CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU
2.4.3.3.Phương pháp nhuộm gram [10]
Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi các đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn.
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một
quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magiê của axit riboleic. Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatinviolet, oryatanviolet, metylviolet) chịu được dưới tác dụng của cồn (không bị mất màu dưới tác dụng của cồn). Những vi khuẩn không bị mất màu là những vi khuẩn gram(+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu là vi khuẩn Gram (-)
Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy
vô trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính.
Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất. Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó đổ thuốc đi và háng bằng nước cất. Sau đó rửa bằng cồn 96° trong thời gian khoảng 30-40 giây. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi.
Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm. Chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) để tiếp tục nghiên cứu.