Luận án Tiến sĩ Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Nguyễn Anh Dũng TS Lê Thị Ánh Hồng Tp Hồ Chí Minh – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học GS TS Nguyễn Anh Dũng TS Lê Thị Ánh Hồng Các số liệu kết thu luận án hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Trịnh Thị Huyền Trang LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực luận án nhận quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Quý quan, thầy cô, đồng nghiệp, anh chị, bạn bè gia đình Đầu tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Anh Dũng TS Lê Thị Ánh Hồng, người thầy, người hướng dẫn khoa học mà kính trọng ln tận tình bảo hướng dẫn nội dung, phương pháp thực thí nghiệm giúp tơi trưởng thành q trình nghiên cứu để hồn thành luận án; TS Võ Thị Phương Khanh, người thầy đặc biệt ln dìu dắt, giúp đỡ, bảo động viên, hỗ trợ tơi suốt q trình thực luận án Em xin gửi đến lịng biết ơn chân thành sâu sắc Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh Phịng đào tạo Sau đại học thuộc Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn tất mơn học suốt q trình học tập Viện Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trường ĐH Tây Nguyên, Khoa KHTN&CN, Viện CNSH&MT hỗ trợ, hướng dẫn giúp đỡ thời gian thực hoàn thành luận án Các bạn bè, đồng nghiệp, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Sinh học, Khoa KHTN&CN hỗ trợ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể Quý thầy cô, bạn bè Gia đình ln bên tơi, u thương, động viên, chia sẻ khó khăn, buồn vui động lực để tơi cố gắng hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn đề tài cấp Bộ thuộc Chương trình khoa học cơng nghệ “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phát triển bền vững hồ tiêu (Piper Nigrum L.) Tây Nguyên” Bộ Giáo dục Đào tạo hỗ trợ phần kinh phí cho nghiên cứu luận án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành tới em sinh viên yêu quý lớp CNSH &SH K14, CNSH &SH K15, CNSH&SH K16 đồng hành hỗ trợ tơi suốt q trình hồn thành luận án Tác giả luận án Trịnh Thị Huyền Trang MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án .1 Mục tiêu nghiên cứu luận án Các nội dung nghiên cứu luận án 4.Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Tổng quan hồ tiêu .4 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học hồ tiêu 1.2 Thực trạng sản xuất hồ tiêu Việt Nam tỉnh Tây Nguyên 1.2.1 Diện tích, suất sản lượng hồ tiêu tỉnh Tây Nguyên 1.2.2 Tình hình sâu bệnh hại hồ tiêu Tây Nguyên 1.3 Bệnh hại rễ hồ tiêu 1.3.1 Bệnh chết nhanh hồ tiêu Phytophthora 1.4 Các giải pháp tổng hợp để kiểm soát dịch bệnh hồ tiêu sản xuất bền vững 20 1.4.1 Thiết kế vườn trồng hồ tiêu 20 1.4.2 Vệ sinh đồng ruộng 21 1.4.3 Sử dụng giống chống chịu bệnh 21 1.4.4 Sử dụng phân bón cân đối, hợp lý cho hồ tiêu 21 1.4.5 Phòng trừ thuốc bảo vệ thực vật .22 1.4.6 Biện pháp sinh học 22 1.5 Vai trò chủng vi khuẩn vùng rễ kiểm soát sinh học 23 1.5.1 Vùng rễ vi khuẩn vùng rễ 23 1.5.2 Sự phân bố vi khuẩn vùng rễ 24 1.5.3 Cơ chế kháng bệnh rễ hồ tiêu vi khuẩn vùng rễ 24 1.6 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật vùng rễ hồ tiêu 28 i 1.6.1 Trên giới 28 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.1.Vật liệu nghiên cứu .34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ hồ tiêu Tây Nguyên, định danh chủng có tiềm kháng Phytophthora, Fusarium kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ hồ tiêu Tây Nguyên 36 2.2.2 Nghiên cứu đặc tính xác định hoạt chất kháng Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne chủng vi khuẩn tiềm tuyển chọn .51 2.2.3 Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm tuyến trùng từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 63 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu .64 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ hồ tiêu Tây Nguyên, định danh chủng có tiềm kháng Phytophthora, Fusarium kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ hồ tiêu Tây Nguyên .65 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu có tiềm kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ hồ tiêu điều kiện in vitro .65 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu có tiềm kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ hồ tiêu điều kiện vườn ươm 74 3.1.3 Định danh chủng có tiềm kháng Phytophthora, Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ hồ tiêu 92 3.2 Nghiên cứu đặc tính xác định hoạt chất kháng Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne chủng vi khuẩn tiềm tuyển chọn 98 3.2.1 Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn 98 3.2.2 Xác định đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium chủng vi khuẩn tuyển chọn 105 ii 3.2.3 Phân tách, xác định cấu trúc hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng nấm hợp chất thứ cấp từ chủng vi sinh vật tuyển chọn 120 3.3 Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm tuyến trùng từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 126 3.3.1 Sản xuất chế phẩm vi khuẩn vùng rễ có khả kháng Phytophthora 126 3.3.2 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật ngoại sinh vùng rễ có khả kháng nấm Fusarium 128 3.3.3 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật ngoại sinh vùng rễ có khả kháng tuyến trùng 130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 133 Kết luận .133 Kiến nghị .133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AE : Antagonistic Efficacy (Hiệu suất đối kháng) B : Bacillus BM : Buôn Ma Thuột BH : Buôn Hồ DS : Đắk Song DC : Đức Cơ DR : Đắk Rlấp ĐC : Đối chứng Cs : Cộng CS : Chư Suê CP : Chư Pứh CJ : Cư Jut CK : Cư Kuin EK : Ea Kar F : Fusarium HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IJ : Infective Juvenile (Ấu trùng cảm nhiễm) ISR : Induced Systemic Resistance (Hệ thống kháng cảm ứng) KN : Krông Năng LB : Luria-Bertani Broth LC-MS : Liquid chromatography-mass spectrometry M : Meloidogyne NMR : Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) NNPTNT : Nông nghiệp Phát triển nông thôn P : Phytophthora PGA : Potato Glucose Agar PGPR : Plant-Growth Promoting Rhizobacteria (Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật) PPN : Plant parastic nematodes (Tuyến trùng ký sinh thựcvật) PPA : Penicillin Pimaricin Agar RB Rhizobacteria (Vi khuẩn vùng rễ) RKN : Root knot nematode (tuyến trùng gây sần rễ) VSV : Vi sinh vật iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích, sản lượng hồ tiêu Việt Nam từ năm 2010-2019 Bảng 1.2 Diện tích, suất sản lượng hồ tiêu số vùng Việt Nam Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm kháng Phytophthora capsici 42 Bảng 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả kháng nấm Fusarium hồ tiêu điều kiện vườn ươm .44 Bảng 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne sp hồ tiêu điều kiện vườn ươm 47 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 51 Bảng 2.5 Chương trình pha động cột C18 56 Bảng 3.1 Hiệu suất đối kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ hồ tiêu tỉnh Tây Nguyên .66 Bảng 3.2 Hiệu kháng Phytophthora capsici đoạn thân hồ tiêu 68 Bảng 3.3 Khả đối kháng chủng vi khuẩn vùng rễ nấm Fusarium điều kiện in vitro 69 Bảng 3.4 Khả kháng nấm Fusarium sp đoạn thân hồ tiêu 06 chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu 71 Bảng 3.5 Tỷ lệ tử vong tuyến trùng 43 chủng vi khuẩn vùng rễ .73 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân, hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora capsici 75 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến sinh trưởng rễ hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora 76 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn vùng rễ đến số tiêu sinh trưởng kháng bệnh hồ tiêu vườn ươm sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora 77 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng thân hồ tiêu vườn ươm 80 Bảng 3.10 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng rễ mật độ vi sinh vật tổng số đất hồ tiêu vườn ươm 81 v Bảng 3.11 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến số tiêu sinh trưởng kháng bệnh hồ tiêu sau 120 ngày lây nhiễm nấm Fusarium 84 Bảng 3.12 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân hồ tiêu vườn ươm 85 Bảng 3.13 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến rễ hồ tiêu 87 Bảng 3.14 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến số tiêu bệnh hồ tiêu vườn ươm 88 Bảng 3.15 Đặc điểm hình thái đặc tính sinh hóa chủng có hoạt tính kháng nấm tuyến trùng cao .92 Bảng 3.16 Kết định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA chủng có hoạt tính kháng nấm tuyến trùng cao 93 Bảng 3.17 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng RB.DS29 98 Bảng 3.18 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng RB.CJ41 RB.EK7 99 Bảng 3.19 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng RB.DS29, RB.CJ41 RB.EK7 100 Bảng 3.20 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng vi khuẩn RB.DS29 101 Bảng 3.21 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng RB.DS29, RB.CJ41 RB.EK7 103 Bảng 3.22 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh trưởng chủng RB.DS29, RB.CJ41 RB.EK7 104 Bảng 3.23 Khả ức chế nấm bệnh dịch nuôi cấy chủng RB.DS29 106 Bảng 3.24 Các hợp chất thứ cấp kháng Phytophthora của chủng RB.DS29 phân tích GC-MS 108 Bảng 3.25 Phân tích LC- MS hợp chất kháng Phytophthora chủng RB.DS29 109 Bảng 3.26 Khả ức chế nấm bệnh dịch nuôi cấy chủng RB.CJ41 .110 Bảng 3.27 Kết phân tích GC-MS chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 chứa chất có đỉnh (peak) rõ .113 Bảng 3.28 Kết phân tích LC-MS chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 114 vi 5.10 Phổ HSQC hợp chất VK05 P39 5.11 Phổ HMBC hợp chất VK05 \ P40 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình Hoạt tính kháng nấm Phyopthora số chủng vi khuẩn vùng rễ P41 Hình Các nghiệm thức sau 90 lây nhiễm bệnh Phytophthora điều kiện vườn ươm Hình Chiều cao chiều dài rễ tiêu nghiệm thức sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora điều kiện vườn ươm P42 B A Hình A: Hình biểu bệnh Phytophthora B: Hình bị bệnh hồn tồn Bảng Đặc điểm sinh hóa chủng RB.DS29, RB.CJ41 RB.EK7 P43 Hình Ảnh hưởng thời gian nhân giống lên men đến mật độ chủng Bacillus velezensis RB.DS29 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ chủng RB.DS29 Hình Ảnh hưởng mơi trường đến mật độ chủng RB.CJ41 P44 Hình Ảnh hưởng pH đến mật độ chủng RB.CJ41 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ chủng RB.CJ41 Hình 10 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến mật độ chủng RB.CJ41 P45 Hình 11 Ảnh hưởng pH đến mật độ chủng RB.EK7 12h P46 24h 36h Hình 12 Ảnh hưởng thời gian đến mật độ chủng RB.EK7 Hình 13 Ảnh hưởng dịch ni cấy đến hoạt tính kháng Phytophthora P47 Hình 14 Tác động hợp chất phân tách đến trứng tuyến trùng P48 Hình 15 Hoạt tính kháng Phytophthora hợp chất VK01, VK04 VK05 sau ngày nồng độ 20mg/ml Hình 16 Hoạt tính kháng nấm Fusarium hợp chất VK01, VK04 VK05 sau ngày nồng độ 20mg/ml Hình 17 Sợi Phytophthora bị gãy gập, xoắn phần tiếp giáp với đĩa giấy chứa hợp chất tinh khiết P49 Hình 18 Sợi Phytophthora bị xoắn phần tiếp giáp với đĩa giấy chứa hợp chất tinh khiết Hình 19 Nấm Phtophthora hệ sợi đĩa đối chứng Hình 20 Hệ sợi nấm Fusarium bị đứt gãy P50 Hình 21 Trứng tuyến trùng bị tác động hợp chất tinh khiết Hình 22 Hệ thống lên men vi khuẩn DS29 lúc 8g Hình 23 Mật độ vi khuẩn Bacillus velezensis ĐS29 chế phẩm với chất mang khác thời điểm bảo quản 90 ngày P51 Hình 24 Các chất mang sau phối trộn với dịch vi khuẩn P52 Hình 25 Mật độ vi khuẩn chế phẩm vi khuẩn vùng rễ RB.CJ41 Hình 26 Hoạt tính kháng nấm chế phẩm chứa vi khuẩn RB.CJ41 P53