CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU
2.4.3.4. Phưoiig pháp xác định sự hình thành bào tử [10]
Để xác định sự hình thành bào tử ta sử dụng phưomg pháp sốc nhiệt: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối tế bào được hòa vào nước muối sinh lý. sốc nhiệt ở 80-85°C trong 15 phút. Sau
khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm
37°c khoảng 24g. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng
hình thành bào tử.
Ta cũng có thể tiến hành nhuộm bào tử theo phương pháp sau: cố định mẩu trên phiến kính sau đó nhỏ lên mẩu thuốc nhuộm xanh metylen hơ nóng trong 3 phút ( chú ý không để mẩu bị khô nếu khô phải nhỏ thêm). Rữa kỹ bằng nước, nhỏ tiếp thuốc nhuộm đỏ trung tính trong 1 phút rồi rữa kỹ. Hong khô phiến kính. Quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại X 1000 lần. Tế bào chất có màu hồng, bào tử bắt màu xanh.
2.4.4. Phưong pháp xác định sự sinh trưởng của vỉ khuẩn theo mật độ quang
Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang học được sử dụng rộng rãi. Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lững. Để đánh giá tốc độ phát hiển của vi khuẩn ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical density). Tất cả các thí nghiệm được tiến hành đo ở bước sóng 620 nm (OD62o)
Cách tiến hành: chủng giống được nuôi ở 37°c rồi cấy vào môi trường
MPA lỏng. Đặt các bình trụ này vào máy lắc với nhiệt độ như trên với tốc độ 200 vòng /phút trong 24h. Sau đó lấy dịch vi khuẩn nuôi trong bình này để đo OD bằng máy so màu ở bước sóng 620 nm với kính lọc màu đỏ. Chú ý các thao tác lấy dịch để đo OD phải được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
2.4.5. Phưong pháp xác định hoạt tính catalase
Nguyên tắc: catalase xúc tác phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide
(H202) thành H20 và phóng thích phân tử ôxy (có hiện tượng sủi bọt). Hầu hết các
vsv hiếu khí đều có enzym catalase giúp loại trừ sự tích tụ chất độc đối với tế bào là H202 được tạo ra trong chuỗi hô hấp.
Cách tiến hành: nhỏ một giọt dung dịch H202 3% lên trên khuẩn lạc, hoặc chuyển một lượng vsv lên lam rồi thử bằng dung dịch H202 3%. Dựa vào hiện
tượng có sủi bọt (+) hay không (-) kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng, từ đó cho biết mỗi chủng có phải là vi khuẩn hiếu khí hay không.
Chọn các chủng có hoạt tính catalase (+) hiếu khí để tiếp tục nghiên cứu. 2.4.6. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng
Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối khác nhau 5g, lOg, 15g... cấy vi sinh vật vào nuôi các bình này trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 24h. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng.
2.4.7. Xác định khả năng thủy phân proteỉn [10]
Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được.
Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có chứa cơ chất
cảm ứng là casein ở 37°c trong khoảng 24 đến 48h trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau 24 giờ lấy dịch nuôi đem li tâm 5000 vòng/phút lấy dịch loại bỏ cặn.
Đổ môi trường đặc có chứa casein với nồng độ tương tự vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lổ để đục lổ trên môi trường tạo thành giếng.
Dùng pipetMan hút dịch li tâm cho vào giếng. Để đĩa trong tủ lạnh 3-4 tiếng để dịch khuyếch tán 37°c. Sau 24giờ dùng thuốc thử HgCl2 đổ lên bề mặt thạch. Neu có enzim nó sẽ tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa bị phân giải sẽ có màu trắng đục.
Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d).
Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều.
2.4.8. Chạy PCR để xác định danh chủng vỉ khuẩn được chọn
Trong 3 chủng chọn 1 chủng có khả năng sinh enzym và có tốc độ sinh trưởng tốt nhất cho chạy PCR để định danh. Phương pháp thực hiện: giải trình tự gen 16S rARN và tra cứu trên Blast search.
Thành phần của phản ứng PCR:
Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên
biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác vi khuẩn.
Cách thực hiện:
Bước 1: lấy một ít khuẩn lạc được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch
huyền phù tiến hành tách chiết AND bằng cách: đun sôi 5phút, để lạnh 5phút, ly tâm 5phút lấy dịch nổi.