Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu

MỞ ĐẦU

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá củavật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là mộtgiải pháp rất hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú vềchủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vậtđường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trongtiêu hoá và hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn

và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đườngruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhànghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệcân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc,gia cầm Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷtrước là sử dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trongthức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, cácnước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi -Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngàycàng trở thành cấp bách Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay làprobiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu íchtrong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng cólợi cho vật chủ

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thịtrường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng.Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinhvật đường ruột của vật chủ bản địa Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chếphẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế Chúng tôi thực hiện

đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản

xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được

các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệutrong nước Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản

xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao củangành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theohướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu

Chương 1 – TỔNG QUAN1.1 Lịch sử và định nghĩa probiotic

1.1.1 Lịch sử probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻmắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻkhỏe mạnh [53]

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng

minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh

vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc

ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn,nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều nàyđược ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life(1908) [53]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuấtmang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo vềprobiotic [26]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩnlactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [27] Cùng năm đó, các nhà nghiên

cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm

bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vikhuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêuhóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thểvật chủ không tự sản xuất ra được [26] Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lênmen – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinalhealth) được sản xuất Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trongnhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ởChâu Âu những năm của thập niên 80 [27]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩmchính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

1.1.2 Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống” Thuật ngữprobiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những visinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) Từ đó đếnnay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinhvật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nướcuống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ Kể từ khi xuất hiện, khái niệmprobiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩađược cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiềutrong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung visinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóatheo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001),probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một sốlượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”

1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi

Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai tròquan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể Do đó, nó là hệ thốngbảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Thêmvào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu vàkhông đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh Khu hệ vi sinh vật đườngruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36]

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng,nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những

“cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001) Theo thời gian, do tiếp

xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính

đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên Số lượng tếbào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần sốlượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995) Số lượng loài có thể lên tới từ400-500 (Tannock, 1999) Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhaucủa đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dàyđơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 cfu/ml chất chứatương ứng) (Jans, 2005)

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý củavật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật Các yếu tố này chịu tác động của môitrường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau Trong số các nhân tố trên, hệ visinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của mộttrong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994) Sựcộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu làtrong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vậtđược xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005)

Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh

vật ruột Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột

được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí

(Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các

nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng Trạng thái mà các nhómnày hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp

có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ) Ở trạngthái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định,

pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa Đổi lại, hệ vi sinh vật

sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng,

giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại,tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trongđường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vậtchủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật Thức ăn là nềndinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức

ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý đều làm tổn hại đếntrạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệtiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy ) cũng như kiểu và tần sốnhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật Kiểu và tần số nhu độngruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển ).Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái

“dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”) Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ởvật chủ thường là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóanhư tiêu chảy, viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong

bảng 1) Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một

phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loạikháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng Tuy nhiên, việc sửdụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đanggây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gâynên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người

và vật nuôi Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để

bổ sung vào thức ăn như chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006.Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thứclớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện

vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress Để vượt qua những thách thức đó, đã córất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng antoàn với vật nuôi Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic

Bảng 1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm đặc trưng của

chúng

Trạng thái Eubiosis

- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi

sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh

- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa

chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm

- Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và

hệ vi sinh vật đường ruột

- Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làmcho thành đường ruột mỏng đi dẫn đếngiảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng

- Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chấtđộc…)

- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4,

H2S, CO2)

- Làm yếu hệ thống miễn dịch

- Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiềunăng lượng

1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic

1.3.1 Vai trò của probiotic

Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức

ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điểnvào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triểnvọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiềutác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đờisống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợicho vật chủ

- Tăng cường khả năng miễn dịch

- Giảm phản ứng viêm

- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B

- Tăng hấp thu chất khoáng

- Làm giảm cholesterol huyết thanh

- Làm tăng năng suất vật nuôi

- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường

Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo racác chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng

1.3.2 Cơ chế tác động

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớncác tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đốikháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006) Minh họa cơ chế hoạtđộng của probiotic thông qua hình 1

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinhvật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vịtrí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các

vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E coli, Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii)

không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn

có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose

và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002).Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sựsinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọngđối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển

Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh cácchất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một

số axit hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu

là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996)

Cạnh tranh loại trừ: cácsinh vật probiotic khóa chặtcác vị trí thụ cảm do đóloại trừ được các vi sinhvật gây bệnh

và các thụ cảm trên ruột vàphá hủy chúng

Các vi sinh vật probiotic cưngụ và nhân lên trong ruột,ngăn cản sự bám dính vàphát triển của các vi sinh vậtgây bệnh

Hình 1 Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú Giữa hệ vi sinh vật ruột

và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù Năng lực miễn dịch thể dịch vàmiễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cânbằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999) Thông qua tương tác với hệ thống miễndịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc

cả hai Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủnggiống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999) Tuy nhiên, cơ chế tác

động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa đượchiểu biết đầy đủ.

1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

1.4.1 Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàncho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh(colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp

lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng cótiềm năng như là nguồn probiotic [22]

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếusau:

 Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủngprobiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá

và sinh sôi nảy nở Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăngkhả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịchcủa vật chủ Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic vớicác vi sinh vật bất lợi khác

 Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được cácchủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trongphát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh

như E coli, Salmonella và Campylobacteria Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có

thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic

+ Tạo ra H2O2

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

 Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày củavật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza,proteaza, lysozym…) Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phảitồn tại được trong điều kiện này Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc(microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩnprobiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.

 Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá củađộng vật dao động 1-3% [48] Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải cókhả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng

probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá

như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năngtiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic

 Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và Bifidobacterium.

Các loài thuộc chi Lactobacillus: L acidophilus, L amylovorus, L brevis, L casei,

L casei subsp rhamnosus (Lactobacillus GG), L caucasicus, L crispatus, L delbrueckii subsp bulgaricus (L bulgaricus), L fermentum (L fermenti), L gasseri, L helveticus, L johnsonii, L lactis, L leichmannii, L paracasei, L plantarum, L reuteri, L rhamnosus

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B adolescentis, B bifidum, B breve, B infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum

 Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae.

1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic

Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát

triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men Vai trò cũng như

cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau [36], cụ thể có trong bảng sau:

Bảng 2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ

Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus Nấm men

- Sinh bacteriocin

- Cạnh tranh vị trí bám

- Sinh các peptit, kích thích hệ

thống miễn dịch của vật chủ

- Cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí

bám vào biểu mô

- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu

quả hấp thu chất dinh dưỡng

- Sinh enzym phângiải các cơ chất nhưtinh bột, xenluloza;

kích thích tiêu hoá

- Sinh axit hữu cơ, kíchthích tiêu hoá

- Hấp thu chất độc vàcạnh tranh dinh dưỡng,

vị trí bám trên biểu môvới vi sinh vật gâybệnh

Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau

1.4.4 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôibắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm[9] Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môitrường trước khi vào cơ thể động vật Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối vớichủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môitrường Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉtiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn vàcác phản ứng phụ Ngoài ra cần có những thông số phân tích sinh hoá về máu vàđánh giá chỉ số coliform trong phân Đối với con người không cần thiết phải thửnghiệm như trên động vật nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da,mũi, mắt (Arturo et al, 2006) Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không cóhại đối với con người và động vật, không mang gen lạ Nói chung các chủng vi sinhvật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các

chủng được khuyến cáo sử dụng Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việctuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thìcác chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loạiđến chi và loài Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Uỷban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for animalnutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và nhữngkhuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật online ((SCAN, 2000).

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần đượcphân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinhvật đạt tiêu chuẩn quốc tế Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (GoodManufacturing Practices)

1.4.5 Phân loại vi sinh vật

Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danhchính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002) Hiện nay, trên thị trường

có nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E Tuynhiên các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các

vi sinh vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tínhphân loại về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử Phương pháp định danhdựa theo sinh học phân tử hiện nay chủ yếu vẫn là dựa theo kỹ thuật giải trình tựđoạn gen mã hoá cho ARN riboxom 16S (đối với vi khuẩn) và đoạn D1D2 của gen

mã hoá cho ARN riboxom 28S hoặc vùng ITS (đối với nấm men) Trong nhữngđiều kiện cho phép thì người ta tiến hành kỹ thuật lai ADN với các chủng chuẩn đểkhẳng định vị trí phân loại của chủng nghiên cứu tới loài

1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới

Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên củathực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên

cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ nhữngnăm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003) Những nghiên cứu phân loại và đặcđiểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởiSavage (1987); Vahjen và ctv (1998); Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và

ctv (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus Bằng kỹ

thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài

vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic(Patterson và ctv, 2003) Apajialahti và ctv (1998); Netherwood và ctv (1999);Gong và ctv (2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu

sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ởđộng vật dưới tác động của probiotic Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nàogóp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ visinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003) Đã córất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic đối với đời sống động vật như tác độngcủa probiotic đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991;Hersbberg và Mayer, 2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi(Glick, 1995; Fontaine và ctv, 1996; Dai và ctv, 2000; McCracken và Lorenz,2001)

Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhaunhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạnchế Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự pháttriển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rấtquan trọng Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinhdưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chấtgiống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệthống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C.Knight và cs, 2009)

Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong

lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiêncứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩmprobiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiềunước trên thế giới Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩmprobiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau Nhiều nghiên cứu

bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy có đáp ứng tích cực (Henrich vàctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chấtdinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn ) Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiêncứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trênlợn (Breston và ctv, 1995): không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic

(Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn

choai và vỗ béo; Navas-Sanchez và ctv (1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con saucai sữa không nên sử dụng các chế phẩm probiotic; Galassi và ctv (2001): khôngthấy có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở cácnhóm lợn thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sungprobiotic

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quảnghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩmprobiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ cácđặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể lànguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính

1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sốngdân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâmtrong khoảng một thập kỷ gần đây Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chếphẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler chothấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi

khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung

PRO99 Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổsung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6% Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đãphân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng cácphương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các

chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis

và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh

trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với

Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã

nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi

khuẩn Salmonella Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước

đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này Nguyễn LaAnh và ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cảimuối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và

có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn

Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trườngnước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứusản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II Chế phẩm BIO II gồm các nhóm

vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các

enzym -amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá vàchế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứngdụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Bảng 3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường

Sản phẩm Nước sản xuất

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)

Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chấtchứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà; các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, cácthực phẩm lên men…)

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống

Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia

2.1.2.2 Máy móc và dụng cụ

Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật(VTCC) – Viện Vi Vinh Vật – Đại học Quốc gia Hà Nội Bao gồm:

Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)

Nồi lên men (Hanil R&D- Hàn Quốc)

Máy sấy phun (Changzou SPD-5, Trung quốc)

Máy ly tâm lạnh C30P (Sigma, Đức)

Máy điện di ADN, máy phát hiện ADN trên gel (Biorad, Mỹ)

Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)

Máy PCR Mastercycler gradient (Eppendorf, Đức)

Máy đo quang phổ Ultrospec 3000 pro (Anh)

Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ)

Cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ)

2.1.3 Môi trường nghiên cứu

2.1.3.1 Môi trường MRS (g/l):

Đường glucoza 20,0 K2HPO4 2,0

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút Thạch 15,0Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3

Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục

lỗ Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập được ly tâmlạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong Nhỏ phần dịch trong vào các giếng trên đĩathạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Khả năng sinh axit của cácchủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong phân giảiCaCO3

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.1.2 Định lượng axit lactic theo Therner [61]:

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh

ra với phenolphtalein Ta xác định được hàm lượng axit lactic của mẫu

Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và

thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 900) Sau đó chuẩn độ bằngNaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại Ghi lạithể tích NaOH (ml) đã dùng Độ axit được tính như sau:

% axit lactic = VNaOHtiêu tốn x 0,009 (g/l)

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm).

Khả năng sinh bacteriocin: dịch trong thu được sau li tâm được trung hòa bằng

NaOH 0,1N (mục đích trung hòa axit tạo thành), sau đó làm tiếp tục các bước nhưtrên để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic được tuyểnchọn

2.2.1.4 Xác định hoạt tính enzym

Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ Phương pháp nhưsau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ trên đĩaPetri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ dịch enzym vàocác lỗ đã đục, để ở 370C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol để vòngphân giải cơ chất hiện rõ Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòngngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch

2.2.2 Phương pháp phân lập

2.2.2.1.Vi khuẩn lactic

Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, cácnguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vôtrùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi trườngMRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí Nuôi ở 370C trong

48 giờ Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết cáckhuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong).Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng Mỗi mẫu phânlập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kính hiển vi

2.2.2.2 Vi khuẩn Bacillus

Mẫu trước khi pha loãng ở nồng độ tương tự như phân lập vi khuẩn lacticđược xử lý ở nhiệt độ 800C/30 phút, sau khi pha loãng, dịch mẫu được gạt trên đĩaPetri chứa môi trường thạch thường Nuôi ở 370C trong 48 giờ Tách và thuần khiếtcác khuẩn lạc tạo thành

2.2.2.3 Nấm men

Phương pháp làm tương tự như trên, nhưng thay bằng môi trường YM có bổsung kháng sinh cloramphenicol Nuôi cấy các đĩa Petri đã gạt mẫu ở 300C Sau 48giờ chọn các khuẩn lạc tạo thành và soi dưới kính hiển vi quang học

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn

2.2.3.1 Vi khuẩn lactic

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn lactic phân lập được, tiến hành tuyểnchọn các chủng có khả năng sinh axit lactic cao (định tính) và khả năng sinhbacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định

2.2.3.2 Vi khuẩn Bacillus

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọncác chủng có khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza cao và khả năng kháng vikhuẩn kiểm định

2.2.3.3 Nấm men

Tuyển chọn các chủng nấm men phân lập được thông qua đánh giá khả năngkháng các vi khuẩn kiểm định

2.2.4 Phương pháp phân loại

2.2.4.1 Phân loại vi khuẩn

 Phương pháp sinh lý, sinh hóa

Nhuộm gram

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân loại

vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh

và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩnGram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của

màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu Khinhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tíavới Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan colại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào.

Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn đặt lên phiến

kính Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kếttinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút Rửa bằng nước Nhuộm tiếp bằng dungdịch Lugol trong 1 phút Rửa bằng nước Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95% :axeton (1:1) trong khoảng 1 phút Lại rửa bằng nước Sau đó nhuộm tiếp bằng thuốcnhuộm màu đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây - Rửa qua nước, đểkhô, soi kính

Xác định khả năng đồng hóa các loại đường

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường MRS (vi khuẩn

lactic), LB (vi khuẩn Bacillus): L-arabinoza, riboza, Xyloza, fructoza,

D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat

Môi trường được chia vào các ống nhỏ Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấytrên các môi trường không chứa nguồn đường nào

Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza (chỉ với vi khuẩn lactic)

Nguyên tắc: Việc phát triển trên môi trường với các hợp chất này có thể làm dẫn

đến việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí

Cách tiến hành: Sử dụng môi trường dịch thể (Glucoza - 2%) Cho vào mỗi ống

nghiệm 2ml môi trường cơ sở và 1 ống Durham để ngược Khử trùng ở 121oC/15phút Bổ sung 100l dịch vi khuẩn vào mỗi ống, nuôi cấy trong 1-2 ngày Quan sátkhả năng sinh khí CO2, nếu sinh khí là lên men dị hình và ngược lại là lên men đồnghình

Phản ứng catalaza (chỉ với vi khuẩn lactic)

Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalaza âm tính nhưng đặc biệt có

một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalaza dương tính gọi là

“Catalaza giả” như P pentosaceus do chúng không nhảy cảm với cyanide và azide

và không chứa một nhóm giả của Haem (C34H3204N2Fe)

Tiến hành: Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, quan sát

sự xuất hiện bọt khí bằng mắt thường

 Phương pháp sinh học phân tử

Xác định trình tự rARN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của

Sakiyama và cs (2009)

Tách chiết ADN

- Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA(pH 7,5))

- Thêm 0,4 mg lysozym Trộn đều, ủ 370C/1 giờ Trộn đều 3 phút

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộnđều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộnđều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1/ 10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn Đặt trong đá 30phút Ly tâm 15000v/p trong 15 phút Bỏ lớp dịch trên

- Rửa tủa bằng Etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không

- Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngậptrong 300ml dung dịch 1 X TAE Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 lmẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát trên máy soi gel

Phản ứng khuếch đại ADN.

Primer xuôi (10 pmol/l) 2

Primer ngược (10 pmol/l) 2

Primer xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

Primer ngược: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập

trong 300ml dung dịch 1 X TAE Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 lmẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch sản phẩm PCR

- Sử dụng bộ kit QIA gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

+ Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 Trộn đều

+ Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột

+ Bổ sung 750 l PE buffer lên cột Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280 Tính tỷ lệ tinhsạch: OD260/OD280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại ADN cho sequence:

- Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Tinh sạch sản phẩm RCR cho sequence.

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống eppendoft sạch

- Thêm 5l EDTA 125mM và 60l Etanol 100% Để khoảng 15 phút ở nhiệt độphòng

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho sequence

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của rADN của các mẫu được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự

động 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài

đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên loài

2.2.4.2 Phân loại nấm men

 Phương pháp sinh lý, sinh hóa

Xác định khả năng đồng hóa các loại đường

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường cơ sở (Bactoyeast nitrogen base 6,7g; Bacto yeast extract 50 mg; Bacto casamino acid 50 mg):L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol,lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat

Môi trường được chia vào các ống nhỏ Cấy vi sinh vật, sau 2 -3 ngày quansát sự sinh trưởng của các chủng được tuyển chọn

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âmđược cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào

Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza

Phân vào mỗi ống nghiệm 2 ml môi trường có thành phần như sau:

 Phương pháp sinh học phân tử

Xác định trình tự rARN của chủng nghiên cứu theo phương pháp của Manitis vàcộng sự [1982] Bao gồm các bước:

Tách ADN cho phản ứng PCR

- Cho 100 l đệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml Lấy một vòng que cấy mẫu,trộn thật đều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên.

- Đun hỗn hợp 100oC trong 15 phút Thêm 100 l kaliaxetat, sau đó trộn đều

và đặt trên đá 1 giờ

- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó lấy phần nổiphía trên

- Thêm 200 l CHCl3-Isoamyl alcohol và trộn đều, ly tâm 15.000 v/ph trong

15 phút, sau đó lấy phần nổi phía trên Làm lại như vậy thêm một lần nữa

- Thêm 200l 2-propanol (Iso-propanol) và đặt trong đá 20phút Ly tâm15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa

- Rửa sạch phần tủa (pellet) bằng etanol 70% Ly tâm 15.000 v/ph trong 10phút và lấy tủa

- Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút

- Hoà tan tủa trong TE (30-50 l), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày

- Giữ ở -20oC trước khi sử dụng

Mồi xuôi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

Mồi ngược ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhi t cho ph n ng PCRệt cho phản ứng PCR ản ứng PCR ứng PCR

Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngậptrong 300ml dung dịch 1 X TAE Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 lmẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch ADN sau khi thực hiện phản ứng PCR

- Sử dụng bộ kit QIA (Invitrogen, Đức) thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

+ Thêm dung dịch PB vào mẫu theo thể tích 3:1 Trộn đều, đưa vào cột, lytâm 13.000 v/p trong 30 giây

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột

+ Bổ sung 500 l PE lên cột Ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 13.000 v/p trong 2 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và

280 Tính tỷ lệ tinh sạch: OD260/OD280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.

Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cyclesequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợpphản ứng như sau :

Terminator Ready Reaction Mix 8 l

Mồi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

Mồi ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing:

Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn được duỗi ra

- Tinh sạch sản phẩm cho sequencing:

Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml Thêm 5l EDTA 1,25 M,thêm 60l ethanol 100% Trộn thật nhẹ nhàng Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút Đổ bỏ dịch phía trên Rửa bằng 100l ethanol70% Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút Làm khô mẫu băng máy cô quay chânkhông trong 3-5 phút

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của ITS rARN của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc trình

tự tự động 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các

loài đã được xác định trong ngân hàng gen

2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.2.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0,trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 40;

45oC

2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Tương tự như trên, các chủng vi sinh vật cũng được nuôi cấy trên môi trườngdịch thể có độ pH khác nhau (2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt giữ

Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được đánh giá: với

vi khuẩn (thông qua mật độ quang OD660); với nấm men (thông qua CFU/ml)

2.2.5 Phát triển chế phẩm

2.2.5.1 Đánh giá tính đối kháng của các chủng lựa chọn

Đánh giá tính đối kháng của các chủng thông qua phương pháp cấy vạch

2.2.5.2 Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa

 Chuẩn bị vi khuẩn và nấm men probiotic:

- Vi khuẩn và nấm men được thu tại giữa pha log từ môi trường dịch thể tương ứngbằng ly tâm (6000 vòng/phút/15 phút) sau đó rửa 2 lần với đệm PBS

- Tế bào được huyền phù lại trong môi trường dịch thể (MRS cho vi khuẩn lactic,

LB cho Bacillus, YM cho nấm men) trước khi tiến hành cho bám dính đạt mật độ 4

x 108 CFU/ml

+ Rửa mẫu ruột sau khi ủ lần 1 với 2 thể tích muối sinh lý 1%.

+ Rửa 3 lần với 2 thể tích đệm PBS, thu lấy dịch rửa 3 lần, đếm tế số lượng tế bàobám dính trên mẫu

2.2.5.3 Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với một số thành phần có hoạt tính trong khẩu phần ăn.

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch thể tương ứng (MRS cho

vi khuẩn lactic; thạch thường cho vi khuẩn Bacillus và YM cho nấm men) nhưng có

bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn vàgia cầm gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO4(250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit,axit formic, axit citric ) với liều 200mg/lít Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ

ấm (37oC) Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h

- Chín mươi sáu (96) lợn con lai thương phẩm cai sữa 21 ngày tuổi có khối lượngbình quân từ 7-8 kg đã được sử dụng Lợn được nuôi trong thời gian 50 ngày, trongchuồng nền xi măng, thông thoáng tự nhiên.

- Khẩu phần cơ sở cho lợn thí nghiệm được phối chế từ các nguyên liệu: ngô épđùn, tấm gạo tẻ, khô dầu đậu tương tách vỏ, bột thay thế sữa (milk replacer), bột sữawhey, premix vitamin-khoáng và các axit amin tổng hợp

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích

Vi sinh vật probiotic chủ yếu là vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycess boulardii Trên thực tế các đối tượng

trên có mặt trong hầu hết các mẫu trong tự nhiên, để thu được chúng có thể phân lập

từ nhiều nguồn khác nhau như thực phẩm lên men (rau, củ, nem chua, bún), đấtnước, thực phẩm các loại, bánh men Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trungphân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật tồn tại trong đường tiêu hoá của vậtnuôi (gà, lợn) và một số nguồn khác nhau (đất, các sản phẩm lên men) Việc lấymẫu phân lập sẽ có nhiều khả năng thu nhận và tuyển chọn được các chủng vi sinhvật có đặc tính probiotic như chịu axit, muối mật, sinh enzym thuỷ phân vàbacteriocin kháng khuẩn gây bệnh

Từ các nguồn khác nhau, 254 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó

có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men

(bảng 4)

Bảng 4: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau

Nguồn phân lập

Nhóm vi sinh vật đã phân lập

Vi khuẩn lactic Bacillus Nấm men

Trong đó từ chất chứa trong ruột non, ruột già của lợn và gia cầm đã phân

lập được 149 chủng vi khuẩn lactic, 40 chủng Bacillus và 38 chủng nấm men Từ

các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các sản phẩm lên men ), đã phân lập

được 15 chủng vi khuẩn lactic, 5 chủng Bacillus và 7 chủng nấm men

Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môitrường (MRS, thạch thường và YM) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứutiếp theo Đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu ở - 800 C nhằm giữđược giống trong thời gian dài

3.2 Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic

3.2.1 Vi khuẩn lactic.

3.2.1.1 Đánh giá khả năng sản sinh axit

164 chủng vi khuẩn lactic phân lập được được nuôi cấy lắc trên 20 ml môitrường MRS dịch thể trong 48 giờ Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 12000 vòng/phútlấy dịch trong Để xác định khả năng sinh axit chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏdịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.Kết quả tuyển chọn khả năng sinh axit được trình bày ở bảng 5

Bảng 5 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit

Khả năng sinh axit Số lượng chủng Tỷ lệ (%)

đó khả năng sinh axit mạnh có 30 chủng chiếm 18,3%, còn lại là 45 chủng (27,4%).Các chủng sinh axit với hàm lượng cao nhất được dùng trong các nghiên cứu tiếptheo.

3.2.1.2 Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin

Một trong những đặc tính quan trọng nhất làm căn cứ tuyển chọn các chủng

vi khuẩn probiotic là khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định Trong số 30 chủngsản sinh axit lactic cao nhất, 12 chủng được xác định là có hoạt tính kháng khuẩnmạnh nhất Kết quả được trình bày ở bảng 6

Bảng 6: Khả năng sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định của 12 chủng vi

khuẩn lactic (được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn - ∆D, mm)

Salmonella và Shigella 09 chủng có khả năng ức chế cả 3 loại vi khuẩn kiểm định

(Salmonella, E coli và Shigella) Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm địnhcủa các chủng rất khác nhau Vòng kháng khuẩn (cả 3 loại vi khuẩn kiểm định) cóđường kính lớn thuộc về các chủng 6H2; C3 (D-d ≥10mm đối với cả 3 chủng kiểm

định); vòng kháng khuẩn trung bình thấy ở chủng Đ2; Đ7; 1K8; NC1; NC2 và 2M33 (D-d ‹ 10mm) Có 3 chủng 3K2; 5M2 và 5H4 có hoạt tính kháng E coli không rõ rệt (D-d = 0 mm) (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng lactic có trong hình 4, 5 thuộc phụ lục 1)

Vì vậy 09 chủng sinh bacteriocin kháng cả 3 loại vi khuẩn kiểm định đượcdùng trong các nghiên cứu tiếp theo

E coli Shigella flexneri

Hình 2: Sơ đồ minh họa hoạt tính kháng khuẩn của các chủng lactic

3.2.2 Vi khuẩn Bacillus

3.2.2.1 Đánh giá khả năng sản sinh enzym

Tổng số 45 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được, đã được nuôi lắc trên

20ml môi trường LB dịch thể trong 48 giờ Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 10000vòng/phút lấy dịch enzym Để xác định khả năng phân giải cơ chất chúng tôi tiếnhành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có cơ chất khác nhau

(tinh bột, xenluloza), để ở nhiệt độ 370 C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thửLugol và đo vòng phân giải Kết quả được thể hiện ở bảng 7.

Bảng 7: Số lượng chủng Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất

(D-d là đường kính vòng phân giải cơ chất)

Các chủng có hoạt tính enzym mạnh và trung bình (D-d ≥8mm) với cả 2 cơchất (11 chủng) được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo Khả năng sinh enzym

của 11 chủng Bacillus được lựa chọn được trình bày trong bảng 8.

Bảng 8: Khả năng sản sinh enzym (thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất D-d, mm) của 11 chủng vi khuẩn Bacillus.

TT Ký hiệu chủng Amylaza (D-d, mm) Xenlulaza (D-d, mm)

34 32

Ho¹t tÝnh alpha amylaza (mm)

H×nh 3 Sơ đồ minh họa hoạt tính amylaza của 11 chủng vi khuẩn Bacillus

Kết quả ở bảng 8 trên cho ta thấy cả 11 chủng vi khuẩn Bacillus được lựa

chọn thì hoạt tính enzym amylaza và xenlulaza mạnh nhất thuộc về chủng H3, tiếpđến là các chủng M51, H4 và M73 (đường kính vòng phân giải từ 24-34 mm)

(Hình minh họa hoạt tính enzym của một số chủng Bacillus có trong hình 6, 7, 8 thuộc phụ lục 1).

3.2.2.2 Đánh giá khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định

11chủng có hoạt tính enzym mạnh nhất được lựa chọn để đánh giá tiếp hoạttính kháng vi khuẩn kiểm định Các kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

11 chủng vi khuẩn Bacillus được trình bày ở các bảng 9.

Các kết quả ở bảng 9 cho thấy, trong 11 chủng được lựa chọn thì 09 chủng

Bacillus không có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định và 2 chủng có khả năng

kháng các vi khuẩn kiểm định (H3 và H4) nhưng với hàm lượng rất thấp và cả 2

chủng này đều không kháng vi khuẩn E.coli Vì vậy 2 chủng H3 và H4 được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng Bacillus có trong hình 9 thuộc phụ lục 1).