Ứng dụng vi khuẩn và vi nấm trong giảm thiểu aflatoxin nhiễm trên ngô lạc
MỤC LỤC
5 người/năm
Vấn đề khử nhiễm aflatoxin
Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộng đồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được.
Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn.
Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Nhưng giá xử lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam. Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi.
Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc. Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân hủy aflatoxin.
Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. Từ kết quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu khuyến cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trong thức ăn gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp
Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường Saubauraud) thạch nghiêng. Chúng tôi tiến hành các phản ứng sinh lý như xác định khả năng di động, sắc tố tế bào, khả năng chịu muối, nhu cầu về NaCl; các phản ứng sinh hóa như khả năng thủy phân gelatin, khả năng thủy phân casein, khả năng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân celluloza, các khả năng lên men đường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza. Để định loại các R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng Rhizopus phân lập trên môi trường Sabouraud trong 24 giờ, sau đó tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của R.delemar theo khóa phân loại của Laurone [26].
Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên sau đó nhỏ một xanhmetylen, đậy lamen lên sau đó quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 40. Lớp nước aceton được chiết suất với 40 ml cloroform (3 lần), loại bỏ lớp nước aceton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100μl cloroform, giữ ở 4oC cho đến khi tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. Khoá luận tốt nghiệp. Sơ đồ Quy trình chiết tách aflatoxin lạc lỏng). Phát hiện alflatoxin bằng cách phát hiện sự phát huỳnh quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối đưới đèn cực tím sóng dài ( có bước sóng 356 nm).
Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có alflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử alflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng điều có thể xem như có alflatoxin trong mẫu thử. Aflatoxin sau khi kết hợp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị.
V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetat (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetat (ml). V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (μl) m là lượng alfatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g). Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng F.aurantiacum phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: bổ sung một lượng hỗn dịch tế bào F.aurantiacum sao cho có nồng độ là 106 tế bào trên 1ml môi trường bột ngô lỏng (hoặc môi trường bột lạc lỏng) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb và tiến hành nuôi cấy ở 25oC trong 9 ngày.
Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng F.aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý. Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng R.delemar phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: Bổ sung một lượng R.delemar với mật độ 106 bào tử/g vào 250 g ngô (lạc) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb. Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng R.delemar thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý.
Tiếng Anh
Locke, Spatial variability of Aspergillus flavus soil populations under different crops and corn grain colonization and aflatoxins Can.J.Bot 82 (12); 1768-1775 (2004). “Aflatoxin contamination of preharvest corn as influenced by timing and method of inoculation”, Envinronmental microbiology, 27, pp.249 – 251.