Luận văn Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

PHẦN - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Là nước nông nghiệp phát triển nước ta, nông sản sản phẩm từ chăn nuôi đóng vai trò quan trọng Lạc ngô hai nông sản, việc sử dụng làm thực phẩm, chúng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi Với điều kiện khí hậu nóng ẩm nước ta lạc ngô lại nguồn chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển Khi phát triển ngô, lạc nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng, gây tổn thất lượng chất hạt Không thế, số loài nấm mốc phát triển chúng sinh loại độc tố khác gọi chung mycotoxin Nguy hiểm hơn, độc tố có khả theo thức ăn vào thể, gây độc cho người động vật kinh tế Việc sử dụng biện phòng trừ độc tố nấm mốc khuyến cáo sử dụng Tuy nhiên, nhiễm nấm mốc độc tố nấm mốc nói chung nhiễm aflatoxin ngô lạc mức độ cao giới hạn cho phép tránh Chính cần phải có biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc, đặc biệt aflatoxin độc tính nguy gây ung thư Trên giới nay, việc nghiên cứu để tìm pháp làm giảm lượng độc tố aflatoxin lương thực nói chung ngô, lạc nói riêng nhà khoa học quan tâm Ở nước ta, từ năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến cộng [9] nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc thóc kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam số lương thực đậu, đỗ, lạc , Đặng Hồng Miên [5] nghiên cứu nhiễm nấm mốc aflatoxin lạc Nguyễn Thùy Châu cộng [1] nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc ngô gạo biện pháp phòng trừ Một số công trình Đậu Ngọc Hào nhiễm nấm mốc aflatoxin thức ăn gia súc biện pháp khử độc tố aflatoxin NH4OH nghiên cứu công bố [7] Nguyễn Thùy Châu cộng [1] nghiên cứu khử aflatoxin ngô NH3 Ca(OH)2, kết cho thấy tác dụng khử aflatoxin hai hóa chất rõ rệt hiệu cao Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxin hóa chất NH3 có giá thành cao để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý Để khắc phục nhược điểm này, năm qua, nhiều công trình nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thu số kết hứa hẹn Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học, tiến hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn vi nấm có khả khử aflatoxin nhiễm ngô lạc mức độ cao” 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tìm số chủng Flavobacterium aurantiacum Rhizopus delemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin mức độ cao khả ứng dụng chúng khử nhiễm aflatoxin ngô lạc 1.2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập số chủng Flavobacterium aurantiacum từ số mẫu đất thu thập số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Phân lập số chủng Rhizopus delemar từ số mẫu nông sản, thực phẩm quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc - Xác định hoạt tính khử aflatoxin chủng Flavobacterium aurantiacum phân lập - Xác định hoạt tính khử aflatoxin chủng Rhizopus delemar phân lập PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương độc tố nấm mốc Độ tố nấm mốc (hay gọi mycotoxin) nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, tạo trao đổi thứ cấp nấm mốc gây ngộ độc với động vật có vú, cá gia cầm [14] Ngoài tự nhiên có nhiêu loài nấm khác phát triển sản phẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì nhiều loại hợp chất hữu Tuy nhiên, có vài loài nấm sinh độc tố ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm người Sự sản sinh độc tố nấm mốc kết tác động qua lại kiểu gen (genotype) điều kiện phát triển nấm mốc Độc tố nấm sản phẩm chuyển hóa thứ cấp trình phát triển nấm mốc [6] Quá trình trao đổi thứ cấp hiểu trình tạo thành chất mà vai trò sinh lý chúng chưa rõ,chưa thật cần thiết cho tồn tế bào Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy cuối giai đoạn phát triển tế bào nấm mốc Tính độc loài nấm lớn định biết đến từ lâu, đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc nghiên cứu sâu Khi đó, giới bàng hoàng 100 000 gà tây nước Anh chết bệnh X ăn lạc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus Những số liệu có giá trị mycotoxin bệnh mycotoxin thu nhận từ lĩnh vực thú y học Nghiên cứu động vật thực nghiệm cho thấy tính độc mycotoxin lớn Bệnh nấm mốc người động vật khả lây lan chúng tác nhân độc tố (hóa học ) gây ra.Tuy nhiên, tất sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc tạo mycotoxin tiếp theo, có khả nhiễm trực tiếp cho thực phẩm người Khi gia súc ăn thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chịu tác dụng trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, tạo nhiễm mycotoxin cho người Độc tố nấm mốc thu hút quan tâm toàn cầu chúng đe dọa đến sức khỏe người động vật thiệt hại nghiêm trọng kinh tế [8] Điều chứng tỏ nhiều hội nghị, hội thảo quốc tế , tạp chí nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết Cho đến có 300 loại độc tố nấm phát nghiên cứu Nhưng có 20 loại mycotoxin có thực phẩm mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm 2.2 Độc tố aflatoxin Năm 1961, Butler người xác định loài nấm Aspergillus flavus tiết độc tố gây bệnh X gà tây ông đặt tên aflatoxin viết tắt Afla toxin Trong mycotoxin aflatoxin phát sớm nghiên cứu đầy đủ phương diện Các aflatoxin gồm bốn hợp chất nhóm bis-furanocaumarin, sản phẩm trao đổi chất, tạo nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus đặt tên B1, B2, G1, G2 Các aflatoxin thường nhiễm sản phẩm thực vật Các công thức cấu tạo số aflatoxin chất trao đổi liên quan đến aflatoxin B1, G1 aflatoxin B2, G2 dẫn xuất dihydro hợp chất mẹ Các aflatoxin M1 M2 chất trao đổi hydroxylat hóa B B2 theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo sau: O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin B1 O O O OH OCH3 O O O OCH3 O Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 O O O O O OH O OCH3 Aflatoxin B2 O O O O O O OCH3 Aflatoxin G1 O O O O OCH3 Aflatoxin G2 Bốn chất phân biệt sở màu phát quang chúng B chữ viết tắt Blue (màu xanh nước biển), G chữ viết tắt Green (màu xanh cây) Aflatoxin B1 B2 sữa bò chuyển hóa gọi aflatoxin M1 aflatoxin M2 (M chữ viết tắt Milk) Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 tìm thấy nồng độ cao nhất, sau G1, B2 G2 tồn nồng độ thấp Các aflatoxin phát quang mạnh ánh sáng cực tím sóng dài Điều cho phép phát hợp chất nồng độ thấp(0,5 ng hay thấp vết sắc kí mỏng) Nó cung cấp điểm mặt thực hành cho tất phương pháp hóa lý cho việc phát định lượng Aflatoxin M1 nồng độ 0,22mg/l phát sữa lỏng Các aflatoxin hòa tan dung môi phân cực nhẹ cloroform metanol, đặc biệt tan nhiều dimetylsulfoxit (dung môi thường sử dụng phương tiện việc áp dụng aflatoxin động vật thực nghiệm) Tính tan aflatoxin nước giao động từ 10 -20 mg/l Các aflatoxin bền nhiệt độ cao, làm nóng không khí Tuy nhiên tương đối không bền để không khí tia cực tím phiến sắc kí mỏng đặc biệt hòa tan dung môi có độ phân cực cao Các aflatoxin không bị phân hủy phá hủy điều kiện nấu bình thường làm nóng trùng Tuy nhiên, lạc rang làm giảm đặc biệt lượng aflatoxin aflatoxin bị phá hủy hoàn toàn với việc xử lí mạnh amoniac hay hypochlorit Sự có mặt vòng lacton phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việc thủy phân môi trường kiềm Đặc tính quan trọng trình chế biến thực phẩm trình xử lí kiềm làm giảm nhiễm aflatoxin sản phẩm Tuy nhiên, xử lí kiềm nhẹ việc axit hóa làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu Moreau cộng nghiên cứu tính chất aflatoxin đưa kết sau: Bảng 2.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin Công Trọng Aflatoxin thức phân lượng B1 B2 G1 G2 M1 M2 tử C17H12O6 C17H14O6 C17H12O7 C17H14O7 C17H12O7 C17H14O7 phân tử 312 314 328 330 328 320 Nhiệt độ nóng chảy * ** 268-269 286-289 244-246 229-231 299 293 265-270 305-309 247-250 237-240 *** Huỳnh quang 252-266 Xanh lam 280-283 Xanh lam 246-247 Xanh lục Xanh lục Xanh lam tím Tím Ghi chú: * Kết Townsend ** Kết Stubblefield cộng *** Kết Beljaars 2.2.1 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu thấy hai chủng A.flavus A.parasiticus Các chủng tạo aflatoxin A.flavus phổ biến thường phân lập từ nguồn khác lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa Theo số liệu Schoroder Boller (1976), có từ 20-98% chủng phân lập A.flavus có khả tạo aflatoxin Ngoài hai loài A.flavus A.parasiticus có số loài khác có khả sinh aflatoxin yếu A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) A.bombycis (Varga et all 2003) Sản lượng aflatoxin thường tỉ lệ với trọng lượng với hệ sợi nấm tạo thành nuôi cấy: số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu sản lượng aflatoxin lớn nhất, giảm sút nhanh chóng lúc hệ sợi nấm tự phân giải Sự sản sinh aflatoxin điều kiện nuôi cấy thông thường lúc hình thành quan mang bào tử đính A.flavus, tăng dần đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ nước, yếu tố môi trường… Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, cực đại cho tạo aflatoxin 12 oC, 27oC 40 – 42oC theo thứ tự Một số chủng nấm mốc bị hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp môi trường không thích hợp, khả sinh độc tố tăng chủng nấm mốc cấy chuyển môi trường thích hợp Môi trường có bổ sung nấm men pepton axit amin với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 28oC) điều kiện tốt cho tạo thành độc tố aflatoxin 2.2.2 Sự nhiễm aflatoxin ngô lạc Cho tới nay, có mặt aflatoxin phát nhiều loại nông sản, thực phẩm 50 nước hầu hết châu lục Aflatoxin làm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt chăn nuôi lớn [9] Theo đánh giá FAO, ước lượng có khoảng 25% tất loại ngũ cốc bị ảnh hưởng độc tố nấm mốc [10] Mặc dù aflatoxin tìm thấy nhiều loại lương thực, thực phẩm khác hầu hết nhiễm tập trung xác định lạc ngô chủ yếu * Tình hình nhiễm aflatoxin ngô, lạc giới Những nghiên cứu Ablas K cộng [13] cho thấy nhiễm aflatoxin ngô nấm Aspergillus flavus gây nên vấn đề nghiêm trọng vùng trồng ngô đồng Missisipi Mỹ Trong năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, tác giả nghiên cứu mức nhiễm A.flavus ngô hạt năm 2000 dao động từ -100% (trung bình 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin ngô dao động từ đến 1590 ppb (trung bình 57ppb) Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên ngô đồng không tương quan với với nhiễm A.flavus Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ hạt ngô có khả tạo aflatoxin Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 400μg/kg) 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 133μg/kg) tìm thấy Uganda 97% mẫu đảo Cebu, Philippin trung bình 213μg/kg [18] Theo Goto cộng [12], 80 -85% số mẫu ngô thu thập từ kho bảo quản mùa mưa 1984 – 1985 Thái Lan nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb Còn lạc, năm 1973, nghiên cứu lạc bóc vỏ nước Mĩ cho thấy 15% 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg Stoloff, Krof Hald tìm thấy aflatoxin 86,5% 52 mẫu sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, mẫu có 3,465μg/kg Các aflatoxin tìm thấy 41% số mẫu tất cẩ mẫu bơ lạc kiểm tra năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg giá trị trung bình 500μg/kg * Tình hình nhiễm aflatoxin ngô, lạc Việt Nam Ở nước ta có số tác giả nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin ngô, lạc Nguyễn Thùy Châu cộng nghiên cứu thấy mức độ nhiễm aflatoxin ngô miền Nam miền Bắc Việt Nam tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% hàm lượng aflatoxin trung bình cao 63,8 ppb hàm lượng aflatoxin trung bình thấp 16,25% ppb tỉnh khác [3] Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễm aflatoxin B1 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ nhiễm ngô hạt 33%, ngô bột 74,2%, khô lạc 84,7% Theo kết nghiên cứu Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc có chứa aflatoxin B1, bên cạnh thực phẩm sử dụng cho người có chứa loại độc tố (68% mẫu lạc sản phẩm từ lạc) [8] Ngoài có Đặng Hồng Miên nghiên cứu nhiễm nấm mốc aflatoxin lạc [5] 2.2.3 Độc tính aflatoxin Ảnh chụp Hình 4: Hình ảnh bào tử chủng R.delemar R2 Hình : Cấu trúc bọng đỉnh giá cuống sinh bào tử chủng R.delemar R2 4.4 Khả khử nhiễm aflatoxin ngô, lạc chủng F.aurantiacum R.delemar phân lập Việc sử dụng chủng vi khuẩn F auratiacum vi nấm R.delemar hại cho người mà lại có khả khử nhiễm aflatoxin ngô lạc mức độ cao biện pháp lý tưởng Biện pháp thành công giúp làm giảm tổn thất nông sản sau thu hoạch , tăng giá trị nông sản, từ đẩy mạnh sản xuất nước tăng khả cạnh tranh mặt hàng nông sản nước ta thị trường quốc tế Các chủng F.aurantiacum R.delemar có khả khử aflatoxin cần đảm bảo tính an toàn cho thực phẩm đồng thời không gây độc hại với người 4.4.1 Khả khử aflatoxin ngô số chủng F.aurantiacum tuyển chọn Từ chủng F.aurantiacum định loại trên, tuyển chọn chủng F.aurantiacum có khả khử nhiễm aflatoxin ngô mức độ cao Bảng 4.5 thể khả khử aflatoxin nhiễm ngô mức độ cao chủng Bảng 4.5 Hiệu khử aflatoxin nhiễm ngô chủng F.aurantiacum tuyển chọn Kí hiệu STT chủng chủng F.aurantiacum F1 F7 F8 F11 F12 Hàm lượng aflatoxin mẫu ngô trước xử lí chủng F.aurantiacum (ppb) 200 200 200 200 200 Hàm lượng aflatoxin mẫu ngô sau xử lí chủng F.aurantiacum (ppb) Hiệu khử aflatoxin (%) 20 40 74 60 40 90 80 63 70 80 Kết bảng cho thấy việc sử dụng chủng F.aurantiacum khử lượng aflatoxin nhiễm ngô cách đáng kể Hàm lượng aflatoxin mẫu từ 200ppb trước xử lý giảm xuống 20ppb sau xử lý, tức hiệu khử aflatoxin đạt từ 63 đến 90% Trong số chủng tuyển chọn có chủng F.aurantiacum F1 có tác dụng khử aflatoxin rõ rệt nhất, hiệu khử aflatoxin nhiễm ngô chủng lên tới 90% 4.4.2 Khả khử aflatoxin ngô số chủng Rhizopus delemar tuyển chọn Bảng 4.6 Hiệu khử aflatoxin ngô chủng R.delemar tuyển chọn Hàm lượng Kí hiệu STT chủng chủng R.delemar R1 R2 R3 R4 R5 R6 aflatoxin mẫu ngô trước xử lí chủng R.delemar (ppb) 200 200 200 200 200 200 Hàm lượng aflatoxin mẫu ngô sau xử lí chủng R.delemar (ppb) 50 16 60 44 42 62 Hiệu khử aflatoxin (%) 75 92 70 78 79 69 Từ 15 chủng R.delemar định loại, tuyển chọn chủng có khả khử aflatoxin nhiễm ngô mức độ cao chủng R.delemar R1, R.delemar R2, R.delemar R3, R.delemar R4, R.delemar R5 R.delemar R6 Kết bảng 4.5 cho thấy việc sử dụng chủng R.delemar khử lượng aflatoxin nhiễm ngô cách đáng kể Hàm lượng aflatoxin mẫu giảm từ 200ppb trước xử lý xuống 22ppb sau xử lý, tức hiệu khử aflatoxin đạt từ 69 đến 92% Trong số chủng khảo sát có chủng R.delemar R2 có tác dụng khử aflatoxin nhiễm ngô rõ rệt Hiệu khử aflatoxin nhiễm ngô chủng R.delemar R2 92% 4.2.3 Khả khử aflatoxin lạc số chủng Flavobacterium aurantiacum tuyển chọn Bảng 4.7 Hiệu khử aflatoxin lạc chủng F.aurantiacum tuyển chọn STT Kí hiệu chủng chủng F.aurantiacum F1 F7 F11 F12 Hàm lượng aflatoxin mẫu lạc trước xử lí chủng F.aurantiacum (ppb) 200 200 200 200 Hàm lượng aflatoxin mẫu lạc sau xử lí chủng F.aurantiacum (ppb) Hiệu khử aflatoxin (%) 28 34 80 80 86 83 60 60 Từ chủng F.aurantiacum định loại, tuyển chọn chủng F.aurantiacum có khả khử aflatoxin nhiễm lạc mức độ cao Kết bảng 4.7 cho thấy việc sử dụng chủng F.aurantiacum khử lượng aflatoxin nhiễm lạc cách đáng kể Hàm lượng aflatoxin mẫu giảm từ 200ppb trước xử lý xuống 28ppb sau sử lý, tức hiệu khử aflatoxin đạt từ 60 đến 86% Trong số chủng khảo sát có chủng F.aurantiacum F1 có hoạt tính khử aflatoxin cao Hiệu khử aflatoxin lạc chủng 86% Bảng 4.10 Hiệu khử aflatoxin ngô chủng R.delemar tuyển chọn STT chủng Kí hiệu chủng R.delemar Hàm lượng aflatoxin mẫu ngô trước xử lí chủng Hàm lượng aflatoxin mẫu ngô sau xử lí chủng R.delemar (ppb) Hiệu khử aflatoxin (%) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R.delemar (ppb) 200 200 200 200 200 200 36 22 64 46 54 48 82 89 68 77 73 76 Kết bảng cho thấy việc sử dụng chủng R.delemar khử lượng aflatoxin nhiễm ngô cách đáng kể từ 200ppb trước xử lý xuống 22 ppb sau, tức hiệu khử aflatoxin đạt từ 68 đến 89% Trong số chủng khảo sát có chủng R.delemar R2 có tác dụng khử aflatoxin ngô rõ rệt nhất, hiệu khử 89 % PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 40 mẫu đất thu thập từ số tỉnh miền Bắc Việt Nam, phân lập định loại chủng Flavobacterium aurantiacum Đã tuyển chọn chủng Flavobacterium aurantiacum có khả khử nhiễm aflatoxin ngô mức độ cao, chủng F.aurantiacum F1 có tác dụng khử aflatoxin nhiễm ngô rõ rệt nhất, đạt 90% Tuyển chọn chủng F.aurantiacum có khả khử aflatoxin nhiễm lạc mức độ cao, chủng F.aurantiacum F1 có tác dụng khử nhiễm aflatoxin lạc rõ rệt nhất, hiệu khử 86% Từ 25 mẫu nông sản thực phẩm thu thập thu thập chợ tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh phân lập 20 chủng Rhizopus delemar Tuyển chọn chủng R.delemar có khả khử aflatoxin ngô mức độ cao, chủng R.delemar R1 có tác dụng khử rõ rệt nhất, hiệu khử 92% Tuyển chọn chủng R.delemar có khả khử aflatoxin nhiễm lạc mức độ cao, chủng R.delemar R1* có tác dụng khử rõ rệt nhất, hiệu khử 89% 5.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thùy Châu cộng (1997) Nghiên cứu mức độ nhiễm mốc aflatoxin ngô - Biện pháp khử độc tố Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994 -1995 NXB Nông Nghiệp phát triển nông thôn Nguyễn Thùy Châu (1996) Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố (Mycotoxin) ngô, gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ Luận án Phó tiến sĩ khoa học sinh học Bộ giáo dục đào tạo, Trường đại học Khoa học tự nhiên Nguyễn Thùy Châu cộng (1995) Mức độ nhiễm aflatoxin ngô số tỉnh Việt Nam Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản chế biến nông sản thu hoạch NXB Nông nghiệp Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000) Vi nấm dùng công nghệ sinh học NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đặng Hồng Miên (1982) Nấm mốc số sản phẩm công nông nghiệp Phương pháp khử biện pháp phòng chống NXB Khoa học Kỹ thuật Đậu Ngọc Hào (1992) “Thức ăn nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin chúng với gà công nghiệp” Tạp chí Nông nghiệp công nghệ thực phẩm Số Đậu Ngọc Hào (1993) Sử dụng hợp chất amin NaHSO làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 ngô hạt dầu lạc bị nhiễm nấm mốc Kết nghiên cứu khoa học chăn nuôi thú y Độc tố nấm mốc Afflatoxin B1 số loại thức ăn gia súc thực phẩm cho người, Báo Người Lao Động, 9/1/2002 Nguyễn Phùng Tiến (1983) Nấm mốc số sản phẩm thực phẩm Luận án tiến sĩ y học Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội 10.Phạm Văn Tất (1996), tác hại Aflatoxin Tạp chí thuốc sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996) 11.Tiêu chuẩn Việt Nam 5617 – 1991 Phương pháp xác định aflatoxin ngũ cốc Tiếng Anh 12.Anderson, H W., E W Nehring, and W R Wichser 1973 Aflatoxin Contamination of Corn in the Field Journal of Agriculture and Food Chemistry 23:775 - 782 13.AOAC (1990) Official method of analysis 14.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol.1 (The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria) (D.R Boone and R.W Castenholz, eds.), Springer- Verlag, New York (2001) Pp 465 – 466 15.Bhat, R.V(1991), Aflatoxin Successes and Fairlures of three Decades of Research Fungi and Mycotoxins in Stored Products, ACIAR Proceedings No 36 1991, p80 16.Bryden, W L W Burgess (1985), Palantpathogens and mycotoxins, pp 35 – 56 The University of Sydney, February - 1985 17.Butler, W.H (1964) Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats B J Cancer 18:756 18.Doronina, O and Makshimenko, K (1984) Analytical methods of detection, identification, quantitive determination of aflatoxin in foodstuff ang fodder, FAO/ UNEP/ USSR International training course “Training activities on food contamination control and monitoring with special reference to mycotoxin” Moscow 19.Dawson, R J (1991), A Global view of the Mycotoxin Problem Fungi and mycotoxins, in stored prpducts ACIAR Proceedings N,.36 1991 [28tk] 20.FAO (1990), Control of Aflatoxin in Asia, regional workshop ChengMai, Thai Lan, 2nd Feb, 1990, food and Agricuture organization of United Nations , Rome, 51 p 21.FAO (2005), the State of World Fisheries and Aquaculture, 159pp FAO Fhisers Deparment, Rome Italy, Rome 22.FAO(1995), Woldwide regulations for mycotoxins, 1995, A compendium FAO, Rome, Italia 23.Goto, T., Kawasugi S.,Tsuzuta., Okazaki H., Siriach P., Buangsawon D., and Manabe M (5/1986) “Aflatoxin contamination of maize in Thailand Aflatoxin cotamination of maize harvested in the raining seasons of 1984 and 1985” Proc Jpn Assoc Mycotoxincol, 24, pp.53 24.H K Ablas, R.M Zablotowicz, and M.A Locke, Spatial variability of Aspergillus flavus soil populations under different crops and corn grain colonization and aflatoxins Can.J.Bot 82 (12); 1768-1775 (2004) 25.Kawamura, O., et aflatoxin (1989) “Asensitive enzyme linked immunosorbent assay of ochratoxin A based on monoclonal antinbodies” Toxicol, 27, pp.887 – 897 26.Larone, D H 1995 medically Important Fungi – A Guide to Indentification Washington, D.C 27.Sigrid, P (1994), Mycotoxins in animals husbandry, Biomin, Austria, P.P 1- 28 28.Stoloff, L (1976), Occurrence of mycotoxins in foods and feeds American Chemical Society, pp 23 - 43 29.Widstson N.W., Wilson D.M., Mc Millian W (1981) “Aflatoxin contamination of preharvest corn as influenced by timing and method of inoculation”, Envinronmental microbiology, 27, pp.249 – 251 Tài liệu từ internet 30.Dương Thanh Liêm(2003) http://.vnn.Vietnam 31.Vệ sinh an toàn thực phẩm (2006) Độc tố aflatoxin http://ww.nutifood.com.vn 32.http://vnmedia.Vietnam 33.http://doctorfungus.org LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thùy Châu - Nguyên chủ nhiệm môn vi sinh Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập để hoàn thành tốt khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể bộ, kĩ thuật viên phòng Vi sinh Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch giúp đỡ em thời gian vừa qua Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy, Cô Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho em tham gia thực tập hoàn thành khóa luận Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2008 Sinh viên Nguyễn Thị Minh Châu MỤC LỤC Trang PHẦN - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu .3 1.2.2 Nội dung nghiên cứu PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương độc tố nấm mốc 2.2 Độc tố aflatoxin 2.2.1 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc 2.2.2 Sự nhiễm aflatoxin ngô lạc 2.2.3 Độc tính aflatoxin 11 2.2.4 Ảnh hưởng aflatoxin sức khỏe người 11 2.2.5 Giới hạn aflatoxin cho phép 12 2.3 Biện pháp ngăn ngừa hạn chế nấm mốc .15 2.4 Vấn đề khử nhiễm aflatoxin 15 2.4.1 Phương pháp vật lí .16 2.4.2 Phương pháp khử độc tố hóa chất 18 2.4.3 Khử nhiễm aflatoxin đường sinh học .19 2.4.3.1 Khử nhiễm aflatoxin Flavobacterium aurantiacum 19 2.4.3.2 Khử nhiễm aflatoxin Rhizopus delemar 20 PHẦN - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.1 Vật liệu 21 3.1.2 Môi trường 21 3.1.3 Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin .22 3.1.4 Dụng cụ thí nghiệm 23 3.2 Phương pháp .24 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất 24 3.2.2 Phương pháp phân lập 24 3.2.2.1 Phương pháp phân lập Flavobacterium aurantiacum 24 3.2.2.2.Phương pháp phân lập Rhizopus delemar 24 3.2.3 Phương pháp định loại Flavobacterium aurantiacum 25 3.2.4 Phương pháp định loại Rhizopus delemar 25 3.2.5 Phương pháp làm tiêu quan sát F.aurantiacum 25 3.2.6 Phương pháp làm tiêu quan sát nấm mốc 26 3.2.7 Phương pháp phân tích aflatoxin 26 3.2.8 Phương pháp xác định hiệu khử nhiễm aflatoxin ngô, lạc chủng Flavobacterium aurantiacum Rhizopus delemar 30 3.2.8.1 Phương pháp xác định hiệu khử nhiễm aflatoxin ngô, lạc chủng Flavobacterium aurantiacum .30 3.2.8.2 Phương pháp xác định hiệu khử nhiễm aflatoxin ngô, lạc chủng Rhizopus delemar 31 PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 4.1 Kết phân lập chủng Flavobacterium aurantiacum từ số mẫu đất thu thập tỉnh miền Bắc Việt Nam 32 4.2 Định loại chủng 33 4.2.1 Đặc điểm sinh lý chủng phân lập .33 4.2.2 Khả thủy phân 34 4.2.3.Khả lên men 35 4.3 Phân lập chủng R.delemar từ số mẫu nông sản, thực phẩm thu thập chợ số tỉnh miền Bắc Việt Nam 37 4.3.1 Phân lập chủng R.delemar từ số mẫu nông sản thực phẩm .37 4.3.2 Kết định loại R.delemar 38 4.4 Khả khử nhiễm aflatoxin ngô, lạc chủng F.aurantiacum R.delemar phân lập 43 4.4.1 Khả khử aflatoxin ngô số chủng F.aurantiacum tuyển chọn 43 4.4.2 Khả khử aflatoxin ngô số chủng Rhizopus delemar tuyển chọn .44 4.2.3 Khả khử aflatoxin lạc số chủng Flavobacterium aurantiacum tuyển chọn 45 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận .47 5.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin Bảng 2.2 Tỉ lệ dân số bị ung thư gan hàm lượng aflatoxin trung bình có thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993) 12 Bảng 2.3 Giới hạn aflatoxin số nước theo tiêu chuẩn FDA .13 Bảng 2.4 Quy định độc tố aflatoxin B1 aflatoxin tổng số Việt Nam .14 Bảng 4.1 Khả thủy phân số chất chủng F.aurantiacum phân lập từ đất số tỉnh miền Bắc Việt Nam 33 Bảng 4.2 Khả lên men số loại đường số chủng F.aurantiacum phân lập sơ 35 Bảng 4.3 Kết phân lập chủng Rhizopus delemar từ số mẫu nông sản, thực phẩm 37 Bảng 4.4 Hiệu khử aflatoxin nhiễm ngô chủng F.aurantiacum tuyển chọn 43 Bảng 4.6 Hiệu khử aflatoxin ngô chủng R.delemar tuyển chọn 44 Bảng 4.6 Hiệu khử aflatoxin lạc chủng F.aurantiacum tuyển chọn 45 Bảng 4.10 Hiệu khử aflatoxin ngô chủng R.delemar tuyển chọn 46 ... nghiên cứu đề tài : Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn vi nấm có khả khử aflatoxin nhiễm ngô lạc mức độ cao 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tìm số chủng Flavobacterium... hình nhiễm aflatoxin ngô, lạc Vi t Nam Ở nước ta có số tác giả nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin ngô, lạc Nguyễn Thùy Châu cộng nghiên cứu thấy mức độ nhiễm aflatoxin ngô miền Nam miền Bắc Vi t... Flavobacterium aurantiacum Rhizopus delemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin mức độ cao khả ứng dụng chúng khử nhiễm aflatoxin ngô lạc 1.2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập số chủng Flavobacterium aurantiacum