Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi

MỞ ĐẦU Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hố vật ni thơng qua tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột coi giải pháp hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi phong phú chủng loại số lượng, biến động cấu, số lượng loài vi sinh vật đường ruột nguyên nhân chủ yếu dẫn đến rối loạn tiêu hoá hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn nuôi dưỡng nhằm tạo nên cân tối ưu lồi vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ hướng nghiên cứu nhà nghiên cứu nước quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân nhóm vi khuẩn có lợi có hại đường tiêu hố gia súc, gia cầm Biện pháp cổ điển ứng dụng rộng rãi từ năm 1950 kỷ trước sử dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi ngày bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi -Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm giải pháp thay kháng sinh ngày trở thành cấp bách Một giải pháp hữu hiệu probiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích thức ăn nhằm cải thiện cân hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ Các sản phẩm probiotic nhập dùng chăn ni có mặt thị trường Việt Nam nhiều đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật khơng phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ địa Mặt khác, nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn ni nước ta cịn hạn chế Chúng thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi” với định hướng đưa giải pháp cơng nghệ để sản xuất chế phẩm nói nguyên liệu nước Đề tài thực thành công mở triển vọng việc sản xuất ======================================== =================== sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày cao ngành chăn ni hữu (hồn tồn dựa vào nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp nước ta, hạn chế nhập ======================================== =================== Chương – TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử định nghĩa probiotic 1.1.1 Lịch sử probiotic Những nghiên cứu probiotic bắt đầu vào kỷ 20, Henry Tisser (1900), bác sỹ người Pháp quan sát thấy phân đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có vi khuẩn lạ hình trứng hình chữ Y đứa trẻ khỏe mạnh [53] Sau năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – chứng minh việc tiêu thụ Lactobacillus hạn chế nội độc tố hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích điều bí ẩn sức khỏe người Cô-dăc Bulgary, họ sống khỏe mạnh tuổi thọ lên tới 115 tuổi hơn, nguyên nhân họ tiêu thụ lớn sản phẩm sữa lên men, điều ông báo cáo sách “sự kéo dài sống” – The Prolongation of life (1908) [53] Có thể nói Tisser Metchnikoff người đưa đề xuất mang tính khoa học probiotic, làm sở cho nghiên cứu probiotic [26] Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập vi khuẩn lactic từ phân em thiếu nhi khỏe mạnh [27] Cùng năm đó, nhà nghiên cứu Hoa Kỳ chứng minh Lactobacillus acidophilus có khả làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát vi khuẩn đường ruột đóng vai trị định q trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp số vitamin chất dinh dưỡng khác mà thể vật chủ không tự sản xuất [26] Sau năm, đồ uống lên men – đặt tên “Yakult” từ sữa cho hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) sản xuất Khái niệm chung probiotics chấp nhận Châu Á nhiều năm sản phẩm lên men từ sữa probiotic giới thiệu Châu Âu năm thập niên 80 [27] ======================================== =================== Ngày nay, sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria Lactobacillus tiêu thụ rộng rãi phổ biến khắp giới nguồn thực phẩm giúp tăng cường sức khỏe cho người vật nuôi 1.1.2 Định nghĩa probiotic Theo ngơn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa “vì sống” Thuật ngữ probiotic Parker đề nghị sử dụng lần vào năm 1974 để “những vi sinh vật chất làm cân hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) Từ đến thuật ngữ probiotic giới sử dụng để chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích đưa vào thể động vật thông qua thức ăn nước uống tạo nên ảnh hưởng có lợi cho vật chủ Kể từ xuất hiện, khái niệm probiotic chưa có định nghĩa thống Tuy nhiên, có hai định nghĩa cho phản ánh đầy đủ chất probiotic sử dụng nhiều ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế giới (WHO, 2001), probiotic “các vi sinh vật sống đưa vào thể theo đường tiêu hoá với số lượng đủ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” 1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột tác động hệ vi sinh vật đến sức khỏe vật nuôi Bên cạnh hấp thụ chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa cịn đóng vai trị quan trọng quan miễn dịch lớn thể Do đó, hệ thống bảo vệ hàng rào quan trọng chống lại tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Thêm vào chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với phản ứng đặc hiệu không đặc hiệu, giúp chống lại vi sinh vật gây bệnh Khu hệ vi sinh vật đường ruột coi yếu tố chống lại tác nhân gây bệnh [36] Khi cịn bào thai, đường tiêu hố vật nuôi trạng thái vô trùng, vài sau sinh vi sinh vật bắt đầu cư trú trở thành “cư dân” bình thường đường tiêu hoá (WHO, 2001) Theo thời gian, tiếp ======================================== =================== xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt qua thức ăn nước uống, số lượng tính đa dạng sinh học vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú đường tiêu hóa vật ni cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên thể chúng (Fonty, 1995) Số lượng lồi lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999) Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật phân đoạn khác đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non ruột già) loài động vật dày đơn khác (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 109-1012 cfu/ml chất chứa tương ứng) (Jans, 2005) Sức khỏe vật nuôi phụ thuộc vào yếu tố chính: trạng thái sinh lý vật chủ, phần thức ăn hệ vi sinh vật Các yếu tố chịu tác động môi trường, stress tác động qua lại lẫn Trong số nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trị trung tâm, biến động bất lợi hai yếu tố lại ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994) Sự cộng sinh loài vi sinh vật đường tiêu hố vật ni (chủ yếu ruột) tạo nên hệ sinh thái mở mối cân quần thể vi sinh vật xác lập thời gian ngắn sau sinh (Jans, 2005) Có nhiều quan điểm khác mối tương quan cân hệ vi sinh vật ruột Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, vi sinh vật ruột chia thành nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm lồi vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu Enterococcus E coli, (3) nhóm cịn lại (Residual flora) gồm vi sinh vật có hại Proteus, Staphylococcus Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật coi cân tỷ lệ nhóm dao động khoảng 90; 1,0 0,01% tương ứng Trạng thái mà nhóm hình thành tỷ lệ 90:1:0,01 gọi trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa chung sống có lợi vi khuẩn với với vật chủ) Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp điều kiện sống lý tưởng nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng đào thải chất chuyển hóa Đổi lại, hệ vi sinh vật mang lại lợi ích cho vật chủ thơng qua tăng cường tiêu hóa chất dinh dưỡng, ======================================== =================== giải độc, tổng hợp vitamin nhóm B vitamin K, loại trừ vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch vật chủ Sự cân hệ vi sinh vật đường tiêu hóa bị tác động số nhân tố vô sinh hữu sinh như: sinh lý vật chủ, phần thức ăn cấu nội thân hệ vi sinh vật Thức ăn dinh dưỡng vi sinh vật, thay đổi thành phần phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý làm tổn hại đến trạng thái cân hệ vi sinh vật ruột Tương tự vậy, chất tiết hệ tiêu hóa (dịch mật, enzym, chất đệm chất nhầy ) kiểu tần số nhu động ruột tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật Kiểu tần số nhu động ruột bị tác động lớn stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển ) Khi quan hệ cân hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”) Biểu trạng thái “dysbiosis” vật chủ thường thể tạng kém, sinh trưởng chậm mắc bệnh đường tiêu hóa tiêu chảy, viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis dysbiosis có bảng 1) Để cải thiện quan hệ cân hệ vi sinh vật ruột vật nuôi, phương pháp thường áp dụng bổ sung vào phần thức ăn số loại kháng sinh liều thấp chất kích thích sinh trưởng Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn ni cách khơng có kiểm sốt gây hậu đáng lo ngại vệ sinh an toàn thực phẩm đặc biệt gây nên tình trạng kháng thuốc ngày gia tăng vi khuẩn gây bệnh người vật nuôi Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006 Việc cấm sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi đặt thách thức lớn kỹ thuật, đặc biệt chăn nuôi gia súc, gia cầm non điều kiện vệ sinh vật nuôi chịu nhiều stress Để vượt qua thách thức đó, có nhiều nghiên cứu nhằm tìm tác nhân để thay kháng sinh an toàn với vật ni Một tác nhân tìm probiotic ======================================== =================== Bảng 1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis Dysbiosis đặc điểm đặc trưng chúng Trạng thái Eubiosis Trạng thái Dysbiosis - Sự tồn vật chủ hệ vi - Sự không tồn vật chủ sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh hệ vi sinh vật đường ruột - Sự bảo vệ bề mặt đường tiêu hóa - Sự phá hủy biểu mơ đường ruột, làm chống lại vi sinh vật xâm nhiễm cho thành đường ruột mỏng dẫn đến giảm hấp thụ chất dinh dưỡng - Kích thích hệ miễn dịch vật chủ - Tiêu hóa chất dinh dưỡng - Tổng hợp protein - Tổng hợp vitamin - Sinh chất gây độc (NH 3, chất độc…) - Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH 4, H2S, CO2) - Làm yếu hệ thống miễn dịch - Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều lượng 1.3 Vai trò chế hoạt động probiotic 1.3.1 Vai trò probiotic Từ kháng sinh bị cấm sử dụng chất kích thích sinh trưởng thức ăn chăn nuôi số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu Thụy Điển vào năm 1986) probiotic coi nguồn thay có triển vọng có nhiều đặc tính ưu việt Trên sở kết nghiên cứu nhiều tác giả, Patterson (2003) tổng kết ảnh hưởng có lợi probiotic đời sống động vật thể khía cạnh sau: - Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ - Tăng cường khả miễn dịch - Giảm phản ứng viêm ======================================== =================== - Ngăn cản xâm nhập ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh - Tăng sản xuất axit béo bay - Tăng cường trình sinh tổng hợp vitamin nhóm B - Tăng hấp thu chất khoáng - Làm giảm cholesterol huyết - Làm tăng suất vật nuôi - Giảm hàm lượng amoniac urê chất thải Ngồi probiotic cịn an tồn với động vật thân thiện với mơi trường Vì chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic khơng tạo chất tồn dư sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng 1.3.2 Cơ chế tác động Có nhiều cách giải thích khác chế tác động, phần lớn tài liệu probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006) Minh họa chế hoạt động probiotic thơng qua hình Cạnh tranh loại trừ đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình vi sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy vi sinh vật ruột cạnh tranh vị trí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ nhân lên ruột, khóa chặt vị trí thụ cảm ngăn cản bám dính vi sinh vật khác E coli, Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii) khơng tranh vị trí bám dính vi khuẩn khác mà cịn gắn kết vi khuẩn có roi (phần lớn vi khuẩn có hại) thơng qua quan thụ cảm mannose đẩy chúng khỏi vị trí bám dính niêm mạc ruột (Czerucka Rampal, 2002) Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng phương thức cạnh tranh khốc liệt sinh sơi với số lượng lớn lồi vi sinh vật đe dọa nghiêm trọng loài khác nguồn chất cho phát triển Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, vi sinh vật probiotic sản sinh chất kìm hãm vi khuẩn lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide ======================================== =================== số axit hữu khác Các chất gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu giảm thấp pH ruột (Conway, 1996) Phản ứng miễn dịch kích thích hoạt tính kháng thể vật chủ tăng lên Màng chắn: nơi sinh vật probiotic chiếm giữ thụ cảm bề mặt ruột, độc tố loại trừ Cạnh tranh chất dinh dưỡng: sinh vật probiotic cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh chất dinh dưỡng quan trọng Cạnh tranh loại trừ: sinh vật probiotic khóa chặt vị trí thụ cảm loại trừ vi sinh vật gây bệnh Gây bệnh: vi sinh vật gây bệnh chất độc chúng bám vào niêm mạc thụ cảm ruột phá hủy chúng Các vi sinh vật probiotic cư ngụ nhân lên ruột, ngăn cản bám dính phát triển vi sinh vật gây bệnh Hình Minh hoạ chế tác động probiotic Ruột quan miễn dịch lớn động vật có vú Giữa hệ vi sinh vật ruột hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù Năng lực miễn dịch thể dịch miễn dịch tế bào hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng lớn cân hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999) Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, probiotic điều chỉnh miễn dịch thụ động chủ động hai Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu probiotic phụ thuộc vào chủng giống loài vi khuẩn probiotic (Dugas ctv, 1999) Tuy nhiên, chế tác ======================================== =================== động probiotic việc nâng cao chức miễn dịch chưa hiểu biết đầy đủ 1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 1.4.1 Lựa chọn chủng probiotic Việc lựa chọn chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn phải an toàn cho trình sản xuất ứng dụng, có khả sống sót chiếm lĩnh (colonization) đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn hợp lý hóa thơng qua thí nghiệm in vitro, từ tuyển chọn chủng có tiềm nguồn probiotic [22] Các chủng vi sinh vật probiotic lựa chọn theo tiêu chuẩn chủ yếu sau:  Tính bám dính bề mặt đường tiêu hóa tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính vào thành ruột non, khu trú tốt đường tiêu hố sinh sơi nảy nở Khả bám dính xem yêu cầu quan trọng để tăng khả ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô tăng khả miễn dịch vật chủ Đặc tính làm tăng khả cạnh tranh chủng probiotic với vi sinh vật bất lợi khác  Hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn chủng có khả sản sinh chất kháng khuẩn đặc tính quan trọng phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh E coli, Salmonella Campylobacteria Hoạt tính kháng khuẩn chúng theo nhiều chế khác như: + Sản sinh chất Bacteriocin + Làm giảm độ pH tạo axit lactic + Tạo H2O2 + Làm giảm độc tố theo chế khác + Khả làm giảm bám dính vi khuẩn gây bệnh bề mặt + Cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh ======================================== 10 =================== PHỤ LỤC PHỤ LỤC (ẢNH MINH HỌA HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN KIỂM ĐỊNH, HOẠT TÍNH ENZYM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỢC TUYỂN CHỌN) ======================================== 66 =================== Hình 4: Hoạt tính kháng Shigella flexneri chủng lactic, số (NC2); (Đ12); (C3); (5H4); (Đ7); (6H2); (NC1); (3K2) ĐC (đối chứng) ======================================== 67 =================== Hình 5: Hoạt tính kháng E.coli chủng lactic: ĐC (đối chứng); (C3); (Đ7); (NC2); (NC1); (3K2) Hình Hoạt tính xenlulaza số chủng Hình Hoạt tính amylaza số chủng Bacillus: ĐC- Đối chứng; 1- M73; 2- B75; 3- Bacillus: ĐC- Đối chứng; 1-H3; 2-M12; H3; 4- H4 3-M17; 4-M16 ======================================== 68 =================== Hình 8: Hoạt tính amylaza số chủng Bacillus: ĐC- Đối chứng; (M21); (M75); (M71); (M51); (M17); (M12); (H4); (M73) Hình 9: Hoạt tính kháng Shigella flexneri chủng vi khuẩn Bacillus: (H4); 3(H3); (đối chứng) (M71) ======================================== 69 =================== PHỤ LỤC (KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA CHO rARN 16S VÀ ITS CỦA CÁC CHỦNG NGHIÊN CỨU) Chủng 1K8 GAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATAC CGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCT ATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGG CTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACAT TGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT CTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA AGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAG TAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTAT TGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCT TCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAG AAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGG AAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAG GCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATAC CGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGC AGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAA ======================================== 70 =================== ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAA TCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATG GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGAC TGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC CCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTT GCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGAT TGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGA TCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC ACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGG AACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAG GTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT Trình tự rADN 16S chủng 1K8 tương đồng với trình tự rADN 16S Lactobacillus arizonensis 100 % (1400/1400 bp); Lactobacillus pentosus 100 % (1400/1400 bp); Lactobacillus plantarum 99,9 % (1/1400 bp ); Lactobacillus paraplantarum 99,9 % (1/1400 bp) Chủng 6H2 CTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAA CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTT GGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCAAAACCGCATGGTTTTGATT TGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTG AGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGC AACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTA GAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCT TAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCT GGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGG GTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCAC AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC AGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGG ======================================== 71 =================== GCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT CAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGC TACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCT CTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAA GCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCG AAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGAT GATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGG ATCACCTCCTTT Trình tự rADN 16S chủng 6H2 tương ứng với trình tự rADN 16S Enterococcus lactis 99,6% (1302/1306 bp); Enterococcus faecium 99,8% (1304/1306 bp) Chủng Đ2 GTGGGAAACCTGCCCAGAACGGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTA ATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTC GGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTA ACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCC ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG GAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTG AGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAT TTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAG CCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGC AGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAT GGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT ACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCT GCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGC AAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGC ATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGA GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA TGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGA GTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCG GATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTA ======================================== 72 =================== GGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACA AGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGGATCACCTCCTTT Trình tự rADN 16S chủng Đ2 tương ứng với trình tự rADN 16S Lactobacillus arizonensis 99,8% (1268/1270 bp); Lactobacillus pentosus 99,8 % (1268/1270 bp); Lactobacillus plantarum 99,7% (1267/1270 bp); Lactobacillus paraplantarum 99,7 % (1267/1270 bp) Chủng C3 AcAtttGAGGTGAGTGGCgAACTGGTGAGTAaCGCGTGGGAAACCTGTCCCa gAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTT GGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGAT GGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAA TGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCaaacTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGAC GAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCG TAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTA TTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCG AGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCcTTCGGCTCAACCGAA GAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGA ACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGG CGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGG GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAAT GCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTtAATTcGAAGCTACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGAC GTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATC AGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGA GTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTC GCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGT GAAtACGTTCCCGGGCcTTGTACACaCCGCCCGTCACACCAtGAgAGTTTG T Trình tự rADN 16S chủng C3 tương ứng với trình tự rADN 16S Lactobacillus arizonensis 99,8% (1397/1400 bp); Lactobacillus pentosus 99,8% (1397/1400 bp); Lactobacillus plantarum 99,7% (1396/1400 bp) Chủng NC1 GCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGA AGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTT ======================================== 73 =================== GTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGAT GGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCG ATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGA CACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATG GGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGG CTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCA TACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAA GAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAGCCTTCGGCTTAACCG GAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGG AACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAAATATATGGAAGAACACCAGTG GCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATG GGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAG TGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCGAGGTTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTAC GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGG GCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTA CTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAA ACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCG AGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGC AACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCCCACCATGAG AGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCT AAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGA GAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT Trình tự rADN 16S chủng NC1 tương đồng với trình tự rADN 16S Lactobacillus fermentum 99,7 % (1446/1450) Chủng NC2 ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGGCGAACGAGTTCTCGTTGATG ATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGA GTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACA GATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGA TGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGT GAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTG ATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAG CAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGC GTGAGTGAAGAAGGCTGTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAA TGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG ======================================== 74 =================== TTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCT GATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAA ACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTA ACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGC CCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGAC CGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATG ACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGG CACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT GGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCA TTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCG CTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGG CGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGG GG Trình tự rADN 16S chủng NC2 tương đồng với trình tự rADN 16S Lactobacillus casei 99,7 % ( 1483/1486 ) Chủng Đ7 CGATGATTCTAAGTGTTGGAGGTTCCGCCCTTCATGCTGCAGCTAACGCT TTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC TACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGAT TAGAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTC AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT ATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGA CAAACCGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGA CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACC GCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCT GCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC CGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGA GAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCG TCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAGTCGTTACAAGGTAACAA Trình tự rADN 16S chủng Đ7 tương đồng với trình tự rADN 16S Pediococcus pentosaceus 99,7 % ( 1542/1547) Chủng Đ12 ======================================== 75 =================== TTCCGCCCATTCAGTGCTGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGA GTACGGCCGCTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCC GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAAAGGCTGAAACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAG CTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGA TTATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAA ATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCAT GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACA GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTA AGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCG GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAAC TCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGG CTGCAACAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTC GGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG CGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCGCCTACATGAAGTCGGAATCG CTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCA AAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGA TGATTAGGGTGAAGGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGG GACAGATGATTAGGGTGAAG Trình tự rADN 16S chủng Đ12 tương đồng với trình tự rADN 16S Lactobacillus plantarum 99,9 % ( 1531/1532) Chủng 2M33 CCCTCCAACACATTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCA GACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCG CTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCC GATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAAC CGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTA CGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAAT ACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAG AGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAG ACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTG GGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACG ======================================== 76 =================== TATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGG GACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCG GTCCAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGGTTCCAGGTGTTATCCCCGCTT CTGGGCAGGTTCCCACGTGTTACTCACATCGCCTCCTCAATGTAATCATGA GGAAGCCATCATACAATCGTCGATTGCAGTATAGCCCAGGTGCTAAACGA AAAAAAAGGTGA Trình tự rADN 16S chủng Đ12 tương đồng với trình tự rADN 16S Lactobacillus plantarum 99,7 % ( 1528/1532) 10 Chủng H4 TGGcTCAGgACGAACGCTGGCGGCGtgCCTAATACATGCAaGTCGAGCGGA CAGATGGGAGCTtgcTCCCTGATgTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGgTAACCTGCcTGTAAGACTGGGATAAcTCCGGGAAACCGGGCTAATAC CGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCT ACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG CTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACcTGAGAGGGTGATCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCG TTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG AATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGT GCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA TGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACG CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACTCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTA GTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA GACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGG TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTC TAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGA ACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTC TCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGAATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGT AACCTTTTAgGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAA GTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT Trình tự rADN 16S chủng H4 tương đồng với trình tự rADN 16S Bacillus subtilis 99,8 % (1529/1532) ======================================== 77 =================== 11 Chủng H3 AGTTtgATcCTGGcTCAGgACGAACGCTGGCGgCGTgCTTaATACATGCAAgT CGAGCGgACCGACGGGAGCtTGcTCCcTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGA GTAACACGTGGgTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG GGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGT GGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGG TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGT GATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA CAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGtACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCT GATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGA ACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT AACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCG CCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT GACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGT GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGG GCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATG GGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAA TCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGA ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCC TTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCG GTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAgGTGGGACAGATGATTGG GGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAgGTGCGGCTGGATCACCT CCTTT Trình tự rADN 16S chủng H4 tương đồng với trình tự rADN 16S Bacillus lichenifomics 99,9 % (1540/1541) 12 Chủng SB-I1 GCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTT CTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATT AAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTT TTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACA ATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGA AATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATC ======================================== 78 =================== GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCG TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGG GCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGA GTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTT TTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTAC GGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTA TTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAA AGTTTACCTCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATAC Trình tự gen SB tương đồng 100% với Saccharomyces boulardii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử định nghĩa probiotic .3 1.1.1 Lịch sử probiotic 1.1.2 Định nghĩa probiotic 1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột tác động hệ vi sinh vật đến sức khỏe vật nuôi 1.3 Vai trò chế hoạt động probiotic .7 1.3.1 Vai trò probiotic 1.3.2 Cơ chế tác động 1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 10 1.4.1 Lựa chọn chủng probiotic 10 1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến probiotic .11 1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic 12 1.4.4 Yêu cầu an toàn chủng vi sinh vật probiotic 12 1.4.5 Phân loại vi sinh vật 13 1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt nam 13 1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm probiotic giới 13 1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm probiotic Việt nam 15 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu 18 2.1.1 Nguồn vi sinh vật .18 ======================================== 79 =================== 2.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng .18 2.1.3 Môi trường nghiên cứu .19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Các phương pháp định tính định lượng .20 2.2.2 Phương pháp phân lập 21 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn 22 2.2.4 Phương pháp phân loại .23 2.2.5 Phát triển chế phẩm 33 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật hữu ích .36 3.2 Tuyển chọn vi sinh vật có đặc tính probiotic 37 3.2.1 Vi khuẩn lactic 37 3.2.2 Vi khuẩn Bacillus .39 3.2.3 Nấm men 42 3.3 Phân loại chủng tuyển chọn 43 3.3.1 Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic .43 3.3.2 Nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus 45 3.3.3 Nghiên cứu phân loại vi khuẩn nấm men 47 3.4 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp lên khả sinh trưởng chủng vi sinh vật lựa chọn 48 3.4.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh trưởng vi khuẩn lactic 48 3.4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh trưởng vi khuẩn Bacillus .52 3.4.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh trưởng nấm men 53 3.5 Phát triển chế phẩm 55 3.5.1 Kết tính đối kháng chủng lựa chọn 55 3.5.2 Các kết nghiên cứu tính tương thích chủng lựa chọn với số thành phần có hoạt tính bổ sung thức ăn .55 3.5.3 Kết đánh giá khả bám dính chủng probiotic 57 3.5.4 Ảnh hưởng việc bổ sung chế phẩm probiotic vào phần đến tốc độ sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn lợn 58 Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 69 ======================================== 80 =================== ... 254 chủng vi sinh vật phân lập, có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus 45 chủng nấm men (bảng 4) Bảng 4: Kết phân lập vi sinh vật từ nguồn khác Nhóm vi sinh vật phân lập Vi khuẩn... thuộc vào loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác 1.4.4 Yêu cầu an toàn chủng vi sinh vật probiotic Vi? ??c nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic sử dụng chăn nuôi khâu nghiên cứu sản xuất. .. đầy đủ 1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 1.4.1 Lựa chọn chủng probiotic Vi? ??c lựa chọn chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn phải an tồn cho q trình sản xuất ứng dụng, có khả sống