PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.7.Phương pháp phân tích aflatoxin
Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [18] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau:
25 g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê (50 ml bột ngô, bột lạc lỏng) chiết suất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100 ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman No1. Lấy 50 ml dịch lọc và kết tủa bằng chì axetat 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman No1. 80 ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết suất bằng hai pha lỏng - lỏng với 40ml hexan (2 lần). Lớp nước aceton được chiết suất với 40 ml cloroform (3 lần), loại bỏ lớp nước aceton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100μl cloroform, giữ ở 4oC cho đến khi tiến hành định tính và định lượng aflatoxin.
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Sơ đồ Quy trình chiết tách aflatoxin
lạc lỏng)
Ống nhót để bay hơi lấy 3 ml cặn
Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC Cô chân không lấy 3
ml cặn
Lấy phần dịch trong Phễu chiết
Lấy pha trên cho vào bình cầu
40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần)
Chloroform
(nhắc lại 3 lần) Bỏ phần dịch nổi trên
Lọc 80ml dịch Lọc lấy 50ml dịch 50ml chì axetat 10% Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Nghiền nhỏ 25ml NaCl 10% 100ml aceton 25g mẫu ngô, lạc (50ml bột ngô, bột lạc lỏng Na2SO4 khan
* Định tính aflatoxin :
Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ lên sắc ký lớp mỏng 2μl, 6μl và 10 μl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2 cm và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính ở các vết nhỏ không vượt quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2 μl, 6 μl, 10 μl chuẩn alflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10 μl) như chuẩn trong. Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là cloroform : aceton tỉ lệ 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 μg alflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 - 0,5.
Phát hiện alflatoxin bằng cách phát hiện sự phát huỳnh quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối đưới đèn cực tím sóng dài ( có bước sóng 356 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng alflatoxin.
Thử xác minh alflatoxin
+ Thử với axit vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước tỉ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có alflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử alflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng điều có thể xem như có alflatoxin trong mẫu thử.
+ Thử với axit trifluoroaxetic: chỉ áp dụng với aflatoxin B1, G1, M1. Sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn và mẫu thử 30 μl axit trifluoroaxetic. Để phản ứng xảy ra trong 10
Aflatoxin sau khi kết hợp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị. Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic. Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới.
* Định lượng alflatoxin:
Nếu alflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau:
Nhỏ 10μl chất chiết với đường kính của vết không quá 5 mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5 cm.
Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhở 2 μl,4 μl, 6 μl theo thứ tự dung dịch chuẩn alflatoxin.
Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn alflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử.
Bằng mắt thường định lượng alflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau:
V1 . V3 .V5 . m
C = —————— V2 . V4 . V6 . M
Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C là nồng độ alflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phân tích ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – aceton (ml)
V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetat (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetat (ml)
V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (μl)
V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (μl) m là lượng alfatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g)
3.2.6. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar