nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố buôn ma thuột

Để lựa chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh có thể tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên, gây ñột biến các chủng ñã ñược lựa chọn hoặc cấy chuyển gen ñể nâng cao kh

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Chitinase là enzyme thủy phân chitin, có vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm từ chitin như N-acetyl-D-glucosamine, Oligo N-acetyl-D- glucosamine, glucosamine Oligo N-acetyl-D-glucosamine ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu quan trọng trong y học, là nguyên liệu ñiều chế một số dược phẩm quý chữa trị các bệnh: viêm khớp, bệnh viêm phổi, viêm sưng dạ dày, chống nhiễm trùng … Ngoài ra, Oligo N-acetyl-D- glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn Chính vì vậy, nghiên cứu về chitinase là vấn ñề ñã và ñang ñược quan tâm nhiều của các nhà khoa học từ trước ñến nay

Enzyme chitinase có thể ñược tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như ñộng vật, thực vật và vi sinh vật Quy trình thu nhận chitinase từ ñộng vật, thực vật khá phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hóa, giá thành chế phẩm cao và cũng không thể ñáp ứng nhu cầu thực tế Trong khi ñó vi sinh vật có thể nói là nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme chitinase

Đặc biệt cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền vững thì các loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học ñang ñược ñề cao nghiên cứu và phát triển Những nhóm vi sinh vật có khả năng tạo chitinase rất ñược quan tâm Chúng vừa có khả năng phân giải nguồn chitin tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho cây trồng; vừa có tính ñối kháng với các loài nấm gây bệnh cây trồng, gây mục gỗ, nhờ hoạt chất kháng sinh và ñặc biệt là hệ enzyme thủy phân, trong ñó có chitinase

Như vậy, việc nghiên cứu các ñối tượng vi sinh vật có khả năng tạo chitinase có hoạt tính cao là một bước ñi hữu ích trong nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chitinase trong ñời sống Trên cơ sở ñó, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu ñề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”

2 Mục tiêu ñề tài

1 Tuyển chọn ñược các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase cao

2 Xác ñịnh các yếu tố ảnh hưởng ñến việc sản sinh và hoạt tính enzyme chitinase từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học

+ Khai thác và bảo tồn nguồn gen quí của một nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải chitin, hợp chất phức tạp thành những chất ñơn giản, dễ sử dụng cho các ñối tượng sinh vật hay phục vụ nghiên cứu khoa học

- Ý nghĩa thực tiễn

+ Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các chủng xạ khuẩn trên hệ

thống canh tác ở Đắk Lắk

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Enzyme vi sinh vật

Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, ñảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc ñộ nhịp nhàng cân ñối, theo những hướng xác ñịnh Như vậy, enzyme ñảm bảo cho sự trao ñổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo ñảm ñiều kiện tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống

Enzyme có trong tất cả các cơ thể ñộng vật, thực vật và vi sinh vật Sau khi ñược tổng hợp enzyme có thể ñược tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường ñược gọi là enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) hoặc giữ lại bên trong tế bào gọi là enzyme nội bào (intracellular enzyme) Sự phân bố enzyme không ñồng ñều giữa các loài, các tế bào mô và cơ quan khác nhau

Trong các nguồn nguyên liệu ñể tách enzyme, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất ñể sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp Dùng vi sinh vật ñể thu nhận enzyme có những lợi ích chính như sau:

- Có thể chủ ñộng về nguồn nguyên liệu

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, khoảng 16 - 100 giờ Do ñó có thể thu hoạch hàng trăm lần trong một năm

- Điều khiển sự tổng hợp enzyme ñể tăng lượng enzyme ñược tổng hợp hoặc tổng hợp ñịnh hướng enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác

- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương ñối ñơn giản rẻ tiền Tuy nhiên, ñiều ñáng lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh ñộc tố,

vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp

Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật chịu sự tác ñộng của nhiều yếu

tố khác nhau, trong ñó ñặc ñiểm chủng giống có tính quyết ñịnh Ngoài ra, ñiều kiện môi trường, trước hết là thành phần môi trường nuôi cấy cũng có vai trò

ñáng kể

Để lựa chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh có thể tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên, gây ñột biến các chủng ñã ñược lựa chọn hoặc cấy chuyển gen ñể nâng cao khả năng thu nhận enzyme hoặc tổng hợp enzyme có ñịnh hướng

Môi trường dinh dưỡng phải ñảm bảo những nhu cầu tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme Trong môi trường cần có các chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như mangan, canxi, fotfo, lưu huỳnh, sắt, kali và một số chất khác [2], [16]

1.2 Đại cương về chitinase

Chitinase hay poly β-1,4 (2-acetamido-2-deoxy) - D - glucozid glucanohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 β-glucoside trong chitin Mã số của chitinase EC 3.2.1.14 [23] Chitinase thuộc lớp 3 tổ 2 nhóm 1 số thứ tự là 14

1.2.1 Phân loại chitinase

1.2.1.1 Phân loại theo phản ứng cắt

Chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm chính:

- Endochitinase (EC 3.2.1.14) là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các ñoạn oligosaccharide

- Exo chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm:

+ Chitobiosidase = chitobiase (EC 3.2.1.29) xúc tác sự tạo thành liên tục Diacetylchitibiose của sợi chitin

+ β-1,4-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.30) tiếp tục phân cắt các oligomer trên thành N-acetyl-D-glucosamine [24]

1.2.1.2 Phân loại theo cấu trúc phân tử

Chitinase ñược xếp vào hai họ Glycohydrolase:

- Họ Glycohydrolase 18

Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi ñược tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và Virus Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N- acetylglucosaminidase

Các chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 ñược tổng hợp từ Aeromonas

hydrophila, Bacillus circularis, Tricoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens…

Chitinase họ glycohdrolase 18 giữ nguyên cấu hình anomer tại vị trí phân cắt nhờ cơ chế nghịch chuyển ñôi Đến nay cấu trúc không gian ba chiều của một

vài enzyme thuộc họ này ñã ñược xác ñịnh như chitinase A của Serratia

marcescens, chitinase của Hevea brasiliensis, β-N-acetylglucosaminidase của Flavobacterium menigoseptium và Streptomyces plicatus Mặc dù ba protein này

ít tương ñồng với nhau về trình tự axit amin nhưng chúng ñều có cấu trúc xác ñịnh gồm 8 sợi xoắn α và β cuộn tròn

- Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có

ở các xạ khuẩn như Streptomyces griceus, vi khuẩn như Haemophilus

influenzae…

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV,… Chitnase thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu với các vòng α thông qua cơ chế nghịch chuyển cấu hình anomer tại vị trí phân cắt Đây là ñiểm khác biệt chính so với họ Glycohydrolase 18 [24]

1.2.1.3 Phân loại theo trình tự amino axit

Dựa vào trình tự ñầu amin, sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptit nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:

- Nhóm I: gồm những ñồng phân trong phân tử có ñầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu cacboxyl C (peptit nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt tính xúc tác Nhóm 1 còn có

thể chia thành 2 nhóm: Ia hoặc Ib tùy thuộc vào enzyme thuộc tính axit hay bazơ Chitinase có ở thực vật thường ñịnh vị ở vị trí không bào

- Nhóm II: gồm những ñồng phân trong phân tử chỉ có tâm xúc tác thiếu ñầu cystein ở ñầu N và peptit nhận biết ở ñầu C, có trình tự amino axit tương tự như trình tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có ở xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm, thực vật và chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài

- Nhóm III: có trình tự amino axit hoàn toàn khác với trình tự amino axit ở nhóm I và nhóm II

- Nhóm IV: gồm những ñồng phân chitinase, 41% - 47% trình tự amino axit có ở tâm xúc tác của chúng giống với trình tự chủ yếu có ở cây 2 lá mầm, amino axit ở nhóm I Phân tử cũng có ñoạn giàu cystein nhưng kích thước phân

tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase ở nhóm I

- Nhóm V: Dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự người ta nhận thấy vùng gắn với chitin (vùng giàu cystein) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa gặp ở thực vật bậc cao

1.2.2 Cấu trúc của chitinase

1.2.2.1 Cấu trúc phân tử

Nhiều enzyme phân cắt carbonhydrat ñược phát hiện có cấu trúc chia vùng tương tự nhau Blaak và cộng sự [21] tiến hành phân tích chitinase của thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và ñã xác ñịnh ñược những vùng riêng biệt trong cấu trúc của chitinase Các chitinase của thực vật như: cây thuốc lá, ñậu, củ cải ñường chỉ chứa duy nhất một trung tâm xúc tác Chitinase của nấm men bao gồm 4 vùng: trình tự báo hiệu, trung tâm xúc tác, vùng giàu serin/ threonin và trung tâm gắn chitin ở ñầu C Vùng giàu serin/ threonin hoạt tính như một chất nhận tham gia trong sự glycosyl hóa nguyên tử oxy

Bên cạnh ñó Wantanabe và cộng sự [20] ghi nhận loài Bacillus circulans

có chitinase A1 chứa tâm gắn chitin ở ñầu C, tâm xúc tác ở ñầu N và một vùng chức năng thứ ba là vùng fipronectin kiểu III, nếu loại bỏ vùng này thì không

ảnh hưởng ñến sự gắn kết enzyme và cơ chất nhưng khả năng xúc tác của enzyme thì bị giảm ñi

1.2.2.2 Cấu trúc không gian của chitinase

- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18

Tâm của chitinase thuộc họ này tạo thành từ 8 thùy tròn α và β Thùy số 8 cuộn vào bên trong cấu hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngoài

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc không gian của chitinase ở

cây cao su Hevea brasiliensis

- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ này là phức hợp của cấu trúc bậc 2, bao gồm 10 ñoạn helical và 1 phiến β ba sợi Phân tích protein cho thấy có nhiều nhóm tương tác kỵ nước bảo vệ tâm protein của cấu trúc bậc 3 [24]

1.2.3 Cơ chế tác dụng của chitinase

Chitinase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết 1,4-β-glycozid trong phân tử chitin, phân cắt dọc theo mạch carbon và sản phẩm chủ yếu là chitibiose

và chitotriose Những chất này sau ñó lại tiếp tục bị phân cắt thành những monomer là các N -acetyl -D -glucosamine [29]

Quá trình phân cắt tóm tắt như sau:

Chitinase Chitobiase

Chitin -
chitobiose,chitotriose -
N-acetyl-D glucosamin

Có hai cơ chế cho sự thuỷ phân: cơ chế giữ lại cấu tử β anomer trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α

Ngoài ra ñể khảo sát sự phân cắt người ta sử dụng N-acetyl chitoolygosaccharide thường ñược thuỷ phân bên trong trên một vài vị trí xác ñịnh hoặc một cách ngẫu nhiên

1.2.4 Đặc tính cơ bản của hệ chitinase

- Khối lượng phân tử

Chitinase ñược tìm thấy ở thực vật bậc cao hoặc tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa Ở các loài thân mềm, ñộng vật có xương, trọng lượng phân tử của chitinase khoảng 40-90 kDa, hoặc cao hơn khoảng 120 kDa Trọng lượng phân tử của chitinase thu nhận từ xạ khuẩn và vi khuẩn có khoảng biến ñộng từ 30-120 kDa [24]

- Điểm ñẳng ñiện

Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo có giá trị ñiểm ñẳng ñiện pI thay ñổi từ 3,0-10,0 Ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá pI từ 4.7-9.3 và ở vi sinh vật từ 3,5-8,8 [29]

- Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ tối ưu cho hệ chitinase ở hầu hết vi sinh vật là 400C Ngoại trừ

Aspergilus niger có khả năng tổng hợp chitinase hoạt ñộng trên cơ chất

glycochitin có nhiệt ñộ tối ưu là 500C [29]

Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những giá trị nhiệt ñộ tối ưu khác nhau

- Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH tối ưu (pHopt) ở thực vật bậc cao và tảo ñạt giá trị từ 4-9 của các chitinase Hệ chitinase ở ñộng vật là 4,8 – 7,5; ở vi sinh vật là 3,5 – 8,0

pHopt của chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất ñược sử dụng Chitinase

ñã ñược nghiên cứu có pHopt khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin; pHopt của chitinase

khi cơ chất này là glycolchitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu Hoạt tính của

chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế bởi pH < 4,5 [24]

- Chất hoạt hóa và chất ức chế

+ Allosamidin

Allosamidin ức chế cạnh tranh với chitinase Chất này có cấu tạo tương tự

dạng trung gian của cơ chất, có vòng oxazoline Vòng này có thể ở giữa carbonyl

oxygen của nhóm N-acetyl và C1 của N-acetylglucosamine trong quá trình thủy phân

|

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất của allosamidin

(demethylallosamidin và dimethylallosamidin)

Allosamidin và những dẫn xuất của nó chỉ ức chế chitinase ñược tổng hợp

từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật như Piromyces communis, Streptomyces sp

và Streptomyces olivaceoviridis Gần ñây Allosamidin ñược phát hiện có khả

năng gắn kết và ức chế các chitinase thực vật (ña số thuộc họ Glycohydrolase

18) Allosamidin ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID50 (liều lượng 50% chất

ức chế) là 44.7µm

Chitinase ñược tạo ra bởi Streptomyces sp có khả năng tổng hợp hai loại

chitinase, một loại nhạy cảm Allosamidin và loại có tính ñề kháng Như vậy,

Allosamidin và dẫn xuất của nó chỉ ức chế các chitinase thuộc họ

Glycohydrolase 18, không ức chế các enzyme thuộc họ Glycohydrolase 19 [13]

+ Styloguanidin

Styloguanidin là chất ức chế chitinase ñược tách chế từ loài hải miên

Stylotella aurantium Tính ñặc hiệu, tính bền vững trong tự nhiên của những hợp

chất này vẫn chưa ñược biết rõ [24]

+ Các ion kim loại

Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế ñối với chitinase Các ion

Cu2+, có hai dạng chitinase, một bị ức chế và một ñược tăng cường nhờ Cu2+ñược tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật

+ Các chất khác

Dipeptit CI-4[cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên ñược tổng

hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208 CI-4 ức chế việc phân tách tế bào Sacchromyces cerevisiae Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 và có cấu

trúc giống chất trung gian phản ứng Chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh hưởng ñến chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng sốt rét

(Plasmodium falciparum) từ vật chủ ñến côn trùng

Argifin và argadin là 2-peptid ức chế glycosidehydrolase, có thể ức chế chitinase từ nồng ñộ nM - µM Các peptide này gắn trực tiếp lên các gốc ở tâm của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1, +2 Mặc dù những chất ức chế này là peptit nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như acetyl hay vòng thơm

Huyết thanh Allbumin, ngược lại có vai trò làm tăng hoạt ñộng của chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ ñầu của phản ứng

1.2.5 Nguồn thu nhận chitinase

Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật Đến nay ñã có nhiều nghiên cứu của các nha khoa học trên thế giới về chitinase ở vi sinh vật, thực vật, ñộng vật

- Vi sinh vật

Vi khuẩn sản sinh chitinase nhằm ñáp ứng nhu cầu dinh dưỡng Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase ñể có thể phân cắt ñược nhiều loại chitin ña dạng trong sinh giới

Chitinase ñược tìm thấy trong vi khuẩn như Chrombacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Aeromonas…

Các chủng nấm Trichoderma, Gliocladium, Calvatia…và ñặc biệt là các nấm lớn như Lycoperdon, Corinus… có hàm lượng chitinase cao

Chitinase của nấm có nhiều chức năng Tương tự như ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng ñóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác

là hoạt tính của chúng rất linh ñộng trong quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái của nấm Nguyên nhân, vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm

Chitinase của Trichoderma còn giữ vai trò quan trọng trong hoạt tính kí sinh của nấm nhằm ñối kháng lại các nấm gây hại ở thực vật

- Thực vật

Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật nhằm chống lại các nấm

kí sinh hoặc các loại côn trùng như chitinase tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm

Một số thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như như cao su (Heave

Brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hodeum vulgare), cà rốt (Dacus carota), hạt ñậu nành (Glycine max)…Một số loài tảo biển cũng là nguồn cung

cấp chitinase

- Động vật

Từ một số ñộng vật nguyên sinh hoặc từ các mô, các tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều ñộng vật không xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân ñốt có thể thu nhận ñược chitinase Đối với ñộng vật có xương sống chitinase ñược tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư,

bò sát ăn sâu bọ, từ dịch dạ dày của chim thú ăn sâu bọ

Ngoài ra chitinase còn ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch chiết biểu bì của các loài chân ñốt trong giai ñoạn thay vỏ, lột da Chitinase ñã giúp côn trùng tiêu hóa lớp vỏ ngoài trong giai ñoạn thay vỏ, lột da [24], [23], [27], [29]

1.2.6 Ứng dụng của chitinase

1.2.6.1 Trong nông nghiệp

Chitinase ức chế nấm bệnh côn trùng, chân ñốt bao gồm nhiều loại côn

trùng gây bệnh hại Nấm chứa chitin bị ức chế bởi chitinase bao gồm: Fusarium,

Gliocladium, Rhizotinia, Trichoderma, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium,

và Alternaria,… Côn trùng chứa chitin bị kìm hãm bởi chitinase bao gồm Epidoptera, Trichoplusia (sâu cải), Orthoptera bao gồm châu chấu, Hemiptera

bao gồm bọ xít ở lúa

Người ta có thể sử dụng chitinase như một tác nhân kiểm soát sinh học an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học Chtinase tinh sạch ñược thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng Chitinase tinh khiết có thể ñược sử dụng như một dung dịch và có nồng ñộ xác ñịnh (50- 100ppm) và ñược ứng dụng trong thuốc xịt hay một dịch ñặc chitinase tinh khiết cùng hiện diện với chất mang gắn với nó (methylcellulose, gumArabic) ñược sử dụng như là một loại thuốc bột [21]

1.2.6.2 Trong y dược

- Tổng hợp chitoolygosaccharide

Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitoolygosaccharide ngày càng ñược nghiên cứu sâu Trong y học người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và

chitoheptataose làm tác nhân kháng ung thư Chitinase của Vibrio algjnolyticus

phân cắt huyền phù chitin thành chitopentaose và tritotriose

N,N-diacetylchitobioase ñược sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi ñầu cho việc sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học Chitinase thu nhận từ S

griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục ñược

cải biến hóa học thành một dẫn xuất disacchaside mới 2-acetamido-2-Deoxy-D allopyranosse Đây là chất trung gian ñể tổng hợp nên những chất ức chế enzyme

Ngược lại cĩ thể sử dụng chitinase của Bacillus để tổng hợp chitobiose

nhờ sự kết nối N-acetyl- D-glucosamine với dẫn xuất đường oxalozin

- Chuẩn đốn các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng chitinase

Các lồi nấm chính liên quan đến các bệnh cơ hội ở các bệnh nhân AIDS

là Candidosis, Cryptococcosis (nấm men), Histoplasmosis, coccidioimucosis

(nấm lưỡng hình) Những nguồn kháng nguyên của nấm (mannan của

Candidosis, glucuronoxylomanan cĩ trong nấm men) cĩ thể hoạt tính như là một

nhân tố ngăn chặn tế bào T trong sự phát triển của AIDS Một lượng nhỏ kháng nguyên của nấm cĩ thể kích thích phản ứng miễn dịch, nhưng sự thừa thãi kháng nguyên cĩ thể gây ra tác động ngược lên tính miễn dịch của tế bào Do đĩ, điều cần thiết là việc điều trị phải được tiến hành một cách nhanh chĩng và cĩ hiệu quả trước khi những tình trạng trên cĩ điều kiện lan rộng

Nhiều phương pháp chẩn đốn bệnh nấm được dề xuất như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dị phân tử… để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao Những bất lợi chung ở những phương pháp hiện được sử dụng là khĩ áp dụng đối với mẫu dịch cơ thể bởi vì khĩ cố định được các mẫu này Các phương pháp nhuộm như GMS (Grocott methanamine AgNO3 staining) dùng nhuộm cố định các tiêu bản nấm nhưng khơng cĩ tính đặc hiệu cao và sử dụng các thiết bị đắt tiền

Chitin hiện diện nhiều trong hầu hết vách các tế bào nấm gây bệnh, ít nhất

là một giai đoạn trong quá trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong vết chồi Do đĩ cần một phương pháp nhuộm chitin đặc biệt cho nấm tạo cơ sở cho một phương pháp chuẩn đốn nhanh chĩng hiệu quả các lồi nấm gây bệnh

Hiện nay các nhà khoa học đã đề nghị một phương pháp chuẩn đốn mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo

dịng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1) nĩ kết hợp chặt chẽ với

chition và cĩ thể sử dụng như một mẫu dị trong việc chuẩn đốn với độ nhạy

cao ñể nhận diện một cách ñặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh

- Chế phẩm thuốc mới chitinase và các dược chất kháng nấm

Hiện nay các nhà khoa học ñề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt tính nội sinh của

chitnase Các tác nhân bao gồm:

- Amphotericin b và những phức chất có cấu trúc tượng tự nystatin và pyramicin

- 5-flourocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol…

- Allylamine–thiocarbamate như tolnaftat, terbinafin, Griseofulvin, acid undecylenic, bezoic…

Chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân Ngoài ra việc kết hợp giữa các chitinase và laminarinase ñược ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng chitinase)

Các nhà khoa học ñã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chtinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các lạo nấm khác nhau thuộc nhóm

Aspergillus, Candida

1.3 Đại cương về xạ khuẩn

1.3.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

1.3.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà

vi khuẩn và nấm mốc không phát triển ñược Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp ñất bề mặt, số lượng xạ khuẩn trong ñất không chỉ phụ thuộc vào loại ñất mà còn phụ thuộc vào mức ñộ canh tác của ñất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng và lớp ñất bề mặt (40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Số ñơn vị hình thành khuẩn lạc (CPU) của xạ khuẩn trong 1g ñất canh tác thường

ñạt tới hàng triệu mầm xạ khuẩn, trong ñất hoang hóa chỉ khoảng 10000 –

100000 Số lượng xạ khuẩn trong ñất cũng thay ñổi theo thời gian trong năm

Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh nhưng có thể kí sinh ở thân cây, ở củ và rễ cây Một số nghiên cứu cũng cho thấy

sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophia,

Actinomyces mortivalis và Actinomyces iraquensis, Actinomyces như

Actinomyces antibioticus (MU106, MU 107) Actinomyces rimosus (MU114) hoặc trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng thủy sản ñặc biệt là lớp bùn nơi xác các hợp chất hữu cơ lắng ñọng nhiều

Xạ khuẩn ñược nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên, tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong ñất, trong nước, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong ñất Bên cạnh ñó, chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao ñổi chất quan trọng nên ñược dùng ñể sản xuất nhiều loại enzyme như protease, amilase, celulase, glucoiomerase; chitinase …; các vitamin và các acid hữu cơ Người ta

hi vọng rằng có thể sử dụng một số loại xạ khuẩn ñể chế biến một số loại thực phẩm thay cho nấm mốc, vì nhiều nấm mốc có thể sinh ñộc tố aflatoxin Một ñặc ñiểm quan trọng của xạ khuẩn là là khả năng sinh chất kháng sinh Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy có tới trên 70% xạ khuẩn phân lập từ thiên nhiên có khả năng này Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện ñã ñược biết ñến trên thế giới thì trên 80% ñược tạo từ xạ khuẩn Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia)

có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ ñậu và có khả năng cố ñịnh nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích thì một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho người, cho ñộng vật và cho cây trồng Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là vùng ñất kiềm, ñất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài ñộng ruộng [4], [5], [11], [17], [32]

1.3.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới

Trước ñây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học, do nó có những ñặc ñiểm vừa giống Vi khuẩn vừa giống Nấm Trước thế kỷ 19, xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm nấm Tuy nhiên, ñến nay, khi ñã nghiên cứu sâu hơn người ta ñã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn như:

- Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium

- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

- Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn

- Xạ khuẩn là ñích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi ñó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể

- Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen

- Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose

- Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axit của môi trường, ñặc ñiểm này không có ở nấm

- Các ñặc ñiểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes

cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

Từ những ñặc ñiểm trên, nên xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm vi khuẩn thật Eubacteria

Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria,

bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay,

478 loài ñã ñược công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả

các chi còn lại và ñược xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [4], [5]

1.3.2 Hình thái, kích thước và cấu tạo của xạ khuẩn

1.3.2.1 Đặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn

Trên môi trường ñặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, có

bề mặt khô nhám Kích thước khuẩn lạc thay ñổi tùy từng loài và ñiều kiện môi trường Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes,

tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc

Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm mốc vì khuẩn ty của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8 µm; khuẩn ty khí sinh 1,14 µm) ñường kính khuẩn ty nấm thường lớn hơn khoảng 10 lần so với ñường kính khuẩn ty của xạ khuẩn

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám

Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển tốt, khuẩn ty không có vách ngăn và không tự ñứt ñoạn, bắt màu gram dương, háo khí, hoại sinh, không hình thành nha bào, không có lông và giáp mô, ña hình thái như dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ty (hipha) hay phân nhánh chùm, thành bó gọi là khuẩn ty thể (mycelium) Kích thước và khối lượng khuẩn ty thể thường không ổn ñịnh, chúng phụ thuộc vào từng loại ñiều kiện môi trường nuôi cấy Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn khuẩn ty già

và không mang bào tử

Khuẩn lạc xạ khuẩn có những vòng tròn ñồng tâm cách nhau một khoảng nhất ñịnh, nguyên nhân là do xạ khuẩn sinh ra các chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu ñi, qua ñược vùng có chất ưc chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng khiến khuẩn ty lại phát triển yếu ñi Cứ thế tạo thành khuẩn lạc

có các dạng vòng tròn ñồng tâm

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp gồm lớp vỏ ngoài là các sợi bền chặt, lớp trong tương ñối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao ñổi chất như chất kháng sinh, ñộc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ ñược tích lũy trong mỗi lớp khác nhau Khuẩn lạc của xạ khuẩn có mầu sắc khác nhau như ñỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại xạ khuẩn và ñiều kiện ngoại cảnh Có loại xạ khuẩn tạo sắc tố tan trong môi trường nuôi cấy, thường gặp các loại mang màu: xanh, tím, ñỏ, da cam, vàng, lục, nâu và ñôi khi màu ñen [5], [11], [17]

1.3.2.2 Cấu tạo tế bào

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ

cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính là thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60-120A0, khi già có thể ñạt tới 150-200A0; lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0; lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp copeptide bao gồm các gốc N-axetyl glucozamine liên kết với N- axetyl muramic bởi các liên kết 1,4-glucozit Khi xử lý bằng lyzozyme, các liên kết 1,4-glucozid bị cắt ñứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác

Màng sinh chất xạ khuẩn dày, khoảng 50nm, có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn Chức năng chủ yếu của màng sinh chất là ñiều hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào, ngoài ra nó còn tham gia vào quá trình hình thành bào tử Trong quá trình hình thành bào tử, màng sinh chất ăn sâu vào phía trong khuẩn ty, tạo thành một cái gờ hình vành khăn theo mặt cắt, sau ñó hình

vành khăn phát triển sâu vào phía trong trung tâm và dần dần liền lại với nhau gồm hai lớp, dày khoảng 25nm

Tế bào chất của xạ khuẩn cũng không khác gì mấy so với tế bào chất của

vi khuẩn Đặc ñiểm này làm cho người ta tưởng nhầm xạ khuẩn là cùng loại với

vi khuẩn

Điểm giống nhau cơ bản giữa xạ khuẩn và vi khuẩn là nhân không có cấu trúc ñiển hình Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau ñó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin)

Các thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn, gồm có các hạt polyphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [5], [17]

1.3.3 Sinh sản

Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử Bào tử ñược hình thành trên nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử, ñược hình thành theo kiểu kết ñoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation)

- Kiểu kết ñoạn: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống sinh bào tử Sau ñó tế bào tập trung bao bọc quanh mỗi hạt cromatin gọi là tiền bào tử Tiền bào tử hình thành màng tạo thành màng nằm trong cuống sinh bào

tử Bào tử thường có hình cầu hoặc ô van, ñược giải phóng khi màng cuống sinh bào tử bị phân giải hoặc bị tách ra

- Kiểu cắt khúc: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống sinh bào tử Sau ñó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần ñều có tế bào chất Bào tử hình thành theo cách này thường có hình viên trụ hoặc hình que

Bào tử xạ khuẩn ñược bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với ñộ dày khoảng 300-400 A0 chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác ñộng bất lợi của ñiều kiện ngoại cảnh như nhiệt ñộ, pH…Hình dạng,

kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương ñối

ổn ñịnh và là ñặc ñiểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn

Ngoài ra, xạ khuẩn còn sinh sản bằng khuẩn ty Các ñoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [5], [17]

Hình 1.3 Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn

1.4 Tình hình nghiên cứu chitinase trong và ngoài nước

1.4.1 Ngoài nước

Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về chitinase

Anke và Terwisscha van Scheltinga (1995) nghiên cứu sự thủy phân chitin bằng chitinase thực vật, chứng minh chitinase có vai trò quan trọng trong hệ thống bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm bệnh và stress [18] Năm 1998, Wen-Chi Hou và cộng sự nghiên cứu hoạt ñộng của chitinase thu nhận từ khoai lang có pH tối ưu là 5, nhiệt ñộ tối ưu là 250C [31]

Năm 2002, Kyoung Ja Kim và cộng sự nghiên cứu tách chiết và tinh

sạch chitinase từ Streptomyces sp M20 Chitinase thu nhận từ dịch môi trường

nuôi cấy Streptomyces sp M20, ñược kết tủa bởi (NH4)2SO4 và lọc gel

Sephadex G – 100, thu ñược chitinase có khối lượng lớn nhất là 20 kDa, có

pHopt là 5 và nhiệt ñộ tối ưu là 30oC [25]

Năm 2004, Neetu Dahiya và cộng sự nghiên cứu tinh sạch và xác ñịnh

hoạt tính của chitinase từ Enterobacteria sp NRG4 Chitinase thu nhận từ dịch môi trường nuôi cấy Enterobacteria sp NRG4, kết tủa bởi (NH4)2SO4 và lọc gel Sephadex G – 200 thì thu ñược chitinase có pHopt là 5.5 và nhiệt ñộ tối

ưu là 45oC [20]

M H El-Katatny và cộng sự (2000), nghiên cứu sản xuất chitinase và

1,3-glucanase từ Tricoderma harzianum, tổng hợp chitinase có hoạt tính cao

nhất ở 7 ngày nuôi cấy, nhiệt ñộ tối ưu là 300C, pH tối ưu là 6 [26]

1.4.2 Trong nước

Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của nhiều ngành công nghệ sinh học, việc thu nhận, tách chiết, ñánh giá hoạt tính enzyme cũng ñược nghiên cứu Nhóm sinh viên Nguyễn Thị Hồng Thương và cộng sự (2003), trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Tp Hồ Chí Minh ñã tiến hành nghiên cứu và chỉ ra rằng hoạt tính chitinase trong dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc khi ñược cảm ứng bằng chitin từ vách tế bào nấm mốc thì cao hơn khi cảm ứng bằng

chitin từ vỏ tôm Hoạt tính chitinase tách chiết từ Trichoderma hamatum nuôi

cấy trên môi trường LNM loại bỏ glucose và bổ sung vách tế bào nấm có nhiệt

ñộ tối ưu là 40oC biên ñộ nhiệt từ 20 – 70oC, pH tối ưu là 4.5 biên ñộ pH là 4.0 – 6.0 Động học thời gian phân cắt enzyme là 5 giờ [14]

Song song với việc nghiên cứu chitinase ở vi sinh vật thì cũng có những nghiên cứu thu nhận chitinase từ thực vật Điển hình có công trình của PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Quang Nhân ñã nghiên cứu thu nhận, tách chiết và

xác ñịnh tính chất của chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis (2008),

chitinase tinh sạch từ mủ cao su có nhiệt ñộ tối ưu 550C, pH tối ưu 4,5 [10] Đặng Trung Thành nghiên cứu thu nhận chitinase từ cây khoai lang (2008), chitinase thu nhận từ lá có hoạt tính cao nhất và giảm dần ñến cuống lá

và dây khoai, chitinase trong lá khoai lang bị tổ thương có hoạt tính cao hơn trong lá không bị tổn thương [12]

Nhìn chung các công trình ñều tập trung vào nghiên cứu tách chiết và xác ñịnh tính chất của chitinase từ các nguồn khác nhau Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu chitinase từ vi sinh vật, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Nghiên cứu và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phản ứng xúc tác

4 Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng xạ khuẩn ñược phân lập từ các mẫu ñất thu ñược trên ñiạ bàn thành phố Buôn Ma Thuột

Hóa chất

Hóa chất sử dụng: KNO3, H2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, FeSO4.7H2O, chitin, agar, glucose, thuốc thử DNS, N-acetyl-D-glucosamine, NaOH, acid citric, trinatri citrate, NaH2PO4, Na2HPO4.12H2O, glycine, HCl, acid acetic, natri acetate, Na2CO3

Thiết bị

Máy li tâm lạnh, nồi cách thủy, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, máy lắc, máy lắc gia nhiệt, máy ño OD, máy cất nước, tủ lạnh -24oC và 4oC, box cấy vô trùng, cân ñiện tử, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, que cấy, ñĩa petri, ống nghiệm

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu

Thí nghiệm ñược tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, trường Đại học Tây Nguyên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập và giữ giống các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase

* Chuẩn bị môi trường

MT1 là môi trường Gause cải biến dùng phân lập và giữ giống các chủng

xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase

Thành phần môi trường: Chitin huyền phù 1% 250ml; K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KNO3 1,0g; NaCl 0,5g; FeSO4,7H2O 0,01g; Agar 20g; nước máy ñến 1000ml; pH 7,2 – 7,4

Khử trùng 1atm, 45 phút

* Phương pháp thu mẫu

- Mẫu ñất ñược lấy ngẫu nhiên ở ñộ sâu 0-30cm trên các ruộng, vườn tại Buôn Ma Thuột Phân tích mẫu ngay sau khi thu mẫu

* Phương pháp phân lập

- Mẫu ñược nghiền mịn trong cối sứ vô trùng

- Cân 1 gam mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối 0,1% vô trùng Lắc trong 5 phút Thực hiện pha loãng dung dịch mẫu theo hệ số thập phân từ 10-1- 10-6 Chọn 4 ñộ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ñể cấy trải

- Dùng pipetman vô trùng lấy 0,1 ml dung dịch mẫu ở các ñộ pha loãng khác nhau vào ñĩa petri chứa môi trường MT1, dàn ñều bằng que gạt thủy tinh Mỗi ñộ pha loãng thực hiện 3 ñĩa petri

- Ủ các ñĩa trên ở ñiều kiện nhiệt ñộ phòng trong 3-7 ngày, chọn các khuẩn lạc ñặc trưng của xạ khuẩn cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường MT1 Làm thuần giống bằng phương pháp tạo khuẩn lạc ñơn

- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập ñể nhận diện và xác ñịnh xạ khuẩn

*Phương pháp giữ giống và bảo quản các chủng xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn sau khi ñược xác ñịnh cấy vào môi trường thạch nghiêng Sau 7 ngày, khuẩn ty phát triển tốt sẽ bảo quản ở 40C trong tủ lạnh Cấy chuyền ñịnh kỳ các ống giống sau 1- 2 tháng [3], [6], [7], [15]

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase cao

2.3.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

MT2 là môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ñể thu enzyme chitinase

Thành phần môi trường: chitin huyền phù 1% 250ml; K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KNO3 1,0g; NaCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; nước cất ñến 1000ml; pH 7,2 – 7,4

Khử trùng 1atm, 45 phút

2.3.2.2 Phương pháp thu dịch enzyme xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn phân lập ñược nuôi cấy trong môi trường MT2 Sau 7 ngày, ly tâm 7000 vòng/phút, thời gian 15 phút ñể thu dịch enzyme Xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp ñịnh lượng ñường khử với thuốc thử DNS (acid dinitrosalycylic)

2.3.2.3 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase bằng ñịnh lượng ñường khử với thuốc thử DNS

* Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất chitin huyền phù 1% bằng enzyme chitinase và phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử 3,5-acid ñinitrosalycylic Enzyme chitinase sau phản ứng thủy phân chitin sẽ tạo ra một lượng ñường khử N-acetyl-D-glucosamin Đường khử sẽ phản ứng với thuốc thử acid 3,5-ñinitrosalycylic (màu vàng) tạo thành phức màu ñỏ cam Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng ñộ ñường khử trong một phạm vi nhất ñịnh Định lượng sản phẩm quá trình phân giải chitin bằng máy ño quang phổ ở bước sóng 540nm Dựa theo ñồ thị ñường chuẩn của N-acetyl-D-glucosmin tinh khiết với thuốc thử acid 3,5-ñinitrosalycylic sẽ tính ñược hàm lượng ñường khử của mẫu nghiên cứu

* Cách tiến hành

(1) Chuẩn bị huyền phù chitin 1% : Lấy 5g chitin hòa tan trong 50ml

HCl ñậm ñặc, khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 400C Sau ñó thêm vào từ

từ 500ml nước lạnh (50C) ñể tạo dịch huyền phù chitin 1%

Dịch huyền phù ñược thu lại bằng cách lọc qua giấy hoặc li tâm 3500 vòng/phút trong 7 phút Huyền phù tiếp tục ñược rửa với nước cất và lọc hoặc li tâm nhiều lần cho ñến khi pH 5, rồi hòa vào ñệm acetate pH 5 Sau ñó bảo quản lạnh dịch huyền phù

(2) Xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase

- Hỗn hợp phản ứng gồm 2 ml dịch enzyme thô của xạ khuẩn và 2 ml huyền phù chitin 1%, pH 5, lắc ñều Giữ ở 30 - 350C trong 2 giờ, phản ứng thủy phân ñược ngừng lại bằng cách ñun sôi trong 10 phút Lượng N-acetyl-D- glucosmin tạo thành sau phản ứng ñược ñịnh lượng bằng DNS

Ht - hoạt ñộ enzyme (UI/ml)

X - hàm lượng N-acetyl-D-glucosamin (µg/ml) trong dịch thí nghiệm ñã pha loãng

K - hệ số pha loãng

V – tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml)

v - thể tích enzyme ñem phản ứng (ml)

t - thời gian phản ứng (phút)

(4) Xác ñịnh hàm lượng N-acetyl-D-glucosmin với thuốc thử DNS

Chuẩn bị hóa chất

- Hòa tan 300g sodium potassium vào 500ml nước (1)

- Hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic vào 200ml dung dịch NaOH 2M (2)

- Dung dịch dinitrosalicylic dùng cho phản ứng : trộn (1) và (2), thêm nước cất cho ñủ 1 lít Chỉ pha dung dịch này trước khi dử dụng, bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh màu tối có lắp ñậy, cần tránh ánh sáng và CO2

- Dung dịch N-acetyl-D-glucosamin chuẩn nồng ñộ 500µg/ml

- Dung dịch mẫu cần xác ñịnh nồng ñộ : pha loãng ở nồng ñộ thích hợp

(+) Xác ñịnh nồng ñộ ñường khử của dịch ñường thu ñược sau phản ứng enzyme chitinase phân giải chitin

- N-acetyl-D-glucosamin sẽ thu ñược sau khi cho enzyme chitnase xạ khuẩn phản ứng với chitin huyền phù 1% Ly tâm dung dịch phản ứng 7000 vòng/ phút thời gian 15 phút ñể thu dịch N-acetyl-D-glucosamin Dùng pipetman hút 3ml dịch trong cho vào ống nghiệm sạch

- Thêm 1ml dung dịch DNS, lắc ñều, dùng giấy thiếc bịt kín ống nghiệm, ñun cách thủy trong 5 phút, ñể nguội, ño OD540nm

- Để loại trừ N-acetyl-D-glucosamin có trong dung dịch enzyme chitinase

xạ khuẩn, thí nghiệm tiến hành ño OD540nm của dung dịch enzyme phản ứng với DNS và ñược trừ trong kết quả ño OD của phản ứng enzyme với cơ chất

- Dựa vào ñường chuẩn của acetyl-D-glucosamin tính ñược nồng ñộ acetyl-D-glucosamin của mẫu thí nghiệm [1], [3], [9], [10], [15], [16]

N-2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

2.3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2, thu dịch enzyme xạ khuẩn và xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase ở các thời ñiểm 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 13 ngày, 16 ngày, 19 ngày Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.3.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy

Nuôi các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2 với nồng ñộ chitin huyền phù khác nhau : 0,1% ; 0,25% ; 0,5% ; 0,75% ; 1%

Sau 7 ngày nuôi cấy, thu dịch enzyme xạ khuẩn và xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử bằng DNS Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung trong môi trường nuôi cấy

Nuôi các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2 có bổ sung 0.1% các nguồn nitơ khác nhau: pepton, NH4SO4, NaNO3, lô ñối chứng không

bổ sung thêm nguồn nitơ nào Sau 7 ngày nuôi, thu dịch enzyme xạ khuẩn và xác

ñịnh hoạt tính enzyme chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử bằng DNS Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy

Tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2 và

ủ ở 5 mức nhiệt ñộ khác nhau : 250C; 350C; 450C; 550C Sau 7 ngày, thu dịch enzim xạ khuẩn và xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử bằng DNS như ở trên Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2 có

ñộ pH khác nhau : 4,0 ; 5,0 ; 6,0; 7,0; 8,0 ; 9,0 (dùng Na2CO3 5% và HCl 5% ñể ñiều chỉnh pH của môi trường) Sau 7 ngày, thu dịch enzyme xạ khuẩn và xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử bằng DNS Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phản ứng xúc tác

2.3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

2 ml enzyme xạ khuẩn trộn với 2 ml chitin huyền phù 1%, pH 5, ủ trong các khoảng thời gian khác nhau : 10 phút; 20 phút; 40 phút; 1 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 10 giờ; 12 giờ Sau ñó ñịnh lượng N-acetyl-D-glucosamin bằng DNS

ñể xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase Từ kết quả nhận ñược, xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu cho hoạt tính chitinase Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất

2ml enzyme xạ khuẩn trộn với 2ml chitin huyền phù, pH 5 với các nồng

ñộ là 0,1% ; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0% Cho phản ứng trong 2 giờ, sau ñó ñịnh lượng N-acetyl-D-glucosamin bằng DNS ñể xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase

Từ kết quả nhận ñược, xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng

2 ml enzyme xạ khuẩn trộn với 2 ml chitin huyền phù 1%, pH 5 ủ ở các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau: 280C ; 350C ; 450C ; 550C ; 650C ; 750C trong 2 giờ Sau ñó tiến hành ñịnh lượng N-acetyl-D-glucosamin bằng DNS ñể xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase Từ kết quả nhận ñược, xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.4.4 Ảnh hưởng của pH phản ứng

1 ml enzyme trộn với 1 ml chitin huyền phù 1%, thêm vào 2ml dung dịch ñệm có các pH khác nhau Sử dụng các ñệm : ñệm acetate (pH= 4 ; 5); ñệm citrate (pH = 4 ; 5 ; 6); ñệm phosphate (pH = 6 ; 7 ; 8); ñệm Na2HPO4 – KH2PO4(pH = 6 ; 7 ; 8); ñệm NaOH – Glycine (pH = 9 ; 10) Sau ñó ñịnh lượng N- acetyl-D-glucosamin bằng DNS ñể xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase Từ kết quả nhận ñược, xác ñịnh ñộ pH thích hợp cho hoạt tính chitinase Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.3.5 Phương pháp ñịnh danh xạ khuẩn

Định danh xạ khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử Việc ñịnh danh ñược thực hiện bởi Phòng xét nghiệm NK - BIOTEK của Công ty Nam Khoa, ñịa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, P Tân Hưng, Q.7, TP Hồ Chí Minh

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu ñược xử lý Anova trên phần mềm SPSS

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại Buôn Ma Thuột

Gause là môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Môi trường Gause cải biên sử dụng chitin huyền phù 1% làm nguồn carbon duy nhất ñể phân lập các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chitinase Xạ khuẩn sẽ tiết enzyme ngoại bào chitinase phân giải chitin thành những tiểu phần nhỏ ñể sử dụng trong quá trình sinh trưởng, phát triển Trong môi trường này, chitin vừa ñóng vai trò là nguồn dinh dưỡng carbon, vừa là chất cảm ứng ñể xạ khuẩn sản sinh chitinase Như vậy xạ khuẩn sinh trưởng ñược trên môi trường ñặc hiệu này có khả năng tổng hợp enzyme chitinase Đây là cơ sở

ñể phân lập các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase

Từ các mẫu ñất thu ñược tại Buôn Ma thuột, thí nghiệm phân lập và làm thuần ñược 31 chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase, ký hiệu là : E1, E2, E3, E4, E5,

Đặc ñiểm hình thái của các chủng xạ khuẩn ñược mô tả ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập

Tại Buôn Ma Thuột

dạng

Màu sắc Độ nổi Bìa khuẩn lạc

1 E1 Tròn Nâu xám Lồi, gồ ghề Dạng lông

4 E4 Tròn, có vành ở mép Xám Lồi, gồ ghề Dạng cành

5 E5 Tròn, có vành ở mép Nâu ñỏ Gồ ghề Dạng lông

6 E6 Tròn Nâu ñen Phẳng Răng cưa

15 S3 Tròn, có vành ở mép Xanh Lồi, gồ ghề Răng cưa

16 S4 Tròn, có vành ở mép Lồi, xù xì Răng cưa

17 S5 Tròn, mép dạng rễ

Vàng nhạt Lồi, xù xì Dạng lông

18 S6

Tròn, mép viền răng

19 S7 Tròn, có vành ở mép Nâu Lồi, xù xì Dạng lông

20 S8 Tròn, có vành ở mép Trắng Phẳng Dạng lông

22 S10 Tròn, mép dạng rễ Xanh Lồi, nhẵn Dạng múi

23 S11 Tròn, có vành ở mép Nâu Lồi, gồ ghề Dạng lông

24 S12 Tròn, có vành ở mép

Xanh nhạt Lồi, gồ ghề Dạng cành

25 S13 Đồng tâm

Nâu ñỏ nhạt Phẳng Dạng lông

28 SX1 Tròn, ñồng tâm Xám Lồi, gồ ghề Dạng lông

Hình 3.1 Khuẩn lạc 35 chủng xạ khuẩn phân lập tại Buôn Ma Thuột

3.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase cao

Nuôi cấy các chủng xạ khuẩn phân lập ñược trong môi trường MT2 Thu enzyme chitinase ñược xạ khuẩn tiết ra môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm

7000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ cặn, lấy dịch trong Cho enzyme phản ứng với chitin Định lượng ñường N-acetyl-D-glucosamin tạo thành bằng DNS ñể xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase

Kết quả thí nghiệm ñược ghi nhận ở bảng 3.2

Bảng 3.2 : Hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn phân lập tại

Bảng 3.2 cho thấy, hoạt tính chitinase từ các chủng xạ khuẩn biến ñộng rất lớn từ 0,159 ñến 1,224 UI/ml Sự sai khác về hoạt tính chitinase của các chủng

xạ khuẩn có ý nghĩa thống kê Sự khác biệt này là do ñặc ñiểm của chủng giống qui ñịnh Trong 35 chủng xạ khuẩn phân lập, 4 chủng có hoạt tính vượt trội là : SX1 (1,224 UI/ml) ; E7 (1,129 UI/ml) ; C3 (1,0373 UI/ml) và E4 (0,966 UI/ml) Dựa vào kết quả sàng lọc trên, chúng tôi chọn 4 chủng xạ khuẩn SX1, E7, C3, E4 có hoạt tính chitinase cao ñể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Điều kiện môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ ñến sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn, cũng như khả năng sản sinh enzyme chitinase Các nhân

tố của môi trường rất ña dạng như thành phần dinh dưỡng, các nhân tố lý, hóa, sinh học Xạ khuẩn chỉ phát triển ñược trong những giá trị xác ñịnh của mỗi yếu tố Những giới hạn này cũng không giống nhau ở các nhóm xạ khuẩn khác nhau

Thí nghiệm nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng trực tiếp ñến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp enzyme chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn như thời gian nuôi cấy, nồng ñộ chitin, nguồn nitơ bổ sung, nhiệt ñộ, ñộ pH của môi trường nuôi cấy

3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Việc xác ñịnh thời gian nuôi cấy các chủng xạ khuẩn trong môi trường MT2 ñể sinh chitinase có hoạt tính cao là ñiều cần thiết ñầu tiên khi khảo sát ñặc ñiểm của các chủng giống tuyển chọn.

Nuôi cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong các khoảng thời gian khác nhau : 5, 7, 10, 13, 16, 19 ngày, thu nhận enzyme ñược tạo ra trong môi trường

và ñánh giá hoạt tính

Kết quả ñược thể hiện qua bảng 3.3.

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase của các

UI/ml, từ 7-16 ngày hoạt tính enzyme cao và tương ñối ổn ñịnh, biến ñộng

từ 0,933 ñến 0,970 UI/ml, giảm mạnh ở 19 ngày (0,593 UI/ml)

Ở chủng E4, hoạt tính enzyme tăng mạnh ở 7 ngày nuôi cấy từ 0,659 UI/ml ở 5 ngày lên 1,089 UI/ml (tăng 1,65 lần), hoạt tính enzyme tiếp tục tăng và cho hoạt tính cao ở 10 - 13 ngày (1,218 và 1,200 UI/ml) Hoạt tính enzyme giảm dần ở 16 và 19 ngày, tuy nhiên ở 16 ngày hoạt tính enzyme vẫn cao 1,032 UI/ml

Tương tự, chủng E7 cũng có hoạt tính enzyme tăng mạnh ở 7 ngày nuôi cấy từ 0,796 UI/ml ở 5 ngày lên 1,262 UI/ml (tăng 1,59 lần) và cao

nhất ở 10 ngày (1,375 UI/ml) Sau ñó hoạt tính enzyme giảm dần ở 13, 16 ngày nhưng vẫn cao (1,139 ; 1,018 UI/ml) và giảm mạnh ở 19 ngày (0,714 UI/ml)

Nhìn chung, cả 4 chủng xạ khuẩn ñều có hoạt tính enzyme tăng mạnh

ở 7 ngày nuôi cấy, thời gian từ 7-16 ngày nuôi cấy ñều thu ñược enzyme chitinase có hoạt tính cao và khi thời gian nuôi cấy kéo dài ñến 19 ngày thì hoạt tính enzyme giảm Nguyên nhân là do thời gian nuôi cấy kéo dài, nguồn dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, ñồng thời sản phẩm trao ñổi chất tích lũy sẽ làm thay ñổi các yếu tố thuận lợi ban ñầu của môi trường như nhiệt

ñộ, pH, ñôi khi tích lũy những chất ñộc gây hại cho tế bào Điều này sẽ ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng của xạ khuẩn cũng như khả năng sản sinh enzyme chitinase và hoạt tính của enzyme

So giữa các chủng xạ khuẩn khảo sát, chủng SX1 có hoạt tính enzyme cao hơn cả trong khoảng thời gian thích hợp biến ñộng từ 1,076 - 1,911 UI/ml, chủng E7 thấp hơn từ 1,262 - 1,375 UI/ml, chủng E4 từ 1,200 – 1,218 UI/ml và thấp nhất là chủng C3 có hoạt tính enzyme biến ñộng từ 0,952 - 0,970 UI/ml Ngoài

ra, hoạt tính enzyme chitinase tăng và giảm theo thời gian nuôi cấy giữa các chủng xạ khuẩn với tốc ñộ cũng khác nhau Sự khác nhau này là do ñặc ñiểm của chủng giống qui ñịnh.

Dựa vào kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy thu enzyme của các chủng xạ khuẩn khảo sát là 7 ngày cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy

Chitin vừa là nguồn dinh dưỡng carbon vừa là chất cảm ứng ñể xạ khuẩn sinh chitinase Vì vậy ñề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng

ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Nuôi cấy các chủng xạ khuẩn trong môi trường MT2 với các nồng ñộ chitin khác nhau: 0,1%; 0,25%; 0,5%; 0,75%; 1% Sau 7 ngày nuôi cấy xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase

Kết quả thí nghiệm ñược mô tả ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy ñến hoạt

tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn Nồng ñộ

chitin (%)

Hoạt tính chitinase (UI/ml)

0,10 1,882±0,042c 0,985±0,097b 1,364±0,028c 1,211±0,028ab 0,25 1,606±0,006c 0,994±0,060b 1,658±0,029d 1,824±0,055c 0,50 0,915±0,048b 0,361±0,114a 0,967±0,088b 1,324±0,095b 0,75 0,257±0,014a 0,183±0,017a 1,179±0,075c 0,978±0,078a 1,00 0,839±0,256b 0,417±0,000a 0,633±0,050a 1,133±0,000a

* Ghi chú : Các giá trị trung bình có các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa ở 5% theo phép thử Ducan

Kết quả cho thấy, ở nồng ñộ chitin thấp 0,1% ñã có khả năng cảm ứng 4 chủng xạ khuẩn sinh chitinase Với chủng SX1, C3 và E4 ở nồng ñộ 0,1% và 0,25% cho hoạt tính chitinase cao Chủng E7 ở nồng ñộ 0,25%; 0,5%; 1% ñều cho hoạt tính chitinase cao, cao hơn hẳn là ở nồng ñộ 0,25% (1,824 UI/ml) Nhìn chung, nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy từ 0,50% ñến 1% ñều làm cho hoạt tính chitinase giảm Theo chúng tôi, nếu nồng ñộ chitin trong môi trường cao sẽ dẫn ñến giảm hàm lượng nước của môi trường gây cản trở trong việc thực hiện các phản ứng xúc tác cũng như các quá trình trao ñổi chất của xạ khuẩn Ở nồng ñộ chitin thích hợp trong môi trường nuôi cấy, xạ khuẩn SX1 và E7 cho enzyme có hoạt tính cao hơn hẳn (1,882 và 1,824 UI/ml), xạ khuẩn C3 có hoạt tính enzyme thấp nhất (0,994 UI/ml) Sự khác biệt này có thể do ñặc ñiểm chủng giống qui ñịnh

Như vậy, nuôi cấy các chủng xạ khuẩn ñược tuyển chọn ñể thu nhận chitinase trong thời gian 7 ngày, chúng tôi chọn nồng ñộ chitin trong môi trường là 0,25%

3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung trong môi trường nuôi cấy

Bản chất của enzyme là protein Nitơ là thành phần hóa học quan trọng cấu tạo nên protein Vì vậy, môi trường nuôi cấy xạ khuẩn thu enzyme chitinase cần chú ý ñến nguồn nitơ

Mỗi loại vi sinh vật có khả năng ñồng hóa các nguồn nitơ khác nhau, nên thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ bổ sung khác nhau vào môi trường nuôi cấy Nguồn nitơ bổ sung gồm nitơ hữu cơ là pepton và nitơ vô

cơ như NaNO3 và (NH4)2SO4

Kết quả thí nghiệm ñược ghi nhận ở bảng 3.5

Kết quả cho thấy các nguồn nitơ bổ sung không có tác ñộng tích cực ñến khả năng tăng hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn Chỉ có (NH4)2SO4 làm tăng hoạt tính chitinase của chủng SX1 (1,278 UI/ml) so với môi trường không

bổ sung (1,125 UI/ml) Đối với 3 chủng C3, E4, E7, (NH4)2SO4 không làm tăng hoạt tính chitiase so với ñối chứng nhưng vẫn cho hoạt tính enzyme cao hơn so với 2 nguồn nitơ bổ sung là NaNO3 và pepton Theo chúng tôi, (NH4)2SO4 cung cấp ñồng thời hai nguồn dinh dưỡng NH4+ và SO42-, trong ñó NH4+ là nguồn nitơ

mà hầu hết vi sinh vật ñều sử dụng một cách dễ dàng Nếu môi trường có ñồng thời NH4+ và NO3- vi sinh vật thường hấp thụ gốc NH4+ trước rồi mới hấp thụ gốc NO3- Khi bổ sung (NH4)2SO4, ngoài nguồn amon, còn cung cấp nguồn khoáng lưu huỳnh Lưu huỳnh là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào

vì có mặt trong một số axit amin, tham gia cấu tạo nên protein cũng như enzyme

Vì vậy bổ sung (NH4)2SO4 có hiệu quả hơn so với bổ sung NaNO3 Tuy nhiên, mức ñộ hiệu quả còn tùy thuộc vào chủng giống ñặc biệt chủng SX1 và C3 Trường hợp sử dụng nguồn nitơ bổ sung là NaNO3, hoạt tính của các enzyme chitinase giảm rất nhiều từ 1,99 - 3,28 lần so với sử dụng môi trường ñối chứng không bổ sung, chứa KNO3 0,1% Theo chúng tôi, mặc dù nitrat là

cùng với KNO3 0,1% có sẵn trong môi trường sẽ làm tăng nồng ñộ NO3-, ngoài

ra cũng làm tăng nồng ñộ Na+ trong môi trường Nồng ñộ NO3- và Na+ trong môi trường cao có thể ảnh hưởng ñến hoạt ñộng sống của xạ khuẩn cũng như khả năng tổng hợp và hoạt tính enzyme chitinase

Kết quả nghiên cứu cho thấy nguồn nitơ bổ sung là pepton không góp phần làm tăng họat tính enzyme chitinase Pepton là chế phẩm thủy phân không

triệt ñể của thịt, cá, là hỗn hợp của nhiều peptit khác nhau về trọng lượng phân tử và một ít axit amin tự do Đây là nguồn nitơ thích hợp nhất của vi khuẩn Đối với xạ khuẩn nói chung và các chủng xạ khuẩn thí nghiệm ñều không thích hợp, có lẽ ñiều

ñó phụ thuộc vào sự hình thành và hoạt ñộng của enzyme phân giải pepton

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy ñến

hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

* Ghi chú : Các giá trị trung bình có các mẫu tự giống nhau trong cùng

một cột thì khác biệt không có ý nghĩa ở 5% theo phép thử Ducan

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy

Hoạt ñộng trao ñổi chất của vi sinh vật có thể xem là kết quả của các phản ứng hóa học Tốc ñộ các phản ứng hóa học trong tế bào ñược quyết ñịnh bởi hoạt tính enzyme tế bào Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của vi sinh vật phản ánh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính của các enzyme tham gia biến dưỡng trong tế bào Nhiệt ñộ của môi trường có ảnh hưởng ảnh hưởng sâu sắc ñến các quá trình sống của tế bào nên sẽ ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của các chủng xạ khuẩn

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase, thí nghiệm tiến hành nuôi cấy 4 chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường MT2, ủ ở 4 mức nhiệt ñộ khác nhau : 25oC, 35oC, 45oC,

55oC Sau 7 ngày nuôi cấy, ly tâm thu enzyme xạ khuẩn và xác ñịnh hoạt tính chitinase.

Kết quả thí nghiệm ñược ghi nhận ở bảng 3.6