Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

PHẦN 1 - MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Là một nước nông nghiệp đang phát triển như nước ta, các nông sản vàcác sản phẩm từ chăn nuôi đóng một vai trò rất quan trọng Lạc và ngô là hainông sản, ngoài việc sử dụng làm thực phẩm, chúng chủ yếu còn được làmthức ăn trong chăn nuôi Với điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta thì lạc vàngô lại là nguồn cơ chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển Khi phát triển trênngô, lạc nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng, gây ra tổn thất về lượngcũng như về chất của hạt Không những thế, một số loài nấm mốc khi pháttriển chúng sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin.Nguy hiểm hơn, những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gâyđộc cho con người và động vật kinh tế.

Việc sử dụng các biện phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáosử dụng Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung vàsự nhiễm aflatoxin trên ngô lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là khôngthể tránh được Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tốnấm mốc, đặc biệt là aflatoxin bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó.

Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu để tìm ra những pháp làm giảmlượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêngđã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm

Ở nước ta, từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [9] đãnghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miềnBắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc , Đặng Hồng Miên [5]cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc.

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độctố nấm mốc trên ngô gạo và các biện pháp phòng trừ.

Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc vàaflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin bằngNH4OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [7].

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] cũng đã nghiên cứu khử aflatoxintrên ngô bằng NH3 và Ca(OH)2, kết quả cho thấy tác dụng khử aflatoxin bằnghai hóa chất rất rõ rệt và hiệu quả cao Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxinbằng các hóa chất như NH3 có giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nôngsản bị xử lý.

Để khắc phục nhược điểm này, trong những năm qua, nhiều công trìnhnghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học đã được nhiều nhàkhoa học tập trung nghiên cứu và đã thu được một số kết quả hứa hẹn.

Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện phápsinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài :

“Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năngkhử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao”.

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được một số chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopusdelemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao và khả năng ứng

dụng chúng trong khử nhiễm aflatoxin trên ngô và trên lạc.

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số chủng Flavobacterium aurantiacum từ một số mẫu

đất thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.

- Phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản,

thực phẩm như quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc.

- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Flavobacteriumaurantiacum phân lập được.

- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Rhizopus delemar

phân lập được.

PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đại cương về độc tố nấm mốc

Độ tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấutrúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấpcủa các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [14]

Ngoài tự nhiên có rất nhiêu loài nấm khác nhau phát triển trên các sảnphẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì và nhiều loại hợp chất hữu cơ Tuy nhiên, chỉcó một vài loài nấm có thể sinh độc tố và ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm vàcon người Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữakiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của nấm mốc Độc tố nấm là sảnphẩm của sự chuyển hóa thứ cấp trong quá trình phát triển của nấm mốc [6].Quá trình trao đổi thứ cấp được hiểu là quá trình tạo thành các chất mà vai tròsinh lý của chúng chưa được rõ,chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tếbào đó Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy ra ở cuối giai đoạn phát triển củatế bào nấm mốc.

Tính độc của những loài nấm lớn nhất định đã được biết đến từ lâu,nhưng đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc mới được nghiên cứu sâu Khi đó,cả thế giới bàng hoàng bởi hơn 100 000 con gà tây ở nước Anh đã chết vì

bệnh X khi ăn lạc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus.

Những số liệu có giá trị về các mycotoxin và các bệnh về mycotoxin đãđược thu nhận từ lĩnh vực thú y học Nghiên cứu về động vật thực nghiệm đãcho thấy tính độc của mycotoxin là rất lớn.

Bệnh nấm mốc ở người và động vật đều không có khả năng lây lan vìchúng do tác nhân độc tố (hóa học ) gây ra.Tuy nhiên, hầu như tất các sản

mycotoxin tiếp theo, và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩmcủa con người Khi gia súc ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng khôngchỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, vànhư vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con người.

Độc tố nấm mốc đã thu hút sự quan tâm của toàn cầu bởi chúng đe dọađến sức khỏe con người và động vật cũng như sự thiệt hại nghiêm trọng vềkinh tế [8] Điều này đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị, hội thảo quốc tế ,tạp chí và các bài nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này.

Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiêncứu Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêmtrọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm.

2.2 Độc tố aflatoxin

Năm 1961, Butler là người đã xác định được loài nấm Aspergillusflavus tiết ra độc tố gây bệnh X ở gà tây và ông đặt tên là aflatoxin là viết tắt

của Afla và toxin.

Trong các mycotoxin thì aflatoxin được phát hiện sớm nhất và đượcnghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện

Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocaumarin, là sản

phẩm trao đổi chất, tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus

được đặt tên là B1, B2, G1, G2 Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩmthực vật.

Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liênquan đến aflatoxin B1, G1 và aflatoxin B2, G2 là dẫn xuất dihydro của các hợpchất mẹ Các aflatoxin M1 và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B1 vàB2 theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau:

Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng B làchữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), và G là chữ viết tắt của Green(màu xanh lá cây) Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi làaflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk) Trong bốn loạiaflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó làG1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Các aflatoxin phát quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực tím sóng dài.Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp(0,5 ng haythấp hơn trên một vết sắc kí bản mỏng) Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thựchành cho tất cả các phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng.Aflatoxin M1 ở nồng độ 0,22mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng.

Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như

Aflatoxin G

2

được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin và các động vậtthực nghiệm) Tính tan của aflatoxin trong nước giao động từ 10 -20 mg/l.

Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong khôngkhí Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tiacực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt hòa tan ở các dung môi có độphân cực cao Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy phá hủy điều kiện nấubình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, lạc rang đã làm giảmđặc biệt lượng các aflatoxin và các aflatoxin có thể bị phá hủy hoàn toàn vớiviệc xử lí mạnh bằng amoniac hay hypochlorit.

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việcthủy phân trong môi trường kiềm Đặc tính này là quan trọng trong quá trìnhchế biến thực phẩm vì quá trình xử lí kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin củacác sản phẩm Tuy nhiên, nếu xử lí kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phảnứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu.

Moreau và cộng sự khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ranhững kết quả sau:

Bảng 2.1 Tính chất hóa lý của một số aflatoxin

Côngthức phân

Trọnglượngphân tử

Nhiệt độ nóng chảy

Huỳnh quang

B1 C17H12O6 312 268-269 265-270 252-266 Xanh lamB2 C17H14O6 314 286-289 305-309 280-283 Xanh lamG1 C17H12O7 328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục

Ghi chú: * Kết quả của Townsend

** Kết quả của Stubblefield và cộng sự *** Kết quả của Beljaars.

A.flavus có khả năng tạo aflatoxin Ngoài hai loài A.flavus và A.parasiticus

còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng yếu hơn như

A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) và A.bombycis (Varga et all

Sản lượng aflatoxin thường tỉ lệ với trọng lượng với hệ sợi nấm tạothành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượngaflatoxin lớn nhất, nhưng giảm sút nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tựphân giải Sự sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu

từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của A.flavus, nó tăng dần đến

giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin nhưchủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nước, các yếu tố môi trường…

Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12oC,27oC và 40 – 42oC theo thứ tự Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính saunhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường không thích hợp, nhưng khảnăng sinh độc tố cũng có thể tăng khi chủng nấm mốc được cấy chuyển trênmôi trường thích hợp Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc làcác axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ26 – 28oC) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin.

2.2.2 Sự nhiễm aflatoxin trên ngô và lạc.

Cho tới nay, sự có mặt của aflatoxin được phát hiện trên nhiều loạinông sản, thực phẩm của trên 50 nước ở hầu hết các châu lục Aflatoxin đãlàm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [9] Theo đánhgiá của FAO, hiện tại ước lượng có khoảng 25% tất cả các loại ngũ cốc bị ảnhhưởng bởi độc tố nấm mốc [10] Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên nhiềuloại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung đượcxác định trên lạc và trên ngô là chủ yếu.

* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc trên thế giới

Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự [13] cho thấy sự nhiễm

aflatoxin trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây nên là vấn đề nghiêm trọng

ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ Trong 3 năm nghiên

cứu từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A.flavus trên ngô

hạt năm 2000 dao động từ 0 -100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm),hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là57ppb) Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ngoài đồng

không tương quan với với sự nhiễm A.flavus Tuy nhiên, 84% A.flavus phân

lập từ các hạt ngô có khả năng tạo aflatoxin Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm

aflatoxin B1 (mức trung bình 400μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxinB1 (mức trung bình 133μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% mẫu ởđảo Cebu, Philippin trung bình 213μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg [18] Theo Goto và cộng sự [12], 80-85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ởThái Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb.

Còn đối với lạc, trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở nước Mĩcho thấy 15% của 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg Stoloff,Krof và Hald đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạcnhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg Cácaflatoxin đã tìm thấy ở 41% số mẫu của tất cẩ các mẫu bơ lạc được kiểm tranăm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg và giá trị trung bình 500μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg.

* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam

Ở nước ta cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễmaflatoxin trên ngô, lạc Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu và thấyrằng mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô miền Nam và miền Bắc Việt Nam làtương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bìnhcao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25%ppb đối với các tỉnh khác nhau [3] Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễmaflatoxin B1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệnhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột là 74,2%, khô lạc là 84,7% Theo kết quảnghiên cứu của Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc cóchứa aflatoxin B1, bên cạnh đó thực phẩm sử dụng cho con người cũng cóchứa loại độc tố này (68% mẫu lạc và các sản phẩm từ lạc) [8] Ngoài ra còncó Đặng Hồng Miên nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc [5].

2.2.3 Độc tính của aflatoxin

Aflatoxin là một độc tố rất độc, nhất là aflatoxin B1 Cơ quan chịu tácđộng của aflatoxin lớn nhất là gan Trong cơ thể động vật, aflatoxin gắn vớiARN và AND thành dạng liên kết, cản trở việc sinh tổng hợp ADN, ARN vàprotein, gây đột biến dẫn đến ung thư và làm suy giảm hệ miễn dịch Sự liênkết của aflatoxin với protein làm vô hoạt các enzym, thay đổi tính chất của tythể, lạp thể, suy giảm quá trình hô hấp mô bào [11].

Tình trạng nhiễm độc mãn tính aflatoxin đã dẫn đến ung thư gan ởnhiều loài chuột, cá hồi, vịt và khỉ Ngoài ra còn thấy u ở thận, túi mật, tụy,bọng đái, xương của động vật thí nghiệm [12] Elis và Dipaolo đã chứng minhrằng việc tiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường bụng với liều 4μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg thểtrọng đã gây cho thai chuột bị quái thai hoặc chết [báo cáo tổng kết] Vớinhững con vật bị nhiễm độc aflatoxin mãn tính chúng thường kém ăn, chậmlớn, có thể sút cân, tổn thương ở gan, gan bị tụ máu có vùng chảy máu và hoạitử, tăng sinh biểu mô ống dẫn mật Ở hàm lượng thấp tuy không gây chếtnhưng aflatoxin đã mở đường cho các bệnh truyền nhiễm xâm nhập do nó tácđộng làm suy giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch tế bào vàcả sức đề kháng chung của cơ thể [27] Aflatoxin có thể tác động tương hỗvới sự thiếu vitamin, thiếu protein, nhiệt độ không thuận lợi và các yếu tốtruyền nhiễm để gây hại.

2.2.4 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe con người

Hiện nay, vấn đề thực phẩm bị nhiễm aflatoxin đang là mối quan tâmcủa nhiều nhà khoa học vì nó đe dọa đến sức khỏe của con người Aflatoxinliên quan tới bệnh ung thư gan nguyên phát ở người Nhiều tài liệu nghiêncứu về ung thư tế bào gan chứng minh đó là bệnh chung của các vùng có

lương thực bị nhiễm nấm mốc A.flavus mà chất độc là nhóm aflatoxin Bảng

2.3 dưới đây cho thấy mối tương giữa tỉ lệ người bị mắc bệnh ung thư gan vớihàm lượng aflatoxin có trên thực phẩm.

Bảng 2.2 Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bìnhcó trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993)

Tên nước hoặc vùng

Hàm lượngaflatoxin trongthực phẩm (μg/kg)g/kg)

Tỉ lệ người mắcung thư gan

trên 105

Vùng cao KenyaSongkha (Thái Lan)

Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ)Vùng cao trung bình Kenya

Thảo nguyên cao trung bình (Thụy Sỹ)Vùng thấp Kenya

Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ)MôZămbic

2.2.5 Giới hạn aflatoxin cho phép

Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao cũng nhưtính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đối vớisức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giớihạn aflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm (bảng 2.4):

Bảng 2.3 Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA

NướcGiới hạn aflatoxin

Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người

Canada 15 ppb Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng sốtất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2

Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc

10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1

100 ppb Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ănchăn nuôi

Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quyđịnh về hàm lượng tối đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin

(B1+ B2 + G1+ G2) được tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnhcho gia súc, gia cầm (ppb).

Bảng 2.4 Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam

Loại vật nuôiAflatoxin B1

Tổng số cácaflatoxin

2.3 Vấn đề khử nhiễm aflatoxin

Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộngđồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhàkhoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy cácaflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm.

Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện phápkiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thấtlương thực do nấm mốc gây ra Song những biện pháp như vậy là rất khó thựchiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổicần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp Các thực nghiệmvới lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nôngnghiệp về sự nhiễm aflatoxin Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiếnbộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp làkhông thể tránh được.

Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế,cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩmvà thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được Các phương pháp khửaflatoxin bao gồm phương pháp vật lí, phương pháp hóa học và phương phápsinh học.

2.3.1 Phương pháp vật lí

* Các qui trình phân loại

Phương pháp sử dụng rộng rãi nhất là loại trừ chọn lọc các phần bịnhiễm của sản phẩm Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộcchủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm Các quy trình phân loại dựa trêncác đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng một cách kháthành công đối với lạc ăn Phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở

phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thướcvà hình dạng của hạt Tuy nhiên, do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biệnpháp này không thể nói là hiệu quả 100%.

* Các quy trình chiết suất bằng dung môi

Việc chiết suất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện:

- Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách căn bản trong điềukiện thuận lợi.

- Ít có khả năng tạo những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạngtừ aflatoxin

- Trong nhiều trường hợp, việc chiết suất có thể tiến hành với việc thuhồi dung môi mà không bị mất mát chất dinh dưỡng.

Nhưng việc chiết suất bằng dung môi có một số bất lợi:- Cần phải có thiết bị chiết suất dung môi đặc biệt;

- Sẽ chiết suất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin; - Giá thành của việc chiết suất cao;

- Có thể mất mùi của sản phẩm xử lý.

Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là mộtnhiệm vụ khó Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu suất thu hồichúng cũng là vấn đề Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúngvà cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểmsôi của dung môi

Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/nước, aceton/nước Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà

không loại trừ dầu Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nướcloại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin.

Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệthống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan –etanol - nước, và hexan –aceton - nước Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44%hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất đượctìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% -15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing/kg.

2.3.2 Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất

Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tựnhiên Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxitbenzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin Các hóa chất dùng choviệc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau:

- Phải phá hủy hay khử aflatoxin;

- Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tốhay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng;

- Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúngcó thể tái nhiễm lại sản phẩm;

- Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu banđầu.

Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêuchuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đángkể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc haycác sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn

Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủyaflatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên Những hóa chất này bao gồmhydrogen peroxit hay những hóa chất tương tự, hypochlorit, dimetylamin haymetylamin và amoniac Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit vànatri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sảnphẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn Trong khi đó,dimetylamin hay các amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt códầu hay ngô

Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụngrộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước Vềcơ chế, ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biếnaflatoxin B1 bởi amoniac.

Ở nước ta, Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tốaflatoxin B1 trên ngô và khô lạc bằng hóa chất Kết quả cho thấy NH3 nồngđộ 6% hoặc Ca(OH)2 có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin [1] Nhưng giá xửlý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniacđã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thựctế ở Việt Nam.

2.3.3 Khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã đượckhuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ caoquá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi.Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biệnpháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổiphẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản đượcchứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.

Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể đượcđịnh nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độctố nấm mốc.

2.3.3.1 Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum

Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty

Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân

hủy aflatoxin Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ởmôi trường rắn và môi trường lỏng Khả năng loại trừ aflatoxin B1 của vikhuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc,ngô, bơ lạc và sữa lạc Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai tròquan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B1 bằng chất chiết của

Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym Khảnăng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh

chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quanQuản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừaflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm.

2.3.3.2 Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar

Zhu C.R và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của

Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin.

Aflatoxin B1 được đưa và nước uống của chuột nhắt cái ở liều 126 μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxing trongmột tuần và toàn thể liều thử là 3,4 mg trong thời gian 27 tuần Chất chiết của

Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn

dung dịch aflatoxin B1 Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18, 30,38, và 52 Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được địnhlượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phảnứng enzym Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung thư gan

là 71% Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1,

các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzymđã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuộtnào xuất hiện triệu chứng ung thư gan Kết quả thực nghiệm này cho thấy

rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây

ung thư gan của aflatoxin B1 Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng

như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin Từ

kết quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu

khuyến cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trongthức ăn gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng.

PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.2 Môi trường

* Môi trường M1: 5 gram pepton 2 gram cao thịt

0,2 gram cao nấm men 3 gram NaCl

20 gram aga

1000 ml nước máy

Đun cho tan chảy aga, thử pH = 7,2-7,4 rồi chia vào các bình tam giác,khử trùng 1atm trong 30 phút.

* Môi trường PDA:

200g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4500ml nước.Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây.

1000 ml dịch chiết khoai tây20 gram glucoza

1000 ml nước máypH = 5,5 – 5,8

Đun cho tan chảy aga, thử pH = 5,5 – 5,8 rồi chia vào các bình tamgiác, khử trùng 1atm trong 30 phút.

3.1.3 Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin

* Na2SO4 khan (Trung Quốc)

* NaHClO, Nhà máy hóa chất Việt Trì

* Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma)

* Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớpmỏng

* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc * Bơm tiêm vi lượng Hamilton

* Máy cô chân không

* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ) * Máy đánh sóng siêu âm

* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh * Máy cất quay chân không (Đức)

* Tủ cấy vô trùng (Đức) * Nồi hấp tự động (Đài Loan) * Máy đánh vovtex

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Chọn những ruộng lúa hay ruộng rau có đất màu mỡ Dùng dao gạt bỏ10cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20g đất cho vào túi nilon, buộc kín miệngtúi Mẫu đất phải được đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu và ngày lấy mẫu.

3.2.2 Phương pháp phân lập

3.2.2.1 Phương pháp phân lập Flavobacterium aurantiacum

Cân 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất đã khử trùng.Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút Dùng pipet hút1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng đểđộ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại Lấy 200 μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxinl ở độ pha loãng 10-4và 10-5 vàocác hộp petri đã đổ môi trường M1 Dùng que chang thủy tinh trang đều chotới khi mặt thạch khô thì dừng Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường M1 thạchnghiêng.

3.2.2.2.Phương pháp phân lập Rhizopus delemar

- Phân lập Rhizopus delemar từ bánh men thuốc bắc : mẫu bánh menthuốc bắc được nghiền nhỏ Cân 1g mẫu đã được nghiền nhỏ cho vào ốngnghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng Đánh tan trên máy đánhVovtex 200 vòng/phút trong 30 phút Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang cácống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5

thì dừng lại Lấy 200 μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxinl ở độ pha loãng 10-4và 10-5 vào các hộp petri đã đổmôi trường PDA hoặc Sabouraud Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tớikhi mặt thạch khô thì dừng Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc

- Phân lập Rhizopus delemar từ các mẫu hoa quả : vỏ hoa quả được cắtthành những mảnh nhỏ Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 mlnước cất đã khử trùng Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong30 phút Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9mlnước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại Lấy 200 μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxinl ở độpha loãng 10-4và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA (hoặc môitrường Sabouraud) Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạchkhô thì dừng Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quansát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trườngSaubauraud) thạch nghiêng.

3.2.3 Phương pháp định loại Flavobacterium aurantiacum

Để định loại F.aurantiacum chúng tôi dựa vào khóa phân loại của

Bergey [14] Chúng tôi tiến hành các phản ứng sinh lý như xác định khả năngdi động, sắc tố tế bào, khả năng chịu muối, nhu cầu về NaCl; các phản ứngsinh hóa như khả năng thủy phân gelatin, khả năng thủy phân casein, khảnăng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân celluloza, các khả năng lên menđường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza.

3.2.4 Phương pháp định loại Rhizopus delemar

Để định loại các R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng

Rhizopus phân lập trên môi trường Sabouraud trong 24 giờ, sau đó tiến hành

xác định các đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của R.delemar theo khóa

phân loại của Laurone [26].

3.2.5 Phương pháp làm tiêu bản quan sát F.aurantiacum

Sử dụng phương pháp nhuộm Gram Lấy một giọt nước cất vô trùngnhỏ lên lam kính Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc để lấy mẫu Hòa mẫu vàogiọt nước và dàn đều mẫu trên lam kính Hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn

cồn cho khô tiêu bản sau đó nhuộm màu Nhỏ tím gential, giữ 2 phút rồi rửanước Nhỏ lugol, giữ 2 phút sau đó hất đi Tẩy màu tiêu bản bằng cồn 96o

trong 30 giây sau đó rửa nhẹ qua nước Nhỏ fushin, giữ 30 giây, rửa nước, hơkhô Nhỏ dầu lên tiêu bản và đem quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vậtkính 100 Vi khuẩn Gram dương có màu tím Vi khuẩn Gram âm có màuhồng.

3.2.6 Phương pháp làm tiêu quan sát nấm mốc

Nhỏ một giọt cồn : nước theo tỉ kệ 2 : 1 lên lam kính, dùng que cấymốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồnnước trên sau đó nhỏ một xanhmetylen, đậy lamen lên sau đó quan sát tiêubản dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 40.

3.2.7 Phương pháp phân tích aflatoxin

Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bảnmỏng do Doronina và Maksimenko [18] mô tả Dựa trên cơ sở của phươngpháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau:

25 g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê (50 ml bột ngô, bột lạclỏng) chiết suất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100 ml) và dung dịch NaCl10% (25ml) Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron Lọc quagiấy lọc Whatman No1 Lấy 50 ml dịch lọc và kết tủa bằng chì axetat 10%(50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman No1 80 ml dịch lọc đượcchuyển vào phễu chiết để chiết suất bằng hai pha lỏng - lỏng với 40ml hexan(2 lần) Lớp nước aceton được chiết suất với 40 ml cloroform (3 lần), loại bỏlớp nước aceton Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại Làm bay hơi toànbộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không Phần cặnđược hòa tan vào 100μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxinl cloroform, giữ ở 4oC cho đến khi tiến hành định tínhvà định lượng aflatoxin.

Kho¸ luËn tèt nghiÖp

Sơ đồ Quy trình chiết tách aflatoxin

lạc lỏng)

Ống nhót để bay hơilấy 3 ml cặn

Bọc giấy bạc bảoquản lạnh 4oCCô chân không lấy 3

ml cặn

Lấy phần dịch trongPhễu chiết

Lấy pha trên cho vàobình cầu

40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần)Chloroform

Lọc 80ml dịch

Lọc lấy 50ml dịch 50ml chì axetat 10%Nghiền 5 phút trên

máy nghiền đồng thểNghiền nhỏ

25ml NaCl 10% 100ml aceton25g mẫu ngô, lạc

(50ml bột ngô, bộtlạc lỏng

Na2SO4 khan