Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn

MỞ ĐÀU Ngày nay với các hiểu biết của mình về vi sinh vật con người đã sử dụng chúng vào trong các lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học... để phục vụ cho đời sống của con người. Ta biết rằng trong quá trình sống của thế giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản ứng này luôn gắn chặt với sự có mặt của enzim với hiệu suất xúc tác cực ki lớn so với các chất vô cơ và hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao. Do đó các chế phẩm enzim thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công nghiệp, sản xuất thực phẩm và trong chăn nuôi... Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Song trong cơ thể động vật và thực vật quá trình tổng hợp enzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó. Nguyên liệu động vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết và bảo quản ở -20°c, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzim. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao. Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzỉm protease từ đất vườn”. Với các nội dung sau: ■ Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacỉllus từ đất vườn. ■ Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản. ■ Nghiên cứu nuôi cấy trên môi truờng tiêu chuẩn và môi truờng thay thế để thu đuợc sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao. ■ Nghiên cứu phuơng pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt lực cao. > Ý nghĩa của đề tài ♦♦♦ Ý nghĩa khoa học Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi truờng và ảnh huởng của môi truờng nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu enzym protease của vi khuẩn. ♦♦♦ Ý nghĩa thực tiễn Dựa trên những gì thu đuợc trong quá trình nghiên cứu góp phần giúp xác định đuợc một số môi truờng dinh duỡng phù họp có thể ứng dụng vào qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm enzym protease có hoạt tính cao. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vỉ khuẩn Baciỉỉus 1.1.1. Đặc điểm chung Baciỉỉus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng có khả năng bình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều a- amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase. ♦ Bacỉllus là vi khuẩn Gram dương ♦ Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(l,2-10)pm. ♦ Bacỉllus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động. ♦ Dinh dưỡng : Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các họp chất hữu cơ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỪ PHẠM TP Hồ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Trần

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI

VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM

Chuyên ngành: Vỉ sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH

NGƯỜI HƯỚNG DÃN KHOA HỌC : PGS.TS LƯƠNG ĐỨC PHẨM

Thành phố Hồ Chí Minh -

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo, cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức và thực hiện thành công khóa đào tạo thạc sĩ chuyên ngành Vi Sinh Vật (2006 - 2009) , tạo cơ hội học tập nâng cao trình độ về lĩnh vực mà tôi tâm huyết.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường trung học phổ thông Ngô Quyền, phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Xin gửi lời cảm ơn Phòng khoa học công nghệ - sau đại học, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ

phẩm và trong chăn nuôi Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật Song trong cơ thể động vật và thực vật quá trình tổng hợp enzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó Nguyên liệu động vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết

và bảo quản ở -20°c, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và

thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzim Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất

và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta

có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các nguồn nguyên liệu khác nhau Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu

protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn

hẳn Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu,

phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzỉm protease từ đất vườn”

Với các nội dung sau:

■ Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacỉllus từ đất vườn.

■ Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản

■ Nghiên cứu nuôi cấy trên môi truờng tiêu chuẩn và môi truờng thay thế để thu đuợc sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao

■ Nghiên cứu phuơng pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt lực cao

> Ý nghĩa của đề tài

♦♦♦ Ý nghĩa khoa học

Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc

của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi truờng và ảnh huởng của môi truờng nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu enzym protease của vi khuẩn.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vỉ khuẩn Baciỉỉus

1.1.1 Đặc điểm chung

Baciỉỉus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng

có khả năng bình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều a- amylase và protease kiềm,

có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase

♦ Bacỉllus là vi khuẩn Gram dương

♦ Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(l,2-10)pm

♦ Bacỉllus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.

♦ Dinh dưỡng : Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các họp chất hữu cơ

♦ Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện

♦ Bacỉllus có khả năng sinh bào tử Thông thường bào tử được tạo ra khi tế

bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử Khi bào tử trưởng thành

tể bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi

♦ Đa số Bacỉllus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 1 0 như Bacỉllus alcalophillus, hay có loại phù họp với pH = 2-6 như Bacỉllus

acidocaldrius [7]

♦ về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45°c - 75°C), hay ưa lạnh (5°c - 25°C), nhưng thường gặp Bacỉllus sống ở nhiệt độ 34°c - 37°c.

Hầu hết Bacỉllus không gây độc cho người và động vật Một số loại gây độc cho

côn trùng Chùng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp

Sau đây là một số loài Bacỉllus thường gặp trong tự nhiên:

l.l.l.l. Bacillus subtilis [4], [14], [17], [18]

Bacỉllus subtỉlỉs được nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là

Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872

Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ khô nên còn được

gọi là trực khuẩn cỏ khô

Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 X (3-5) pm

Bacillus subtiỉis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo

thành chuồi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ

Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacỉllus subtỉlỉs có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo chủ yếu từ

polypeptit chủ yểu là axit polyglutamic Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn

có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy màng nhày

của vi khuẩn Bacillus subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt

màu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen

Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Bacỉllus subtỉlỉs là 36°c - 50°c, tối đa khoảng 60°c, là loại ưa nhiệt cao Bào tử của Bacillus subtilis cũng

chịu được nhiệt khá cao

Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6pm - 0,9pm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát

tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời ki sinh sản của vi khuẩn Do mỗi tế bào chỉ tạo ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi Bào tử có thể sống từ vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống

trong 200-300 năm của bào tử Bacillus subtilis [6] Khi gặp điều kiện thuận lợi

những bào tử này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình

Các vi khuẩn Bacỉllus subtỉlỉs có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit

ở mô thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bi u Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chứng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm

có tính axit ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hỏng bánh mì và nhiều thực phẩm khác [16]

Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là a amylase và

protease kiềm có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra

riboílavin ( tiền vitamin B2 )[3] Vì vậy chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp cũng như một số ngành khác

1.1.1.2. Bacỉllus megaterium

Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” Tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần tế

bào của Bacỉllus subtỉlỉs, chiều ngang (1,2-1,5)pm có thể đến 2pm, dài từ 3pm

-12pm, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, hòn hơn đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [4]

Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 X (0,7 - l)pm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 - 1,5 |im Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.[4]

Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn

sóng, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục.

Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kì một yểu tố sinh trưởng nào

Bacỉllus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacỉllus subtilis nên cũng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp.

1.1.1.3. Bacỉllus mensentericus

Bacỉllus mensentericus rất giống Bacillus subtiỉis Thường có trong đất, hạt

mì và ngũ cốc và đặc biệt là trên khoai tây và cỏ khô

Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3-10)x(0,5- 0,6)pm Đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuồi dài

Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô không mọc lan ra môi trường thường có màu màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng kem, vàng nâu, hồng hoặc đen [4]

Nhiệt độ thích họp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacỉllus

mensentericus là 36 - 45°c tối đa là 50 - 55°c, ở pH từ 4,5 - 5 thì nó ngừng phát

triển

Bào tử của Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài khoảng

0,5 - 0,9 pm, nắm ở vị trí bất kì trong tế bào, tế bào thường không phình to khi mang bào tử

Bacỉllus mensenterỉcus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn

hẳn Bacillus subtilis nhưng lên men đường lại kém hơn Hai loại trực khuẩn này

rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường, đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzim protease và amylase Ngoài ra nó còn sinh ra một hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn( như Vibrio) gọi là Bacterioxin

1.1.1.4. Bacỉllus cereus

Te bào của Bacỉllus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) X (3 -5)pm, có khi dày hơn, chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuổi Bào tử có hình bầu dục kích thước 0,9 X ( 1,2 - 1,5 )pm nắm lệch tâm, tế bào chất của nó có chứa các hạt và không bào.[4]

Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phang, khá khuyếch tán, hơi

lõm, trắng đục, mép lồi lõm [4]

Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong đất, không khí Thường sinh sôi và nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm Nó còn được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh [16]

1.1.1.5. Bacỉllus pumỉlus

Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Baccỉllus pumỉlus có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtìỉis.ựỉ]

Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào của nó

gần giống với tế bào của Bacillus subtiỉis.ựỉ]

1.1.1.6. Baciỉỉus polymyxa

Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 - 1 ) X (2 -7)pm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi hoặc chuồi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh [4]

Khuẩn lạc của Bacỉllus polymyxa không màu, phang hoặc lồi, trơn, nhày,

lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.[18]

Bào tử bình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như bình sao Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng ( 1,7 - 2,6) pm, nằm giữa tế bào

Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Chúng còn có khả năng cố định đạm

Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi

trường có tính axit yểu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất thuốc kháng sinh polimixin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yểu là cho công nghiệp dược.

1.1.1.7. Bacỉllus brevis

Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm Bacỉllus

brevis là trực khuẩn kích thước ( 0,7 -1) X (3 -5 )pm Chúng thường đứng riêng rẽ Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 - l)pm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi bị phồng to lên [4]

Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc

về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn họp axit amin cho sinh

trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin

1.1.1.8. Baciỉỉus sỉmpỉex

Te bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé , có kích thước ( 2-5)x 0,6pm,

thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi

Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của Bacỉllus cereus, phang khá khuyếch tán, với

bề mặt hơi xù xì hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm Đặc biệt khuẩn lạc của Bacỉllus

simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường [4]

Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 - 0,9 Ịim, nằm lệch tâm

1.1.1.9. Bacillus linchennỉformừ

Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất Chúng sinh trưởng và phát triển trên các loại thực phẩm Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin, một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dùng trong chăn nuôi làm chất kích thích sinh trưởng

1.1.2 Một sổ nghiên cứu và ứng dụng của giống Bacillus ở VN và trên thế giới

Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng vào rất nhiều các lĩnh vực sản

xuất khác nhau để phục vụ cho đời sống của con người như :

Bacỉllus để sản xuất ra các enzym có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm

như amylase dùng để đường hóa tinh bột v.v

1.1.2.3 Dược phẩm và y tế [16]

Trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi, công nghệ vi sinh vật cũng tạo ra được nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu, nhất là những bệnh nhiểm

khuẩn như : kháng sinh như penixilinase sản xuất từ Bacỉllus subtilis.

1.1.2.4 Nông nghiệp và đời sống [35]

Trong trồng trọt các chất hoạt động do vi sinh vật sinh ra có thể dùng làm

Tên Enzym

Mã số ECNguồn

Nội bào(I) / Ngoại bào (E)

Sảnlượng Ngành ứng dụng

Glucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacỉllus I ++ Fructose syrupPenicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - Pharmaceutical

■>

(N guôn http ://www lsbu ac uk/biology/enztech/sources html)

thuốc trừ sâu và bảo vệ thực vật như Bacỉllus thuringiensỉs gây bệnh cho côn trùng

và các chất trao đổi có tính độc của nó được dùng như những chất diệt côn trùng đặc hiệu

1.1.2.5 Bảo vệ môi trường [23]

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vi chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất Nhờ có

các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được thải ra do

hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy

1.1.3 Hệ enzỉm của vỉ khuẩn Bacilỉus

Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzim có hoạt tính cao như protease,

amylase, xenlulase

1.1.3.1 Protease

Protease là enzim xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid[-CO-NH-] giữa các loại axit amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptid) thành axit amin

Protease là một nhóm enzim phân giải protein (gồm proteinaza, peptidaza, desaminaza ) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào

Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống

1.1.3.2 Amylase

Amylase là các enzim xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyoza tưomg tự như dextrin, glucogen Có hai loại amylase là: a-amylase, P-

amylase và glucoamylase tuy nhiên các chủng Bacỉllus thuờng chỉ có khả năng

tổng hợp amylase còn không tổng họp đuợc P- amylase và glucoamylase [9] amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết a-1,4 glucozit nội mạch ở bất kì vị trí nào trong phân tử tinh bột với cơ chất là amyloza a- amylase cho sản phẩm thủy

a-phân chủ yếu là maltoza (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) với cơ chất là amylopectin, a-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 không thủy phân liên kết 1,6

Trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao

nhưng lại sinh ra a-amylase chịu nhiệt cao

1.1.3.3 Xenlulase

Xenlulase là một phức hệ enzim phức tạp xúc tác cho sự thủy phân

xenlulose thành xenlobiose và cuối cùng thành glucose

Một phức hệ enzim xenlulase gồm 3 enzim chủ yếu đó là:

• Endogluconaza hay CMC-ase: là enzim tấn công chuồi xenlulose một cách tùy tiện và phân hủy liên kết P-1,4 glucozit

• Enxogluconase hay xenlobiohydrolase: giải phòng xenlobiose hoặc glucose

từ đầu không khử của xenlulose, tác dụng yểu lên CMC, nhưng tác dụng mạnh lên xenlulose vô định hình hoặc xenlulose đã được phân hủy một phần

• P- glucozidase hay xenlobiose : thủy phân xenlobiose và các xenlodextrin khác hòa tan trong nước

1.2 Enzim protease

1.2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35]

Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu tuy nhiên, việc ứng dụng enzim trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy

Từ thế kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men Vanhelmont, người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất khí khác với không khí trong quá trình lên men

Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóa học

Năm 1787, Pabroni cho rằng bản chất quá trình lên men và sự phân giải một

chất này bởi một chất khác là “ferment”.

Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzim

Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được nghiên cứu sớm hơn tất cả Các protease ở động vật được nghiên cứu sớm nhất

• Từ thể kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt

• Năm 1836, Schvvann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch

vị Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzim này

• Năm 1857, Corvisar đã tách được tripsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm, những chế phẩm này vẫn còn lẩn nhiều enzim và protein khác

• Năm 1861, Brucke đã tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết

• Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colodion đã tách được tripsin với amylase tụy tạng

• Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin)

Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu về protease trong máu Schmidt (1869- 1872) đã nêu giả thuyết rằng trong máu có enzim íibrin tham gia vào quá trình làm đông máu Tác giả cũng đã tách enzim này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm thu được

có tác dụng làm íibrinogen đông lại nhanh chóng

Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn

• Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ hạt của một

số loại hạt đậu đều có hoạt tính phân giải protein

• Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease ở thực vật Ồng thấy rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (lOOg/cây) gọi là papain

• Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptid hydrolase khác như:

■ Bromelin protease có trong các phần khác nhau của cây dứa (Willstatter, Grassmanm, Ambros 1926)

■ Fixin protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938)

Trong khi đó các protease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ năm

1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong vài chục năm sau đó, số công trình nghiên cứu protease của vi sinh vật đã phát hiển nhanh chóng Một số công trình thu protease từ vi sinh vật như:

Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease với số lượng lớn Các enzim này có thể ở trong tế bào (nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy (ngoại bào)

Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease tương đối ly tưởng vì nó có khá nhiều ưu

Subtilizin A (Bacỉllus subtìlìs) Guntelberg và Ottensen 1950

Protease kiềm (Aspergiỉỉus oryzae) Crewther và Lennox 1950

Aspergilopeptidase A ( Aspergillus satoi) Yoshida 1956

Protease kiềm (Pseudomonas aeruginosa) Morihara 1957

Subtilopeptidase c ( Bacỉllus amyỉoỉique/aciens ) Hagihara và cộng sự 1958

Keratinase (Streptomyces fradỉaè) Nickerson, Durand 1963

Elastase (Pseudomonas aeruginosa) Morihara Tsuzuki 1965

Protease trung tính II (Bacỉllus amyỉosacchariticus) Tsuru và cộng sự 1966

Protease kiềm ( Apergillus sydowi) Danno, Yoshimura 1967

điểm so với các nguồn khác như động vật và thực vật.

1.2.2 Phân loại và các đặc điểm của protease [9], [12], [17]

Protease là enzim thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH của phân tử protein và peptid thành các axitamin tự do và một ít peptid khối lượng phân tử nhỏ

Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất Hiện nay có nhiều cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì

I.2.2.I Theo phân loại quốc tế các enzỉm thuộc nhóm này được chia thành

4 phân nhóm phụ

■ Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ của mạch polypeptid

■ Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu

cacbon của mạch polypeptid

■ Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid

■ Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

1.2.2.2 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzỉm (Barrett-1984)

Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhấtcó vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzim

■ Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Các protein serine này thường hoạt động ở vùng pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng

■ Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của axit amin cystein ở trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động của enzim, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học

■ Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (- COOH) trong trung tâm hoạt động Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng

pH là axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME)

và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng thơm hoặc axit amin

kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân

■ Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm hoạt động của chúng có những ion kim loại Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính

1.2.2.3 Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease

Dựa vào pH hoạt động của các protease người ta chia nó ra thành 3 loại:

■ Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8

■ Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9

■ Protease trung tính

Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất vi cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein, hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau

1.2.3 Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vỉ sinh vật [1], [9], [14], [15]

Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những enzim ngoại bào Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzim rất giống nhau về hình dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nên rất khó tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzim khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt

để và đa dạng Protease do vi khuẩn tổng họp có khả năng chịu được nhiệt độ cao hơn các nguồn khác

Protease là loại enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp V.V Ở nước ta các nghiên cứu về protease được bắt đầu từ những năm 60

I.2.3.I Trong công nghiệp thực phẩm

Protease của vi khuẩn được sử dụng trong quá trình chế biến cá Ở mang cá, đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất phong phú Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá .protease có trong ruột cá thủy phân một phần protein của cá Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ làm tăng hương vị của sản phẩm

Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt sau khi chế biến Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng hương vị thịt

Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác

Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da và để sản xuất thức ăn kiêng

Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat Protease làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat khác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thể một phần renin Vì thể, ta có thể

giảm giá thành trong sản xuất phomat Protease này có thể thu từ Bacillus

mesentericus.

Dùng protease của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu Nó cũng được sử dụng trong sản xuất chao và các dịch thủy phân

1.2.3.2 Trong công nghiệp nước giải khát

Protease được sử dụng để làm trong bia và nước quả Được sử dụng trong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase do

đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột

1.2.3.3 Trong công nghiệp thuộc da

Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả naăng tách lông

ra khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm và sạch lông hơn.

1.2.3.4 Trong mỹ phẩm

Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn các loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như: vết máu .khá tốt

1.2.3.5 Trong nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng protease để xử lý sơ bộ thức ăn

1.2.3.6 Trong nghiên cứu khoa học

Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein

1.2.3.7 Trong công nghiệp dược phẩm và y học

Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzim Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để chữa bệnh nghẽn tỉnh mạch Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết thương, các

0 viêm, làm thông đường hô hấp

1.2.3.8 Trong xử lý rác

Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượng chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rất nhanh Theo tính toán của công ty công trình đô thị I, moi ngày người Hà Nội thải

ra khoảng 1500m3 rác Mỗi năm, một người dân ở thành phố Hồ Chí Minh trung bình thải ra 160 kg rác Như vậy, khối lượng rác mà thành phố thãi ra mỗi năm là

360000 tấn.

Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổ vào các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc chất gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoa màu Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó thương hàn tồn tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày Rác không được dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường phố, tạo môi trường tốt cho ruồi muổi và các loài trung gian truyền bệnh khác phát triển

Hiện nay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt cho nhà mát phát điện hoặc nhà mày hơi công nghiệp Khi đốt như thế các chất thải là các chất tổng hợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như S02, S03, P205, NO, N02, CO gây hại cho sức khỏe

Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý rác bằng con đường sinh học Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn protein động vật

và thực vật có trong rác hữu cơ Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống, đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây trồng, trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật

Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50 °c Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra nhanh hơn

người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces, Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium.

Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu cơ

cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hóc môn) công suất 5 tấn/ ngày Tại đây ủ phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật Các điều kiện bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác

Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt động của vi sinh vật làm cho rác hoại kĩ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng

1.2.3.9 Trong kỹ nghệ phim ảnh

Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan khác nhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp Nó sẽ phân giải và hòatan lớp nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quí

1.3 Thu nhận enzỉm từ vỉ sinh vật

1.3.1 Ưu điểm của việc sản xuất enzỉm từ vỉ sinh vật [9], [16]

Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzim có những ưu điểm sau:

- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzim từ vi sinh vật vì quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng họp enzim của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào điều kiện bên ngoài

- Chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó việc sản xuất enzim từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 - 60 giờ

- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzim từ vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzim với số lượng lớn

- Giá thành của enzim sản xuất từ vi sinh vật thấp Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường đơn giản và rẻ tiền

- Các enzim thu được từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

- Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzim khác nhau

1.3.2 Lý thuyết về sinh tồng họp enzỉm cảm ứng

Hiện nay người ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng họp enzim trong khi sản xuất Các enzim tham gia thủy phân được vi sinh vật tổng họp là những enzim

cảm ứng Hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzim được Monod-Jacob tìm ra vào năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rất rõ ở vi sinh vật Tác động của các yếu tố bên ngoài lên tế bào vi sinh vật thường là tác động trực tiếp, tế bào vi sinh vật phản ứng lại các tác động này thường cũng rất nhanh Chính vì thế ta có thể sử dụng các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH và đặc biệt là cơ chất để điều khiển quá trình sinh tổng họp enzim của vi sinh vật.

Các enzim thủy phân một chất nào đó và khi có mặt chất đó trong môi trường nuôi cấy thì lượng enzim này được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với bình thường khikhông có cơ chất, được gọi là enzim cảm ứng Các chất được đưa vào môi trường nuôi cấy để kích thích tổng hợp ra enzim cảm ứng được gọi là cơ chất cảm ứng Cơ chất cảm ứng thường được coi là yểu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng họp enzim

Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng họp enzim cảm ứng của vi sinh vật cũng sẽ tăng dần Nhưng nếu ta vẫn cứ tiếp tực tăng nồng độ cơ chất lên đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chựng lại hoặc giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên

Như vậy, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim bằng cơ chất cảm ứng cần chú ý:

- Có gen tương ứng trong nhiểm sắc thể của tế bào

- Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phần tử enzim đó

- Năng lượng cần thiết dùng cho tổng họp enzim

- Muốn thu nhận enzim cảm ứng nào thì phài cho cơ chất cảm ứng của enzim đó vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng nhất định Nếu vượt quá liều lượng này sẽ làm cho quá trình tổng họp enzim giảm Do đó, không phải cho càng nhiều cơ chất thỉ khả năng sinh tổng hợp enzim sẽ càng cao.Bình thường khi không có cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm có trong tể bào sẽ

tương tác với gen điều khiển làm cho quá trình tổng họp enzim bị ức chế Khi ta cho cơ chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm và các gen tương ứng Enzim được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất Khi đó chất kìm hãm sẽ không bi phong tỏa nên tương tác với gen điều khiển ức chế quá trình tổng hợp Như vậy, muốn enzim được tổng họp ta phải luôn cho cơ chất cảm ứng vào môi trường Trong công nghiệp sản xuất enzim cần phải lựa chọn những cơ chất cảm ứng thích họp

và xác định nồng độ tối ưu của nó trong mội trường để có hiệu quả sinh tổng hợp cao nhất

1.3.3 Chọn giống vỉ sinh vật có khả năng sinh enzim cao

Không phải tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sinh enzim như nhau và ngay cả những chủng của cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng họp enzim Vì vậy người ta cần phải lựa chọn trong số rất nhiều loại vi sinh vật để có được những chủng có hoạt lực cao trong việc tạo ra các enzim thuần khiết Trong số đó Bacillus subtilis đã trở thành nguồn chủ yếu trong việc sản xuất ra nhiều loại enzim khác nhau được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kĩ thuật

Ngoài ra để nâng cao hoạt tính của enzim người ta còn tiến hành các biện pháp gây đột biến để tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền của

vi sinh vật tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao hơn hẳn chủng ban đầu

1.3.4 Ảnh hưởng của yếu tổ môi trường lên khả năng sinh enzỉm

Quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau Đe thu nhận được với hiệu suất cao nhất khi phân giải protein bởi sinh khối của

vi sinh vật, ta cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy Muốn vậy ta phải nghiên cứu kĩ các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của vi sinh vật

1.3.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát hiển của vi sinh vật, khả năng sinh tổng họp enzim của vi sinh vật, tính chất của enzim được tổng họp Tùy từng loài vi

sinh vật nhiệt độ thích hợp có khác nhau Các loại mốc phát triển thích họp ở

22°c - 32 °c còn các loại vi khuẩn phát triển thích hợp ở 35 °c - 55 °c Nói chung, đa số vi sinh vật tổng họp protease không bền nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích họp

1.3.4.2 ĐộpH

Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng họp enzim ở vi sinh vật và hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Đối với nấm mốc pHop từ 6-6,5 và đối với vi khuẩn pHop

trung tính từ 6,6-7,4 Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự phát triển và sự tích lũy protease của môi trường của vi sinh vật Điều này thể hiện khá rõ ở các loài thuộc giống

Bacỉllus, pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá

trình phát triển của vi sinh vật, pH ban đầu thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật là đối với nấm mốc pH từ 3,8-5,6, đối với vi khuẩn là 6,2-7,4 Trong quá trình nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm Đối

với các loài thuộc giống Bacillus, pH thường chuyển về phía kiềm Nhiều khi có

thể căn cứ vào pH của môi trường sau khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease được tích lũy trong môi trường Theo tác giả Lê Ngọc Tú- La văn Trứ pH môi trường ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp Do đó, nếu giữ cho

pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định, chiếm ưu thế trong môi trường

1.3.4.3 Ảnh hưởng của độ thông khí

Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng họp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật Trong một số trường hợp thiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease.Sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự tổng

hợp protease Lượng oxi thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật có khác nhau Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng họp các protease khác nhau.

1.3.4.4 Độ ẩm

Độ ẩm của môi trường lên men cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt Thông thường thì các loại vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hon nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60-70%

1.3.4.5 Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh tổng hợp enzim cực đại là trong khoảng 36-48 giờ Tuy nhiên để phân giải protein đạt hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzim phân giải đối với cơ chất tự nhiên

1.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

Ngoài các yếu tố của môi trường thì thành phần và tỷ lệ của các chất dinh dưỡng

có mặt trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp

protease của vi khuẩn Để tăng lượng protease cho môi trường cần lựa chọn nguồn c, N,

muối khoáng thích họp và đặc biệt cần sử dụng chất cảm ứng

1.3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn c thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các gluxit như: mono,di,

polysaccarit (tinh bột), Đặc tính và tác dụng của nguồn Cacbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật Nguồn Cacbon tự nhiên thường được dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng Nồng độ gluxit thích họp cho quá trình sinh tổng họp protease cũng thay đổi tùy loài vi sinh vật

1.3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn Nỉttf

Các chất có thể dùng làm nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối hữu cơ (amon, nitrat) Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng

cả nitơ của HN03, HN02 Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tùy thuộc vào lượng nitơ của nó có thể được tách ra dễ dàng dưới dạng NH3 Nguồn Nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng họp protease Vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là các loại bột khác nhau (có chứa gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein Trong các nguyên liệu này đều có axit amin tự

do tương đối thấp Các axit amin có thể làm tăng hoặc giãm quá trình sinh tổng hợp protease như Cystein sẽ kìm hãm khả năng sinh protease axit của Aspergillus Tác dụng kìm hãm của axit amin có thể là do khi có axit amin cần thiết tế bào có thể sử dụng được thì không cần phải tổng họp protease nữa Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease Nguồn nitơ

vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thường là (NH4)2 PO4 Các muối clorua, sulphate, nitrat amon thường có ảnh hưởng không tốt dấn quá trình tổng hợp protease Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: Pepton, casein, albumin, bột đậu tương Trong các nguồn này thì pepton ở nồng độ thấp thường là chất cảm ứng tốt cho quá trình tổng hợp protease

1.3.5.3 Ảnh hưởng của khoáng chất

Các họp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật vì chúng làm thay đổi trạng thái hóa keo của tế bào chất Photpho và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng đáng kể lên quá trình sinh tổng hợp protease Các phophate vô

cơ có ảnh hưởng xấu lên quá trình tổng hợp protease axit Tuy nhiên, KH2PO4

thường có ảnh hưởng tốt lên quá trình tổng hợp các enzim thủy phân nhờ tác dụng đệm của nó Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình tổng họp protease,

nó có vai trò điều hòa quá trình sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật Trong tế bào vi sinh vật người ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khoáng khác như Magiê, natri, sắt, Các vi sinh vật có thể lấy các chất khoáng này từ môi trường hay do chúng ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số dạng muối khoáng hoặc có khi

chúng có sẵn trong nguyên liệu pha môi trường.

1.3.5.4 Ảnh hưởng của các nguyên tổ vỉ lượng, NaCl, vỉtamỉn, môt sổ

nguyên tổ khác

Các chất này cũng có ảnh hưởng đến lượng protease được sinh ra trong môi trường nuôi cấy bởi vì dưới tác dụng NaCl có thể làm thay đổi khả năng thẩm thấu của tế bào Một số kim loại (kẽm, sắt, mangan, magiê ) là các chất hoạt hóa enzim Chúng tham gia cấu tạo enzim và các enzim này được gọi là metaloenzim

1.3.6 Những phương pháp nuôi cấy vỉ sinh vật để sản xuất enzỉm [15]

Công nghệ sản xuất enzim hiện nay trên thế giới áp dụng hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm

I.3.6.I Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng Các chất dinh dưỡng này thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, các phế liệu của ngành công nghiệp thực phẩm hoặc hỗn họp của nhiều chất Trong môi trường dinh dưỡng ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự tổng họp enzim nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng

bổ sung nguồn nitơ, photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch nấm men Để đảm bảo độ xốp môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10-20% Trước khi gieo cấy, môi trường cần được thanh trùng để đảm bảo không bị nhiểm vi sinh vật lạ Để nuôi bề mặt người ta thường dùng khay để trong phòng kín có hút gió

Quá trình nuôi bề mặt thường kéo dài từ 33-48giờ và trãi qua 3 giai đoạn:

❖ Giai đoạn 1: bắt đầu từ khi cấy giống đến giờ thứ 10-12 Trong giai đoạn này xãy ra sự trương nở của bào tử và xuất hiện cuống nấm, chưa hình thành enzim Không đòi hỏi phải thông khí nhiều

♦♦♦ Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 10-18 giờ Vi sinh vật phát triển nhanh,

hô hấp mạnh Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để

phúc vụ cho quá trinh trao đổi chất trong tế bào làm cho nhiệt độ môi trường tăng.

❖ Giai đoạn 3: kéo dài từ 10-20 giờ, quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, nhiệt lượng tạo ra giảm, quá trình tạo thành enzimvẫn tiếp tục Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng giống mà thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzim tối đa

Phưoug pháp này có ưu điễm là nồng độ enzim thu được cao hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm, Khả năng nhiểm trùng thấp, tốn ít điện năng, có thể sấy khô nhanh chóng đưa vào sản xuất mà không cần phải qua bước tách chiết enzim Tuy nhiên, nó cũng có nhược điễm là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa, tự động hóa, cần nhiều lao động thủ công

I.3.6.2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có sục

khí và khuấy đảo liên tục, nguồn c thường dùng trong phương pháp này là tinh bột,

rỉ đường còn nguồn N thường là cao ngô, dịch men bia thủy phân ngoài ra trong thành phần của môi trường cũng cần bổ sung thêm các chất khóang Người ta cần thanh trùng môi trường nuôi cấy trước khi cấy giống bằng cách sục hơi trực tiếp ở nhiệt độ cao và trong thời gian phù họp và phải được dịch hóa sơ bộ để tránh trường hợp tinh bột hồ hóa làm môi trường sệt lại Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt

độ thích họp thì có thể tiến hành cấy giống, giống được cấy vào thường ở hệ sợi chứ không phải dạng bào tử Quá trình nuôi cấy cần khuấy đảo và sục khí liên tục Thời gian nuôi cấy kéo dài từ 1-4 ngày tùy loại giống Trong nuôi cấy chìm việc khống chế pH, chế độ hiếu khí, bảo đảm điều kiện vô trùng là những điều kiện quan trọng

Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm diện tích sản suất, dễ cơ giới hóa

tự động hóa, enzim thu được tinh khiết hơn Tuy nhiên, phương pháp này lại có hạn chế là lượng enzim thu được có hoạt tính không cao, tốn điện năng do cần sục khí liên tục và nếu bị nhiễm trùng thì phải bỏ tòan bộ khối môi trường

1.3.7 Thu nhận và tính sạch enzỉm protease từ môi trường nuôi cấy [15]

Các chế phẩm enzim được sử dụng trong thực tế ở nhiều dạng khác nhau.Trong một số trường hợp, enzim có thể được sử dụng ở dạng thô mà không cần phải tách chiết tinh khiết như đưa vào bột giặt, thuộc da v.v Một số khác, người ta lại cần

sử dụng các enzim tinh khiết ở nhiều mức độ khác nhau nên phải tách chiết, tinh chế Enzim rất dễ bị mất hoạt tính, vì vậy khi tinh chế enzim cần tránh gây biển tính protein làm ảnh hưởng đến họat tính của enzim nên cần tiến hành nhanh trong điều kiện nhiệt

độ thấp, độ pH phù hợp Việc thu chế phẩm enzim cần phải qua các bước sau:

1.3.7.1 Thu dịch enzỉm

Đối với trường họp enzim nằm trong tế bào ( phương pháp bề mặt) thì cần phải phá vở tế bào bằng cách: nghiền trong máy đồng hóa, nghiến với thủy tinh, cát v.v Sau đó chiết xuất enzim bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, muối trung tính để thu dịch enzim và loại bỏ bã sinh khối

Đối với trường hợp enzim tiết ra môi trường ( phương pháp chìm) thí tách sinh khối và các chất cặn bã ra môi trường bằng cách ly tấm hoặc ép lọc với các chất trợ lọc

1.3.7.2 Thu chế phẩm kỹ thuật

Chế phẩm enzim kỹ thuật là chế phẩm enzim chưa tinh chế có thể chứa 1 hoặc 1 vài enzim chủ yếu ngoài ra trong đó còn có các protein không hoạt động, các chất ổn định Thường được dùng trong công nghiệp và nông nghiệp

Đe thu được chế phẩm kỹ thuật người ta tiến hành cô đặc các dịch enzim trong thiết bị có độ chân không cao Sau đó:

- Hoặc tiếp tục cô đặc ở nhiệt độ cao 40-45°C bổ sung thêm các chất bảo quản NaCl, glixerol và thu chế phẩm

- Hoặc bổ sung thêm các chất ổn định rồi đem sấy ở nhiệt độ cao và thu chế phẩm

- Hoặc cho kết tủa enzim bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn,

rồi cho thêm chất ổn định, đem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm.

1.3.7.3 Thu chế phẩm enzỉm tính khiết

Việc tinh chế enzim có thể tiến hành qua nhiểu phương pháp Đầu tiên loại các protein không hoạt động khỏi dịch enzim bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt và tách chúng ra bằng cách ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa Có thể phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu

cơ, muối, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu những phần có hoạt lực enzim cao nhất

Sau đó cần làm sạch và sấy khô ( chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa) các chế phẩm enzim để có thể sử dụng lâu dài Việc thu che phẩm enzim tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể thường rất khó khăn và tốn kém nên chỉ dùng trong y học hoặc trong nghiên cứu

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng

Các chủng vi khuẩn Bacỉllus phân lập được từ đất vườn.

2.1.2 Vật liệu

2.I.2.I Thiết bị

Thuốc nhuộm tím Gentian Thuốc thử folin

2.2 Môi trường

2.2.1 Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy (Môi trường MPA) [15]

Khử trùng latm/30 phút

2.2.2 Môi trường đỉnh tính khả năng sinh tồng họp protease [12],[17]

2.2.3 Môi trường thử hoạt tính của enzym protease [15]

2.4 Các phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập

Trước khi lấy mẫu các dụng cụ lấy mẫu được thanh trùnh bằng cồn Mẩu được lấy từ năm địa điểm khác nhau và trộn đều trước khi xác định (lấy khoảng lOg đất và 90 ml nước đã vô trùng cho vào bình tam giác 250 ml)

Đun dung dịch đất cách thủy 1 0 - 1 5 phút ở 80°c để các vi khuẩn không

sinh bào tử sẽ chết, số có bào tử còn lại sẽ sống Do vậy Bacỉllus sẽ có chủ yếu

trong dịch đun nóng

Đổ một lượng dung dịch đất vào hai đĩa petri: Một đĩa để một vài lát khoai

tây, một đĩa để cỏ khô đã được cắt ngắn thành đoạn Sau đó đưa đi nuôi cấy ở 37° c

trong 24 đến 48g thấy xuất hiện trên bề mặt khoai tây váng màu xám nhạt và ở cỏ khô xuất hiện váng màu trắng đục

2.4.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền

Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi

Lọc trong trước khi dùng

Môi trường cơ sở

trường thạch nghiêng trong ống nghiệm là môi trường giữ giống.

Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 37°c, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4°c giữ giống

Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.2.4.3 Một sổ phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vỉ khuẩn

Chủng được quan sát trong môi trường rắn MPA bằng mắt thường và kínhhiển vi quang học Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc

2.4.3.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA

♦ Khả năng phát triển của khuẩn lạc

♦ Bề mặt khuẩn lạc

♦ Màu sắc khuẩn lạc

2.4.3.2 Phương pháp làm tiêu bản tế bào sổng

Được sử dụng để xác định hình dáng, sự sắp xếp của các tế bào cũng như khả năng di động của chúng

Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá dở, nhỏ

một giọt nước sạch vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật trên môi trường đặc, đặt vào cho phiến kính, hòa nhẹ để tạo dịch huyền phù Đậy nhẹ lá kính lên giọt dịch để tránh tạo bọt khí Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô

Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải cạnh ngọn lũa đèn cồn Đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật kính x40

2.4.3.3 Phương pháp nhuộm gram [10]

Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi các đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn

Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một

quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magiê của axit riboleic Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatinviolet, oryatanviolet, metylviolet) chịu được dưới tác dụng của cồn (không bị mất màu dưới tác dụng của cồn) Những

vi khuẩn không bị mất màu là những vi khuẩn gram(+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu là vi khuẩn Gram (-)

Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy

vô trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước

Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính

Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó đổ thuốc đi và háng bằng nước cất Sau đó rửa bằng cồn 96° trong thời gian khoảng 30-40 giây Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi

Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì

đó là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm Chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) để tiếp tục nghiên cứu

2.4.3.4 Phưoiig pháp xác định sự hình thành bào tử [10]

Để xác định sự hình thành bào tử ta sử dụng phưomg pháp sốc nhiệt:

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối

tế bào được hòa vào nước muối sinh lý sốc nhiệt ở 80-85°C trong 15 phút Sau

khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm

37°c khoảng 24g Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng

hình thành bào tử

Ta cũng có thể tiến hành nhuộm bào tử theo phương pháp sau: cố định mẩu trên phiến kính sau đó nhỏ lên mẩu thuốc nhuộm xanh metylen hơ nóng trong 3 phút ( chú ý không để mẩu bị khô nếu khô phải nhỏ thêm) Rữa kỹ bằng nước, nhỏ tiếp thuốc nhuộm đỏ trung tính trong 1 phút rồi rữa kỹ Hong khô phiến kính Quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại X 1000 lần Tế bào chất

có màu hồng, bào tử bắt màu xanh

2.4.4 Phưong pháp xác định sự sinh trưởng của vỉ khuẩn theo mật độ quang

Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang học được sử dụng rộng rãi Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lững Để đánh giá tốc độ phát hiển của vi khuẩn ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical density) Tất cả các thí nghiệm được tiến hành đo ở bước sóng 620 nm (OD62o)

Cách tiến hành: chủng giống được nuôi ở 37°c rồi cấy vào môi trường

MPA lỏng Đặt các bình trụ này vào máy lắc với nhiệt độ như trên với tốc độ 200 vòng /phút trong 24h Sau đó lấy dịch vi khuẩn nuôi trong bình này để đo OD bằng

máy so màu ở bước sóng 620 nm với kính lọc màu đỏ Chú ý các thao tác lấy dịch

để đo OD phải được tiến hành trong tủ cấy vô trùng

2.4.5 Phưong pháp xác định hoạt tính catalase

Nguyên tắc: catalase xúc tác phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide

(H202) thành H20 và phóng thích phân tử ôxy (có hiện tượng sủi bọt) Hầu hết các

vsv hiếu khí đều có enzym catalase giúp loại trừ sự tích tụ chất độc đối với tế bào

là H202 được tạo ra trong chuỗi hô hấp

Cách tiến hành: nhỏ một giọt dung dịch H202 3% lên trên khuẩn lạc, hoặc chuyển một lượng vsv lên lam rồi thử bằng dung dịch H202 3% Dựa vào hiện

tượng có sủi bọt (+) hay không (-) kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng, từ

đó cho biết mỗi chủng có phải là vi khuẩn hiếu khí hay không

Chọn các chủng có hoạt tính catalase (+) hiếu khí để tiếp tục nghiên cứu.2.4.6 Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng

Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối khác nhau 5g, lOg, 15g cấy

vi sinh vật vào nuôi các bình này trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 24h

Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng

2.4.7 Xác định khả năng thủy phân proteỉn [10]

Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được

Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có chứa cơ chất

cảm ứng là casein ở 37°c trong khoảng 24 đến 48h trên máy lắc 200 vòng/phút Sau 24 giờ lấy dịch nuôi đem li tâm 5000 vòng/phút lấy dịch loại bỏ cặn

Đổ môi trường đặc có chứa casein với nồng độ tương tự vào đĩa petri Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lổ để đục lổ trên môi trường tạo thành giếng

Dùng pipetMan hút dịch li tâm cho vào giếng Để đĩa trong tủ lạnh 3-4 tiếng để dịch khuyếch tán 37°c Sau 24giờ dùng thuốc thử HgCl2 đổ lên bề mặt thạch Neu có enzim nó sẽ tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2 Các vùng chưa bị phân giải sẽ có màu trắng đục

Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và

đo đường kính của giếng (d)

Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều

2.4.8 Chạy PCR để xác định danh chủng vỉ khuẩn được chọn

Trong 3 chủng chọn 1 chủng có khả năng sinh enzym và có tốc độ sinh trưởng tốt nhất cho chạy PCR để định danh Phương pháp thực hiện: giải trình tự gen 16S rARN và tra cứu trên Blast search

Thành phần của phản ứng PCR:

Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên

biệt Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác vi khuẩn

Cách thực hiện:

Bước 1: lấy một ít khuẩn lạc được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch

huyền phù tiến hành tách chiết AND bằng cách: đun sôi 5phút, để lạnh 5phút, ly tâm 5phút lấy dịch nổi

1 ox PCR buffer (Invitrogen)

20 mM dNTPsPrimer 1 (20mM) (mồi xuôi)Primer 2 (20mM) (mồi ngược)

50 mM MgCl2 (invitrogen)Taq

ADN khuôn mẩu H20 đến

: 12pl : 1.25

1.25

ịủ 4pl

0.5 pl 0.5pl 80.5

Bước 2: cho dịch nổi thu được, primer, tad,dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuyếch đại gen 16s rARN Phản ứng PCR gồm 3 bước:

• Biến tính: trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-95°C trong vòng 30s-lphút

• Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70°C và kéo dài 30s-lphút

• Tổng họp: nhiệt độ được nâng lên đến 72°c để DNA polymerase hoạt động tốt

nhất Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của hình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút

Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR Bước 4: Sản phẩm PCR được tính chế bằng kít QIAEXII của Qiagen Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16S Các phương pháp nhằm xác định trình

tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc:

• Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide

• Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng họp cũng là sự hình thành một tập họp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide

Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình

tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di

Bước 6: tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự, điện di mao quản trên

CEQ8000 Xuất kết quả giải trình tự để phân tích Đăng nhập vào NCBI BLAST

SEARCH xác định tên vi khuẩn cần định danh.

2.4.9 Phương pháp thu chế phẩm enzym thô [16]

Sau 40h nuôi cấy tiến hành chiết tách protease ngoại bào ở vi khuẩn bằng cách: Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới)

2.4.10 Xác định hoạt độ của enzym protease theo phương pháp Anson[8]

Nguyên tắc: Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của

protease tạo sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic (TCA) và một số các axit amin Các peptid và sản phẩm tạo thành có chứa Tyrosin, triptophan khi cho tác dụng với thuốc thử Folin tạo dung dịch có màu Cường độ màu tăng cùng với nồng độ chất đem phản ứng, cường độ màu được ghi nhận bằng giá trị mật độ quang

OD ở X = 660nm xác định lượng tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.

Dung dịch TCA 10% : hòa tan lOg TCA trong nước cho đủ lOOml

Dung dịch NaOH 0,5N : Hòa tan lOg NaOH trong nước cho đủ 500ml

Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 :2)

Dung dịch HC10,2N : trộn 4,25 ml HC1 đậm đặc với nước cho đủ 250ml Dung dịch tyrosin 20 mM/1 : khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HC1 0,2N vừa đủ 50ml