1 ox PCR buffer (Invitrogen)
2.4.12.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vỉ khuẩn
và tạo enzym của các chủng vỉ khuẩn
Đổ vào các bình tam giác có thể tích 250ml, 500ml dung địch lên men có thể tích khác nhau 50, 75, lOOml.. để ở nhiệt độ thích họp trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian thích họp. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng. Đo pH, hoạt độ protein để chọn độ hiếu khí thích họp
2.4.13. Phương pháp tách và thu nhận enzym protease bằng dung môi hữu Ctf
Tiến hành tủa với các tác nhân tủa: ethanol 96°, acetone, muối sunfatamon bão hòa, ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30- 45phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.
♦> Đổi vói tác nhân tủa là aceton và ethanol 96°
Cơ chế: Khi cho dung môi vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly
của dung dịch, kết quả là làm giảm khả năng tan của nước bao quanh protein.
Nguyên nhân cơ bản của sự tạo quần thể protein có thể do các lực tỉnh điện , lực VanderWaals. Người ta thấy rằng, ở gần điểm đẳng điện của protein, sự lắng diễn ra ở nồng độ dung môi hữu cơ thấp hơn. Khi cho dung môi hữu cơ vào để kết tủa có thể xãy ra hiện tượng biến tướng không thuận nghịch protein. Các phân tử protein chỉ thể hiện hoạt độ enzim khi nó tồn tại trong cấu trúc không gian nhất định, sao cho các gốc phân cực phân bố trên bề mặt của phân tử protein , còn các gốc kỵ
nước không phân cực thì nằm trong phân tử .
Khi hằng số điện ly của môi trường giảm, phân tử protein có thể tự tháo gở và tạo thành dạng không hoạt động, trong đó các gốc kị nước lại tiếp xúc với dung môi. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình này. Do đó, thực hiện quá trinh này phải ở trong điều kiện nhiệt độ thấp, thường ở 4 - 10 °c.
Tiến hành:
Bước 1: Thu dịch enzim từ canh trường ( mục ) giữ lạnh dịch enzim và dung môi hữu cơ ( aceton, ethanol 96°) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 - 4°c. Khảo sát với tỷ lệ
Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzim: cồn) Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzim : aceton)
Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzim và khuất đều, giữ ở nhiệt độ lạnh 30 - 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ < 50°c, bảo quản lạnh.
❖ Đổi với tác nhân tủa là muối sultate amon (NH4)2S04
Cơ chế: Khi ta muối trung hòa ở nồng độ cao vào dung dịch có chứa protein thì protein sẽ tạo ra kết tủa. Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa.
Các muối sunfat, trong đó (NH4)2S04 được dùng nhiều nhất vì chúng rất dễ tan trong nước ngay ở nhiệt độ thường, giá thành lại rất rẻ, nhưng gặp khó khăn khi thu hồi, vì chúng có khả năng lẩn trong tủa protein.
Tiến hành:
Bước 1: Thu dung dịch enzim từ dịch nuôi cấy ( mục)
Bước 2: Tiền hành tủa: Cho g muối vào dung dịch enzim rồi khuấy đều, giữ ở
nhiệt độ phòng 45 - 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa.
Bước 3: Chế phẩm enzim thô thu được còn lẫn nhiều muối. Thẩm tích qua
Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường...) khuyểch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzim). Màng thẩm tích thường làm bằng collodion hay celophan.
Bước 4: sấy khô chế phẩm enzim ở nhiệt độ < 50°c, bảo quản lạnh.
Hiệu suất thu nhận H = m/v
Trong đó: m là khối lượng enzim thu được sau khi tủa
V là thể tích dung dịch có chứa enzim trước tủa tính bằng ml. 2.4.14. Phưưng pháp xác định protease kiềm
Lấy chế phẩm protease thu được cho tác động với cơ chất casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7,5,8....Xác định hoạt tính protease của chế phẩm theo phương pháp Anson.
• pH 6,5-8: sử dụng đệm sorensen.
•pH 8.5 - 9.5: sử dụng đệm glyxin - NaOH [13]
2.4.15. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở những
nhiệt độ khác nhau trong dãy nhiệt độ 35°c, ...., 80°c. Chon nhiệt độ tối ưu cho enzim phân giải cơ chất.
2.4.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở nhiệt độ và pH thích họp nhưng thay đổi thời gian protease tác động lên cơ chất casein: 30- 100 phút. Chọn thời gian thủy phân thích hợp cho enzim.
2.4.17. Phương pháp nghiên cứu động học
Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn có khả năng sinh trưởng tốt nhất và sinh enzym protease có hoạt tính cao nhất trong bình tam giác lên men 11. Tiến hành nghiên cứu động học quá trình sinh tổng họp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt lực của enzym.
2.4.18. Phương pháp xử lý sổ liệu thực nghiệm
Sử dụng toán xác suất thống kê để xử lý các số liệu thu được cho ra kết quả.
• Xác định giá trị trung bình