1 Quá trình khoáng hóa

Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác ñộng của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào ñiều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau Giai ñoạn

này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và

Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất

chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp ñể cho cây trồng hấp thu

1.3.2 Quá trình phản nitrat hóa

Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong ñiều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ

1.3.3 Quá trình cố ñịnh nitơ phân tử

Quá trình này ñược thực hiện do các vi sinh vật cố ñịnh nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ ñậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến ñổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và ñồng thời làm giàu thêm nitơ cho ñất Để quá trình này xảy

ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở ñiều kiện kỵ khí (do chỉ trong ñiều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt ñộng)

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố ñịnh nitơ của vi khuẩn sống tự do

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố ñịnh N2 của vi sinh vật cho ñến nay vẫn chưa ñược sáng tỏ hoàn toàn, nhưng ña số các nhà nghiên cứu ñồng ý với giả thuyết cho rằng NH3 là sản phẩm ñồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con ñường cố ñịnh N2 của vi khuẩn sống tự do trong ñất như sau:

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố ñịnh N2 ñược giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật Tốc ñộ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt ñộ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt hóa H2 và nitrogenase hoạt hóa N2

Năm 1961 – 1962, người ta ñã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu

phần hoạt hóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các

tiểu phần ñó Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe

Nguồn hydro ñể khử N2 có thể là hydro phân tử (H2) Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của hydrogenase, ñiện tử ñược chuyền theo hệ thống:

Nguồn cho ñiện tử và hydro là acid pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình chuyền ñiện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd) Fd là cầu nối giữa 2

hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase ñể cố ñịnh N2

Sự cố ñịnh N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ ñồ phức tạp hơn Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin Nó dễ dàng liên kết với O2 ñể biến thành oxyhemoglobin Leghemoglobin chỉ ñược tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh

với cây bộ ñậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo

leghemoglobin và không cố ñịnh ñược N2 Những nghiên cứu gần ñây về quá trình cố ñịnh N2 cho thấy quá trình cố ñịnh này ñòi hỏi:

Có sự tham gia của enzyme nitrogenase Có thể coi ñây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này Enzyme này hoạt ñộng trong ñiều kiện yếm khí

Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

Có năng lượng ATP ñủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạt ñộng của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ ñậu thường có hiệu quả rất cao

Tiến hành trong ñiều kiện yếm khí Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp Sự cố ñịnh N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP ñể khử 1 N2 NH3 tạo thành trong quá trình cố ñịnh N2 ñược sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid ñể tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ ñó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao ñổi chất khác

Phản ứng cố ñịnh nitơ ñược xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:

N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi

Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin trong cơ thể sống Nitrogenase là một phức hệ enzyme ñược cấu tạo bởi 2 thành phần, ñó là protein có phân tử nhỏ Một thành phần gọi là protein sắt – molypden (Mo – Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II Thành phần I và thành phần II của nitrogenase ñều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt ñộng cố ñịnh nitơ của vi sinh vật diễn ra trong ñiều kiện kỵ khí [18]

1.4 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ

Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy

ñi khỏi ñất khoảng 30 kg nitơ [3] Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy ñi khỏi ñất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G Colar và Greenland) [3] Trong khi ñó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù ñắp ñược một phần lượng nitơ mà cây lấy ñi khỏi ñất, những tổn thất về nitơ ñược bù ñắp bởi một quá trình sinh học ñặc biệt gọi là quá trình cố ñịnh nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các

hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn ñạm trong ñất, có thể xếp chúng

thành ba nhóm lớn:

+ Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật

+ Nhóm vi khuẩn sống tự do

+ Nhóm vi khuẩn lam

1.4.1 Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật

1.4.1.1 Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ ñậu

Nhà khoa học Hà Lan M.W Beijrinck ñã phân lập ñược loài vi khuẩn sống

cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ ñậu và ông ñặt tên là Bacillus

radicicola, vi khuẩn này ñược xếp vào chi riêng Rhizodium

Trên môi trường ñặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy,

vô màu Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di ñộng nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên

bất ñộng kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [3], [8]

Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng

ñược ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm

ña số chúng thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5, bị cản trở khi pH= 4,5 – 5,0 hoặc lớn

hơn 8.0 nhiệt ñộ thích hợp 24 – 26oC, ở 37oC sự phát triển của chúng bị cản trở

[6], [7]

Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ ñậu thông qua lông hút, ñôi khi

thông qua vết thương ở vỏ rễ Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi

khuẩn nốt sần cần ñạt tới 104 tế bào/gam ñất Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ

tiết ra enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo ñiều kiện cho vi

khuẩn xâm nhập vào rễ Hằng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ

ñậu có thể làm giàu cho ñất khoảng 50 – 600 kg nitơ/ha [3]

1.4.1.2 Vi sinh vật cố ñịnh ñạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ ñậu

Ngoài những loại cây thuộc bộ ñậu thì những loài cây không thuộc bộ ñậu

cũng có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vật thuộc ngành hạt trần:

Bowenia, Cycas một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria, Ngoài ra một

số thực vật còn có khả năng tạo nốt sần trên lá

Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn

thuộc chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn

căn hay mycorhiza ) cũng có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử, tạo nốt sần Có

nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà ñất thông Pinus radiala

ở Mỹ hằng năm làm giàu thêm khoảng 50 kg nitơ/ha [3]

Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố ñịnh nitơ

cộng sinh Rhizobium ñể sản xuất chế phẩm Nitragin ñể xử lý hạt giống ñậu trước

khi gieo Vi khuẩn sẽ ñược nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau ñó hấp phụ vào chất mang là ñất, than bùn ñể bảo quản và sử dụng

1.4.2 Nhóm Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do

1.4.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do kỵ khí Clostridium

Clostridium ñược phát hiện lần ñầu tiên bởi Vinogradxki (1893) Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể ñứng riêng

rẽ hoặc kẹp ñôi thành chuỗi ngắn Khi còn non có khả năng di ñộng, khi già mất khả năng di ñộng, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ cao và khô hạn [5]

Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử như:

Cl pasteurianum, Cl butylicum nhưng loài có khả năng cố ñịnh ñạm cao nhất

là Clostridium pasteurianum Chúng có khả năng cố ñịnh ñược 5 – 10 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g carbon Phạm vi hoạt ñộng cố ñịnh nitơ của Clostridium trong

khoảng pH khá rộng 4,7 – 8,5, tối thích là 6,9 – 7,3

1.4.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do hiếu khí

Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp

1.4.2.2.1 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp

Beijerinskia sp là loài vi khuẩn hiếu khí cố ñịnh nitơ rất giống với Azotobacter sp Chúng ñược phân lập bởi R J Starkey (1939), tế bào có hình

dạng thay ñổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski là vi khuẩn gram

âm, không sinh bào tử và bào xác, ñặc ñiểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là chịu chua cao Có khả năng sống tốt trong môi trường acid (pH=3), và nhiệt ñộ

từ 16 – 37OC

Trên môi trường vô ñạm, sau 3 ngày nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc nhầy Lồi

Vi khuẩn có khả năng cố ñịnh ñược 16 – 20 mg nitơ khi ñồng hóa hết 1g dinh dưỡng carbon Ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng

1.4.2.2.2 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp

Azotobacter sp ñuợc phân lập lần ñầu tiên vào năm 1901 (M Beijerinck)

Chúng thuộc vi khuẩn hiếu khí nhưng chúng có thể phát triển trong ñiều kiện kỵ

khí Hầu hết các loài Azotobacter sp ñều sống dị dưỡng

Azotobacter sp là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố ñịnh

nitơ tự do Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 µm, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu ñược bao bọc bởi một lớp nhầy

Trong môi trường không chứa nitơ, Khuẩn lạc của Azotobacter sp có dạng

cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo Khi nuôi cấy trong môi trường ñặc Khuẩn lạc có màu hồng hoặc nâu ñen, sinh sắc tố hình quang màu vàng lục hoặc lam lục, sắc tố khuếch tán vào môi trường [5], [16]

Azotbacter sp rất nhạy cảm với ñộ ẩm của ñất và hàm lượng của các nguyên

tố khoáng có trong ñất (P, K, MO, B, Cu )

Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter sp có thể phát triển ñươc trên môi

trường có pH trong khoảng 4,5 – 9 quá trình cố ñịnh nitơ chỉ ñược thực hiện trong khoảng pH 5,5 – 7,2 Nhiệt ñộ thích hợp nhất từ 26 – 30oC [6], [7]

Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả năng cố ñịnh 10 – 15 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố ñịnh tới

30 mg/1 g dinh dưỡng Carbon

Trong ñất, Azotobacter sp tập trung ở vùng ñất xung quanh rễ cây Ngoài khả

năng cung cấp dinh dưỡng nitơ cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm,

kích thích sinh trưởngTrong ñất, Azotobacter sp thường phổ biến các chủng sau:

+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả

năng di ñộng khi còn non Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu hoặc ñen khi về già, không khuếch tán ra môi trường [24], [25]

+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 µm Không có khả

năng di ñộng và hình thành nang xác Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy

+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng

di ñộng và hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [19], [26]

+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm, có khả năng di

ñộng, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [2]

1.4.3 Nhóm vi khuẩn lam

Năm 1928, Drewes (Đức) lần ñầu tiên chứng minh một cách xác ñáng khả năng cố ñịnh nitơ của ba loại khuẩn lam và ñã phân lập chúng một cách thuần khiết

Đa số các loài khuẩn lam có khả năng cố ñịnh nitơ sống tự do trong ñất, trong nước nhưng cũng có một số sống cộng sinh trong thực vật

Đây là vi sinh vật hiếu khí, chúng thích hợp phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm Nhiệt ñộ thích hợp từ 28 – 30oC Chúng có khả năng cung cấp cho ñất khoảng 50 kg nitơ/ha/năm [2]

Ngoài các nhóm vi sinh vật cố ñịnh nitơ chủ yếu nói trên người ta còn thấy nhiều vi sinh vật thuộc nhóm khác cũng có khả năng ñồng hóa nitơ như: Tảo

xanh Lục, một số ñại diện của nấm men và nấm mốc (Saccharomyces

apiculatus, Oidium Lactic )

Có thể nói vi sinh vật ñóng vai trò hết sức quan trọng ñối với nông nghiệp trong việc cung cấp ñạm sinh học cho ñất Vấn ñề ñặt ra cho các nhà khoa học hiện nay là nghiên cứu phương pháp nuôi cấy hiệu quả nhất ñể tăng sinh khối tế bào Từ ñó ứng dụng vào nông nghiệp, hướng ñến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái vững bền trong cả nước nói chung và ở tỉnh Tây Nguyên nói riêng

1.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc

Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho ñất và hạt giống,

cây con ñã ñược chứng minh trên các thí nghiệm ñồng ruộng Theo nghiên cứu

của Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của

hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mỳ, ngô tăng 10 – 15 % so với ñối chứng [27], [28] Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ,

Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho

cây trồng từ 30 – 60 kg nitơ /ha/năm và tổng lượng nitơ do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể ñạt ñến 240 triệu tấn/năm Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do

Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin, IAA kích thích

tăng trưởng cây trồng

Theo Subba Rao (1988) công bố Ấn Độ tiến hành bón chế phẩm

Azotobacter cho lúa mì 3 lần trong năm:

Bagyaraj và Menger (1978) ñã nghiên cứu tương tác giữa Azotobacter

chroococcum và các vi sinh vật vùng rễ và sinh trưởng của cà chua Kết quả cho

thấy cà chua ñược ủ với chủng cố ñịnh nitơ Azotobacter sẽ tăng sinh khối khô

của cà chua lên 65 % so với ñối chứng Fulchieri (1994) nghiên cứu sử dụng 3

chủng Azospirillum ñể xử lý hạt cho ngô Kết quả cho thấy ñã làm chiều cao cây,

tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59 % so với ñối chứng [16]

Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp

Azotobacter sp với các chủng phân giải photpho như Aspergillus niger sẽ làm

tăng năng suất lúa mì tăng 17,7 %, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9 % [20] Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp., Pseudomonas sp Thí nghiệm làm

tăng năng suất lúa, bông vải lên 10 – 20 % [21]

El–Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố ñịnh nitơ

Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho

thấy hàm lượng nitơ trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37 – 53 %; hàm lượng photpho trong thân tăng 48,6 %; hàm lượng kali tăng

10 – 14,3 % so với ñối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử

lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý ñơn chủng [18]

Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A lipoferum cho ngô Kết quả

cho thấy khi sử dụng chủng này ñã làm giảm 50 % lượng nitơ cho cây mà năng suất vẫn ñảm bảo

1.6 Nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần ñây Việt Nam có khá

nhiều nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học [5]

Phạm Bích Hiên và cộng sự (2003) ñã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của

Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt ñộ thích hợp của các chủng này là 25 – 30oC, pH thích nghi rộng từ 5,5 – 8,0 [8]

Phạm Ngọc Lan (1999) ñã phân lập ñược 37 chủng Azotobacter trên ñất gò

ñồi vùng Thừa Thiên- Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn ñược hai chủng

có khả năng kháng sinh, tồn tại ñược ở pH kiềm (pH=8) Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm ñã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng nitơ trong lá cũng cao hơn so với ñối chứng [12]

Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố ñịnh

nitơ tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter,

Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh

trưởng chiều cao mạ 7,47 – 16,93 %, và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85 % [2]

Vũ Thúy Nga và Nguyễn Ngọc Quyên (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng

hợp IAA và phân giải phosphate khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium Kết quả

cho thấy nhiều chủng có khả năng tổng hợp 20 – 100 microgam/ml môi trường nuôi cấy [13]

Lâm Minh Tú và Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón ñơn chủng, ña chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là

Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 – 300 % so với

ñối chứng [17]

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm ñược 20 % phân bón

vô cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với ñối chứng 15 – 50 %,

cà chua tăng 12 – 34 %, lạc tăng 30 % và giảm ñáng kể bệnh héo xanh [16] Nguyễn Ngọc Dũng và Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố ñịnh nitơ trong rễ lúa ñến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả ñã phân lập ñược 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có ñặc

ñiểm của chi Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và ra rễ của

lúa CR 203 [5]

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để ñạt ñược mục tiêu của ñề tài cần tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: + Phân lập, mô tả một số ñặc ñiểm sinh học và ñịnh danh các chủng vi khuẩn

+ Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp

+ Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp

+ Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp

2.2 Đối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp ñược phân lập ở loại

ñất bazan nâu ñỏ tại Tp Buôn Ma Thuột và huyện Krông Ana, ñất xám tại

Huyện Ea Kar và huyện Buôn Đôn thuộc ñịa bàn tỉnh Đăk Lăk

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu

Thí nghiệm ñược thực hiện tại:

- Bộ môn Sinh học thực vật, Khoa Nông Lâm Nghiệp, trường Đại Học Tây Nguyên

- Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học & Môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên

- Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 09/2010 tới tháng 09/2011

2.2.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

- Các hóa chất: K2HPO4, K2SO4, MgSO4.7H2O, NaCl, K2SO4, CaSO4.2H2O CaCO3, Na2MoO4, FeCl3 Agar, Glucose là các hóa chất tinh khiết

- Thiết bị nghiên cứu:

+ Đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, que cấy, …

+ Box cấy vô trùng,

+ Máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản)

2.3.1.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Phương pháp thu mẫu: mẫu ñất ñược lấy cách bề mặt ñất khoảng 5cm bằng dụng cụ và túi ñựng vô trùng, khoảng 100 g ñất/1 mẫu Mỗi loại hình ñất nghiên cứu ñược thu tại ba ñịa ñiểm khác nhau mỗi ñịa ñiểm thu 10 mẫu ñất ở 10 vị trí khác nhau, ñồng nhất mẫu ñể có một mẫu ñất cần phân tích Mẫu thu cần phân lập ngay hoặc bảo quản ở nhiệt ñộ 8oC

2.3.1.2 Phương pháp pha loãng dung dịch

- Cân 10 g mẫu ñất cho vào 90 ml nước cất vô trùng

- Chuẩn bị năm ống nghiệm ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5

- Ống 1: chứa 10 ml nước cất vô trùng, 4 ống còn lại chứa 9 ml nước cất vô trùng

- Dùng Micropipet hút 1ml dung dịch từ bình tam giác ñã hòa 10g ñất cho vào ống 1 lắc ñều Sau ñó hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, lắc ñều Cứ tiếp tục ñến ống 5 như vậy chúng ta tiến hành pha loãng dung dịch ở các nồng ñộ: 10-2,

10-3, 10-4, 10-5, 10-6

2.3.1.3 Môi trường phân lập Ashby

Thành phần môi trường Ashby:

Môi trường thạch Ashby ñược hấp khử trùng ở 1atm trong thời gian 30 phút Sau ñó, phân phối môi trường vào các ñĩa petri

Khi môi trường ñông ñặc và nguội dùng micropipet hút 100 µl dung dịch ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau cho vào ñĩa (3 ñĩa/1 nồng ñộ pha loãng) Dùng que gạt thủy tinh dàn ñều trên ñĩa thạch

Gói các ñĩa ñã cấy và ñặt vào tủ ấm ở nhiệt ñộ 30oC sau 3 – 7 ngày quan sát khuẩn lạc, mô tả và chụp hình

2.3.1.4 Bảo quản và giữ giống thí nghiệm

Sau khi thu ñúng khuẩn lạc theo tài liệu mô tả, chọn các khuẩn lạc ñơn, cấy dòng thuần từ 4 – 5 lần, sau ñó cấy vào ống thạch nghiêng, ñặt vào tủ ấm ở nhiệt

ñộ 30oC.

Sau 4 – 5 ngày làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi ñể xác ñịnh ñúng ñối tượng nghiên cứu

Các ống giống cho vào tủ lạnh, bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC Cấy truyền ñịnh

kì sau 1 – 2 tháng ñể giữ giống

2.3.1.5 Phương pháp chuẩn bị giống thí nghiệm

Trước khi tiến hành mỗi thí nghiệm chuẩn bị 2 ống nghiệm có chứa 5 ml

môi trường Ashby lỏng, dùng que cấy lấy vi khuẩn Azotobacter sp từ các ống

giống, hòa tan vào 2 ống nghiệm Lắc ñều 2 ống nghiệm bằng tay, hoặc lắc trên máy lắc ủ ấm ở nhiệt ñộ 30oC trong tủ ấm

Sau 24 giờ, dùng giống từ 2 ống nghiệm này ñể tiến hành các thí nghiệm

tiếp theo trong nội dung nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp mô tả một số ñặc ñiểm sinh học

Sau khi nuôi cấy 4 ngày tiến hành quan sát khuẩn lạc ñơn dưới kính lúp ñiện ở ñộ phóng ñại 4 x 10 ñể xác ñịnh hình dạng, cấu trúc, và bề mặt cắt ngang của khuẩn lạc và chụp hình khuẩn lạc ở ñộ phóng ñại trên Làm tiêu bản ñể quan sát tế bào và chụp hình tế bào ở ñộ phóng ñại 100 x 10

2.3.3 Phương pháp ñịnh danh các chủng vi khuẩn ñược tuyển chọn bằng kỹ

Mồi (pimer) Trình tự mồi Kích thước gene

400bp

+ Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận DNA tổng số

Để tách chiết tế bào thu nhận DNA tổng số, sử dụng phương pháp tủa trong phenol/chloroform mô phỏng theo phương pháp của Chomczynski và Sacchi (1987) cho tách chiết mẫu Quy trình tách chiết ñã ñược thương mại hóa

và cung cấp từ Công ty CP Công nghệ Việt Á – Tp Hồ Chí Minh, quy trình bao

gồm các bước sau:

- Hút 100 µl sinh khối tế bào cho vào các eppendorf vô trùng có chứa sẵn

900 µl dung dịch 1 Vortex 30 giây, ñể yên 10 phút Thêm 200 µl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn ñều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Cẩn thận hút 600 µl dịch trong nổi có chứa DNA (tránh làm xáo trộn hai lớp) và một eppendorf khác có chứa sẵn 600 µl dung dịch 3 (trộn ñều trước khi

sử dụng) Trộn ñều hỗn hợp, ñể yên 10 phút ở nhiệt ñộ lạnh, sau ñó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ có cặn nằm dưới ñáy eppendorf Cẩn thận loại

bỏ dịch nổi, thu cặn Cho từ từ 900 µl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

- Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn Để khô ở nhiệt ñộ 60°C trong 10 phút Sau ñó, thêm vào 50 µl dung dịch 5

Nếu chưa ñặt phản ứng PCR, bảo quản mẫu tách chiết ở -20°C

+ Phản ứng PCR

- Thành phần cho một phản ứng 25 µl bao gồm:

2.5 µl dung dịch ñệm (buffer) 10X; 0,625 unit Taq DNA polymerase; 2,0

mM/L MgCl2; 200 µM/L dNTPs; Mồi xuôi và mồi ngược: mỗi mồi 500 nM/L;

5 µl dịch DNA Thêm nước cất hai lần cho ñủ 25 µl

- Cài ñặt chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR:

- Pha hóa chất và chuẩn bị gel agarose:

Pha dịch nạp mẫu

Thành phần của dịch nạp mẫu như sau: 600 µl glycerol + 0,25 % xylene cyanol ff, thêm dung dịch TAE 1X cho ñủ 1000 µl

Kỹ thuật rót gel agarose 2 %

Cân 2 g agarose, thêm 100 ml TAE 1X, ñun cho tan hoàn toàn, ñể nguội

60oC, rót vào giá nằm ngang có lắp sẵn lược, chờ gel ñông, ñặt vào bồn ñiện di

có chứa dung dịch TAE 1X, rút lược khỏi gel

- Kỹ thuật ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR

Thành phần ñiện di bao gồm 7 µl sản phẩm PCR hoặc chứng dương, chứng âm và 3 µl dịch nạp mẫu, thang 100 bp Cho hỗn hợp này vào các giếng trên gel agarose 1 % Điện di ở ñiện thế 50 V trong 5 phút Sau ñó tăng lên 80 V

trong 30 phút Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X có ethidium bromide trong

15 phút

Quan sát kết quả ñiện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc XR có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad) Kích thước các sản phẩm PCR ñược ghi nhận thông qua chứng dương, chứng âm và so sánh với thang chuẩn 100 bp

2.3.4 Tuyển chọn chủng Azotobacter sp có hoạt tính sinh học

2.3.4.1 Tuyển chọn một số chủng Azotobacter sp có hoạt tính cố ñịnh nitơ

cao bằng phương pháp Kjeldahl [6]

a Mục ñích

Xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số trong dịch nuôi cấy vi khuẩn phân lập ñã ñịnh danh Từ ñó, làm cơ sở ñể chọn lọc những chủng vi khuẩn có khả năng cố ñịnh ñạm cao trong số các chủng phân lập ñể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

có trong mẫu nguyên liệu

c Thực hiện

Quá trình này gồm 3 giai ñoạn:

Giai ñoạn 1: Vô cơ hóa mẫu

Nguyên tắc: tất cả các chất ñạm có trong nguyên liệu dù nằm ở dạng nào

(hữu cơ, vô cơ, protein) chuyển thành hợp chất vô cơ (NH4)2SO4 bằng cách ñun sôi với H2SO4 ñậm ñặc và chất xúc tác

(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

Cách tiến hành: hút 10 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào bình Kjeldahl

Thêm vào khoảng 200 mg chất xúc tác K2SO4/CuSO4 (tỉ lệ 3:1) và 10 ml H2SO4ñậm ñặc Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí ñộc cho ñến khi dung dịch có màu xanh da trời nhạt và trong suốt Để nguội và pha loãng thành 100 ml với nước cất vô ñạm

Thực hiện hai lần thử không (dịch môi trường không có VK) và ba lần thử thật với dịch khuẩn

Đặt bình tam giác f có chứa 10 ml dung dịch H2SO4 0,01 N và hai giọt

thuốc thử hỗn hợp rồi ñặt vào vòi ống sinh hàn d, sao cho ñầu nhọn ống sinh hàn

nhúng chìm trong dung dịch Hút 10 ml dung dịch ñạm vô cơ hóa ñã pha loãng

trên cho vào phễu e của máy cất ñạm, mở khóa cho vào bình c từ từ cho ñến khi hết, tráng phễu e ba lần, mỗi lần với một ít nước cất rồi cũng cho xuống bình c

Chất ñạm

H2SO4 ñậm ñặc

Xúc tác, t0

(NH4)2SO4

Cho 10 ml dung dịch NaOH 30 % và cũng cho xuống bình c từ từ, tráng một ít

nước cất (mỗi lần cần chừa lại một ít ñể hệ thống kín) Để máy lôi cuốn trong vòng ba phút rồi hạ bình tam giác xuống, ñể thêm hai phút nữa Rửa vòi bằng một tia nước cất (nước rửa cho vào bình tam giác) Rồi lấy bình tam giác ra, ñịnh phân với dung dịch NaOH có chuẩn ñộ ñúng là x.0,01 N cho ñến khi có màu vàng cam

Thực hiện ba mẫu thử thật, ba mẫu thử không ñể lấy trị số trung bình Phải xác ñịnh hệ số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH 0,01 N bằng dung dịch H2SO40,01 N

Giai ñoạn 3: Chuẩn ñộ và tính toán kết quả

Lượng H2SO4 N/100 còn thừa ñược chuẩn ñộ bằng dung dịch NaOH N/100 Quá trình chuẩn ñộ kết thúc khi dung dịch chuyển từ tím ñỏ sang vàng cam (hình 3.2)

Hình 2.2 Sự chuyển màu của dung dịch chuẩn ñộ từ tím ñỏ sang vàng cam

Tính toán kết quả

Trước khi chuẩn ñộ

Sau khi chuẩn ñộ

Gọi Vo là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không)

Gọi V1 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật)

Vậy ∆V = Vo - V1 là lượng NaOH tương ñương với lượng ñạm ammoniac phóng thích bởi 10 ml dung dịch vô cơ pha loãng

X là hệ số hiệu chỉnh

X= VNaOH 0.01N/VH2SO4 0.01N

1 mol ammoniac tương ñương với 1 mol NaOH

Do ñó số mol ammoniac phóng thích bởi 10 ml dịch vô cơ hóa ñã pha loãng là:

Số g ñạm tổng số có trong 10 ml dịch vô cơ ñã pha loãng là:

Số gam ñạm tổng số có trong 100 ml dung dịch vô cơ hóa ñã pha loãng hay trong 10 ml nguyên liệu:

Số gam ñạm tổng có trong một lít nguyên liệu:

2.3.4.2 Xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter sp bằng

phương pháp so màu Salkowski

Để xác ñịnh hàm lượng IAA sinh ra bởi các chủng vi khuẩn Aztobacter sp

thu thập ñược chúng tôi tiến hành dựng ñường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ

số OD530nm và nồng ñộ IAA

Thực hiện nuôi cấy các chủng Azotobacter sp cố ñịnh ñạm cao trên môi

trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên

Chuẩn bị môi trường lỏng trong các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng

10ml dịch môi trường, hấp khử trùng, ñể nguội Tiến hành cấy các chủng

Azotobacter sp ñược tuyển chọn vào các ống nghiệm chứa môi trường ñã khử

trùng Nuôi ở nhiệt ñộ 30oC, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 4 ngày Thu dịch nuôi cấy và ly tâm 5500 vòng/phút lấy dịch trong ñể ño lượng IAA ñược vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

* Phương pháp xác ñịnh phương trình ñường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng ñộ IAA

- Chuẩn bị dung dịch ñệm phosphat (200 ml)

A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất

B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất

Rót 39 ml A + 61 ml B cho thêm nước cất vừa ñủ 200 ml, ñiều chỉnh pH = 7

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Rót 553 ml H2SO4 (98 %) cho vào nước cất ñủ 1 lít, ñể nguội sau 12 giờ ñược dung dịch H2SO4 ñậm ñặc 10,8 M

Cân 4,5 g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8 M ñã pha ở trên ñể ñược thuốc thử Salkowski

- Chuẩn bị ñường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch ñệm phosphat ñược nồng ñộ là 160 mg/l Sau ñó tiến hành pha loãng ra các nồng ñộ 0, 5,10, 16,

Rót 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng ñộ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng ñộ lặp lại 3 lần

Ủ 10 phút ở nhiệt ñộ phòng ñể phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau ñó tiến hành ño OD ở bước sóng 530 nm

Từ kết quả trên, chúng tôi xác ñịnh ñược phương trình ñường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm Dựa vào phương trình ñường chuẩn ñể xác ñịnh nồng ñộ IAA (mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy

Bảng 2.1 Nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn

Từ giá trị OD530nm ño ñược trên chúng tôi xây dựng ñường chuẩn sau:

Dựa vào biểu ñồ 1.1 có phương trình ñường chuẩn là: y = 0,0205x + 0,0382

2.3.5 Phương pháp ñánh giá hiệu quả của việc xử lý các chủng vi khuẩn

Azotobacter sp tuyển chọn ñến sinh trưởng cây cải ngọt

2.3.5.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố ñịnh nitơ Azotobacter sp ñến

sinh trưởng của cây cải ngọt

Thí nghiệm có 6 công thức, gồm 4 chủng ñược tuyển chọn, 1 chủng D6 (Viện công nghệ sinh học Việt Nam) làm ñối chứng 2 và 1 công thức không xử

lý chủng làm ñối chứng 1 Mỗi công thức gồm 3 khay (3 lần lặp lại) Hạt giống

cải sau khi xử lý chủng Azotobacter sp sẽ ñược gieo Qui trình chăm sóc theo

hướng dẫn canh tác rau thông thường

Các chỉ tiêu theo dõi số lá/cây, chiều cao cây, khối lượng rễ, trọng lượng tươi, sau 25 ngày gieo trồng

2.3.5.2 Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn

Azotobacter sp ñến sinh trưởng của rau cải ngọt

Nồng ñộ IAA(mg/l)

a) Phương pháp ñếm khuẩn lạc

+ Azotobacter sp sau 4 ngày nuôi cấy ñếm lượng khuẩn lạc của vi khuẩn

- Đếm số lượng tế bào (CFU/ml) theo Trần Linh Thước (2001) [11] Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên ñĩa sau khi ủ Chọn các ñĩa có số ñếm từ

25 – 250 ñể tính kết quả Mật ñộ vi khuẩn cố ñịnh Nitơ ñược tính theo công thức:

A (CFU/ml) =

Trong ñó: A: số tế bào (ñơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu

N: tổng số khuẩn lạc ñếm trên các ñĩa ñã chọn

ni: số lượng ñĩa cấy tại ñộ pha loãng i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi ñĩa

b) Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm ñược thực hiện trong chậu Tưới sinh khối tế bào Azotobacter sp tuyển chọn với nồng ñộ 5.105, 1.106, 5.106, 1.107, 5.107 CFU/ml lên các khay cải, tần suất tưới 2 ngày một lần

Thí nghiệm gồm 6 lô: 01 lô ñối chứng không nhiễm Azotobacter sp.; 5 lô thực nghiệm có xử lý nhiễm Azotobacter sp., thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần, mỗi

lần lặp 3 khay

Các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng của cây cải sau 25 ngày tuổi: số lá/cây, chiều cao cây, diện tích lá, khối lượng rễ, khối lượng tươi Các chỉ tiêu ñược ño ñếm theo phương pháp thông thường

2.3.6 Xây dựng qui trình nuôi cấy chủng Azotobacter sp có hoạt tính cố

ñịnh nitơ cao

2.3.6.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon ñến sinh trưởng của

Azotobacter sp

a) Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon

Thành phần môi trường dựa trên môi trường Ashby có cải tiến Các nguồn carbon sử dụng là glucose, saccharose và tinh bột

N

n1Vf1 + … + niVfi

Tiến hành tăng sinh các chủng Azotobacter sp chọn lọc trên môi trường

Ashby thay thế nguồn carbon chính của môi trường bằng các nguồn carbon sau: glucose, saccharose, tinh bột ở pH = 7 trên máy lắc xoay 150 vòng/phút Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số (mục 2.3.4.1) Từ ñó, chọn ra ñược nguồn carbon thích hợp nhất cho sự cố ñịnh nitơ của chủng vi

khuẩn ñã tuyển chọn

b) Ảnh hưởng của nồng ñộ dinh dưỡng carbon

Tăng sinh các chủng chọn lọc Azotobacter sp trên môi trường Ashby chứa

nguồn carbon thích hợp nhất vừa ñược xác ñịnh, với nồng ñộ các nguồn carbon khác nhau: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 % ở pH = 7 trên máy lắc xoay 150 vòng/phút Sau 4 ngày nuôi cấy tiến hành xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số (mục 2.3.4.1)

Từ ñó, chọn ra ñược nồng ñộ carbon thích hợp nhất cho sự cố ñịnh nitơ của chủng tuyển chọn

2.3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp có

hoạt tính cố ñịnh nitơ cao

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sinh khối Azotobacter sp tiến hành tăng sinh các chủng Azotobacter sp chọn lọc trên môi trường Ashby chứa

nguồn carbon và nồng ñộ carbon thích hợp nhất ñối với các chủng ñã chọn lọc ở các nhiệt ñộ khác nhau: 30oC, 35oC ,40oC trên máy lắc xoay 150 vòng/phút Sau

4 ngày nuôi cấy tiến hành xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số ( mục 2.3.4.1) Từ

ñó, chọn ra ñược giá trị nhiệt ñộ thích hợp nhất cho sự cố ñịnh nitơ của chủng

tuyển chọn

2.3.6.3 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp có hoạt

tính cố ñịnh nitơ cao

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH ñến sinh khối Azotobacter sp tiến hành

tăng sinh các chủng Azotobacter sp chọn lọc trên môi trường Ashby chứa nguồn

carbon, nồng ñộ carbon và nhiệt ñộ thích hợp nhất ñối với các chủng ñã chọn lọc

ở các pH khác nhau: 6, 7, 8, 9 trên máy lắc xoay 150 vòng/phút Sau 4 ngày nuôi

cấy tiến hành xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số (mục 2.3.4.1) Từ ñó, chọn ra ñược giá trị pH thích hợp nhất cho sự cố ñịnh nitơ của chủng tuyển chọn

2.3.6.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối Azotobacter sp có

hoạt tính cố ñịnh nitơ cao

Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sự sinh sinh khối

Azotobacter sp tiến hành tăng sinh các chủng chọn lọc trên môi trường Ashby

chứa nguồn carbon, nồng ñộ carbon, nhiệt ñộ và pH thích hợp nhất ñối với các chủng vi khuẩn ở các thời gian nuôi cấy khác nhau: 2, 3, 4, 5 ngày trên máy lắc xoay 150 vòng/phút Sau 4 ngày nuôi cấy tiến hành xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng số (mục 2.3.4.1.) Từ ñó, chọn ra ñược thời gian nuôi cấy thích hợp nhất cho sự cố ñịnh nitơ của chủng tuyển chọn

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Số liệu ñược phân tích thống kê theo phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan Các số liệu ñược phân tích ANOVA và ñược trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05 và 0,01

Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật ñộ quang

OD ñược xử lý trên phần mềm EXCEL 2007 của Microsoft, các biểu ñồ khác cũng ñược xử lý trên phần mềm này

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu phân lập, mô tả và ñịnh danh một số chủng vi khuẩn cố

ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp trên một số loại ñất ở Đăk Lăk

3.1.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn cố ñịnh N trên một số loại ñất ở Đăk Lăk

Sau khi phân lập và làm thuần, thu ñược 24 chủng vi khuẩn phát triển

trên môi trường Ashby có ñặc ñiểm khuẩn lạc giống với chủng Azotobacter sp

trong các tài liệu mô tả: khuẩn lạc tròn, lồi, có màng bao nhầy và bóng, khi già khuẩn lạc sinh sắc tố vàng, ñen (hình ảnh 24 chủng vi khuẩn phân lập ở phần mục lục 1 hình 1.1) Các chủng vi khuẩn này ñược ký hiệu theo Bảng 3.1

Bảng 3.1 Ký hiệu, ñịa ñiểm phân lập các chủng VK trên môi trường Ashby

Hai mươi bốn chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trên môi trường Ashby vô ñạm, trong ñó có 10 chủng trên ñất bazan nâu ñỏ thuộc Tp Buôn Ma Thuột và huyện Krông Ana, 14 chủng ñược phân lập từ ñất xám thuộc ñịa bàn huyện Ea Kar và huyện Buôn Đôn tỉnh Đăk Lăk

3.1.2 Kết quả mô tả một số ñặc ñiểm sinh học các chủng vi khuẩn phân lập

Quan sát một số ñặc ñiểm sinh học của các chủng vi khẩn phân lập dưới kính hiển vi, kết quả mô tả ñược ghi nhận ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn phân lập

Vòng sử dụng CaCO3

ñều

Bóng nhẵn

Trắng trong

Tròn không ñều

Bóng nhẵn, nhày

Tròn không ñều

Bóng nhẵn, nhày