Phương pháp sinh lý, sinh hóa
Xác định khả năng đồng hóa các loại đường
1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường cơ sở (Bacto yeast nitrogen base 6,7g; Bacto yeast extract 50 mg; Bacto casamino acid 50 mg): L- arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.
Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, sau 2 -3 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng được tuyển chọn.
Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.
Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza
Phân vào mỗi ống nghiệm 2 ml môi trường có thành phần như sau: Cao nấm men 0,5%
Glucoza 2%
Cho vào mỗi ống 1 ống Durham để ngược, sau đó đem khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Cấy vào mỗi ống một vòng que cấy 1-2 ngày tuổi, quan sát sau 1 tuần nuôi cấy.
Phương pháp sinh học phân tử
Xác định trình tự rARN của chủng nghiên cứu theo phương pháp của Manitis và cộng sự [1982]. Bao gồm các bước:
- Cho 100 µl đệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml. Lấy một vòng que cấy mẫu, trộn thật đều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên.
- Đun hỗn hợp 100oC trong 15 phút. Thêm 100 µl kaliaxetat, sau đó trộn đều và đặt trên đá 1 giờ.
- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó lấy phần nổi phía trên.
- Thêm 200 µl CHCl3-Isoamyl alcohol và trộn đều, ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút, sau đó lấy phần nổi phía trên. Làm lại như vậy thêm một lần nữa.
- Thêm 200µl 2-propanol (Iso-propanol) và đặt trong đá 20phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa.
- Rửa sạch phần tủa (pellet) bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút và lấy tủa.
- Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.
- Hoà tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày. - Giữ ở -20oC trước khi sử dụng.
Phản ứng PCR - Hỗn hợp phản ứng: 10X Buffer 10µl dNTP mixture 16µl Mồi xuôi 2µl Mồi ngược 2µl TaqTm 1.2 µl Mẫu ADN ( 50 ng) 1 µl Nước cất đến 100µl
+ Mồi cho phản ứng PCR các vùng ITS (Internal transcribed spacer) Mồi xuôi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ Mồi ngược ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’
Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 3 phút
2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau
94 1 phút
52 1 phút 30 giây 72 2 phút 30 giây
3 72 7 phút
4 4 -
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 µl dung dịch 6X loading buffer với 5 µl mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5
µl/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel
Tinh sạch ADN sau khi thực hiện phản ứng PCR.
- Sử dụng bộ kit QIA (Invitrogen, Đức) thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. + Thêm dung dịch PB vào mẫu theo thể tích 3:1. Trộn đều, đưa vào cột, ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây.
+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột.
+ Bổ sung 500 µl PE lên cột. Ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây + Đổ bỏ dịch dưới cột
+ Ly tâm tiếp 13.000 v/p trong 2 phút + Chuyển cột sang ống eppendoft mới
+ Thêm 30µl nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút + Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút
+ Lấy dịch phía dưới. - Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:
Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD260/OD280 > 1,7
Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.
Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng như sau :
Terminator Ready Reaction Mix 8 µl Mẫu ADN sau PCR 200 ng/ml
Mồi 1 µl
Nước cất đủ đến 20µl
Mồi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ Mồi ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’ - Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing:
Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 96 1 phút
2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau
96 10 giây
50 5 giây
60 4 phút
3 4 -
Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn được duỗi ra. - Tinh sạch sản phẩm cho sequencing:
Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5µl EDTA 1,25 M, thêm 60µl ethanol 100%. Trộn thật nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100µl ethanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Làm khô mẫu băng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.
Đọc trình tự ADN.
Trình tự của ITS rARN của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen.