PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

Trang 1

ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30

Năm 2008

Trang 2

LỜI CẢM TẠ -eaae -

Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ vàđược thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của quýThầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệpđại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại Tôixin trân trọng cảm ơn:

- Thầy PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh Vật,Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ

đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt thờigian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

- Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và PhátTtriểnCông Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợdụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Tâm,

Trung tâcmán bHộọncghliêiện ucứĐu, HBộCmầônnVTi hsinơh @vật, TViàệni

lNiệghuiêhn ọCcứutậvàpPhváàt TnrigểnhCiêônng cứu

Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên Cứu

và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt kiếnthức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu vàPhát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần Thơ

- Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành, nuôidưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều kiệntốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này

- Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ SinhHọc Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quátrình thực hiện đề tài

LÊ HOÀNG THĂNG

Trang 3

MỤC LỤC TÓM LƯỢC Trang 1 ABSTRACT Trang 1 PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 2 PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Giới thiệu về cây lúa

1 Oryza satival L Trang 4

2 Oryza rufipogon Griff Trang 4

3 Đặc điểm sinh trưởng của lúa Trang 4

4 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam Trang 4

II Tầm quan trọng của đạm đối với lúa Trang 5III Sự cố định đạm sinh học Trang 6

IV Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp

1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum Trang 7

2 Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum

Trang 9

V Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .Trang 10

2 Điện di agarose gel .Trang 11

PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

I Địa điểm và thời gian

1 Địa điểm .Trang 12

2 Thời gian .Trang 12

II Vật liệu thí nghiệm .Trang 12III Phương tiện

1.Phương tiện để phân lập vi khuẩn .Trang 122.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện di

Trang 13

IV Hóa chất

1 Hóa chất để phân lập vi khuẩn .Trang 13

Trang 4

2 Hóa chất nhuộm Gram .Trang 14

3 Hóa chất trích DNA Trang 14

4 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR .Trang 15

5 Hóa chất điện di Trang 15

V Phương pháp

1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum Trang 15

2 Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn .Trang 17

3 Nhuộm Gram Trang 17

4 Đo kích thước tế bào vi khuẩn Trang 18

5 Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum Trang 19

6 Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập

bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .Trang 19

PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum

1 Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi

Trung tâm Học liệu tĐrưHờngCnầuôni cTấyhơcác@dònTgàvii

lkiệhuuẩnhAọzcosptậiriplluvmàđãngphhâniêlnập cứu

II Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ

thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .Trang 30

Trang 5

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang Trang 23Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 24Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 25Bảng 2 Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi

khuẩn đã phân lập Trang 26Bảng 2 Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi

khuẩn đã phân lập (tt) Trang 27Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào Trang 28Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) Trang 29Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) Trang 30

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) Trang 12 Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa Trang 17

Trang 6

Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi

trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường Trang 21

Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc

làm thay đổi màu môi trường Trang 22Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy

vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram Trang 28 Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi chuyên

biệt Azospirillum lipoferum .Trang 31

Trang 7

SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30

CBHD: PGS TS Nguyễn Hữu

TÓM LƯỢC

44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa và

lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Các dòng vi khuẩn

Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác giả

khác trước đây Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển độngđược, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc màutrắng trong, xanh Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế dựa

trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài Azospirillum

lipoferum là AR8 và AR41.

Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR, nifH.

ABSTRACT

Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system of

Trung tâwmildHricọec, wliinệteur cĐroHp anCdầhinghTphroơduc@tivitTy àrici

eliiện usomheọpcrotvậinpesvoàf thnegMheikêonng cứu

Delta These strains have some characteristics which are the same to thedescriptions of previous research All of them are negative Gram, motile, shortrods or long rods, short rods in pair, white or blue colony Using PCR technique

with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified

Azospirillum lipoferum.

Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH.

Trang 8

PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng

cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như ViệtNam Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (InternationalRice Research Institute (IRRI), 2007) Trong tình hình dân số thế giới đông (hơn6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quantrọng Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếptục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đápứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới Trong điều kiện eo hẹp đó, người taphải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo Một trong nhữngchiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nôngnghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an toàn

và có giá trị kinh tế cao

Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn nhấtcủa cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước (http:// w ww o nthi.c o m/ly-

Trung tâtmhuyHet/ọdocngl-ibệaung-ĐsoHng-Ccuầ

u-nlonTgh_4ơ71@.htmTl).àĐiểlicệuung hcấọpcđủtậlưpơnvgàthựncgthhìiêtănng cứu

năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể mởrộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp Muốn đạt năng suất cao chúng ta phảikiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, nước,phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng vì

nó quyết định năng suất cây trồng và mùa vụ

Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng.Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đápứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm màcây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa

Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón hóahọc đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển Điềunày đã nảy sinh nhiều mối lo ngại Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất theoqui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả cácnguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được Điều này

Trang 9

sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên Hơn nữa việc sản xuất phân

Trang 10

(Shenoy và ctv, 2001)

Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượngphân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và

dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngàycàng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nênhiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sốngcủa con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001;Huỳnh Thu Hòa, 2006) Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giảipháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại.Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đãđược nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra mộtsản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môitrường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững

Trung tâm HQọuacnlhiệiềuu nĐghHiênCcầứun,

dTòhngơvi@khuTẩnàiAzlioệspuirihlluọmc ctóậpkhảvànănnggchố iêđịnnh cứu

đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Dòng

Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do

trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống rễphát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985)

Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong

nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóahọc đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân

¶ Mục tiêu đề tài:

Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây lúa.

Trang 11

PHẦN II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Giới thiệu về cây lúa

1 Oryza sativa L.

Cỏ nhất niên, cao 0,5 - 1,7m Lá có phiến dài, bìa hơi “cắt”, bẹ dài, cómép cao trắng, tai cong, có lông Chùm tụ tán, dĩnh nhỏ, hoa 1, tiểu nhụy 6, chỉdài Dĩnh quả (hạt gạo lức) dính chặt vào trấu (hạt lúa), 2n = 24 (Phạm Hoàng

Hộ, 2000)

2 Oryza rufipogon Griff (Lúa hoang hay lúa ma).

Nê thực vật đa niên nổi, có thân nằm rồi đứng, dài 1,5 4m, thân to 4

-6 mm, lóng dài 10cm Lá có phiến dài vào 20cm, rộng vào 1cm, mép các lá dướicao hơn 1,5 - 3cm, có rìa lông Chùm tụ tán đứng cao 10 - 15cm, gié hoa, nâunâu, dài 7 - 9,5mm, rộng 1,8 - 1,9mm, có lông gai dài đến 11cm, dĩnh mỏng, cao3mm (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Cây lúa hoang (Oryza rufipogon) mọc hoang ở các nơi đầm lầy, hoặc

dọc theo các kênh mương ở Đồng Tháp Mười, và các vùng nước sâu trung bình ở

Trung tâcmác tHỉnhọCcầnliệThuơ,ĐVHĩnhCLoầnng, TTihềnơ i G@ angTNàă n i

glisệuuất lhúaọrcất tthậấpp, vkhàoảnngg0h,2iêđnến cứu

0,4 tấn/ ha Ngày nay, khi các cánh đồng đã phủ kín lúa cao sản thì cây lúa hoanggần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã đưa

com /vt/ index.php?id=629)

3 Đặc điểm sinh trưởng của lúa.

Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng 90đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo cấy

Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh dưỡng

từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín từtrổ bông đến thu hoạch Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa,chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhấtcho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao

4 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.

Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải quyết

Trang 12

nhu cầu lương thực cho nhân dân Gắn liền với quá trình phát triển của lịch sử,

Trang 13

cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người nôngdân Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng trên80% nhu cầu lương thực của cả nước Người ta thống kê được, sản lượng lúavùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên 19,2triệu tấn (năm 2007) (http://w w w.vietna m net vn/kinhte/2006/ 1 0/622312/ và http:

Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai tròcủa lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để đảmbảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất khẩu

II Tầm quan trọng của đạm đối với lúa.

Trung tâm Học ĐliạệmulàĐmHột cChấầt ncóTvahi ơtrò

@quanTtàrọingliệtrounghđọờci sốtậngpthvựàc vnậtgvhà iđêộnng cứu

vật Đạm là cơ cấu của protein, nhất là của protein nhân, chiếm khoảng 2 - 4%trọng lượng của chất khô, nó còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và purine,

khác (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu đối với sự sống tếbào, là yếu tố giới hạn năng suất cây trồng (Shenoy và ctv, 2001) Bón phân đạmthúc đẩy quá trình tăng trưởng của cây trồng, giúp cây ra nhiều nhánh, phâncành, ra nhiều lá, lá có kích thước to giúp cây quang hợp mạnh Do đó, khi bónphân đạm sẽ giúp gia tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Vũ Hữu Yêm,1995)

Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm thườngsinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi cọc,lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ Thừa đạm lá cómàu xanh đậm, kích thước lá tăng, nhất là về mặt diện tích lá; cây thường có hệ

Trang 14

+

thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời, dễ

bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất giảm

Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng suất,mùa vụ Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv, 2001).Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng lànguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quảcao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng khác

Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có thểhuy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới 150kgđạm Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm cũngnhư thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao năngsuất cây trồng được Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng từ1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) (htt p ://www.Fadina p org/vietnam/fertilizer.html)

III Sự cố định đạm sinh học.

Trung tâm Học KlihệíuquĐyểHn làCnầgunồnTdhựơtrữ@đạmTàNi2

lriệấtulớhn,ọtrcontgậkphovảàng nkhgôhngiêknhí cứu

trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành

được gọi là sự cố định đạm sinh học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Sự cố định đạm sinh học có thể đạt được 175 triệu tấn mỗi năm (http://w w w microbiologyprocedure.com/nitrogen-fixation/biological-nitrogen-fixation.htm)

Trong tự nhiên sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng lớn(khoảng 30 kg đạm/ha/vụ) cho cây trồng hấp thu khi mà phân đạm hóa học chỉđược cây trồng sử dụng 30 - 40% (Boddy and Dobereiner, 1984)

Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của enzymenitrogenase được xúc tác bởi năng lượng Để thực hiện phản ứng này cần cungcấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử nitơ.Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là protein

Trang 15

Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:

Nitrogenase

Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩahết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền côngnghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điểnhình Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có thểlàm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ trongnông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng khi

Trang 16

Trung

tâcmom.Hvnọ)c.

liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

IV Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp.

1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum

Năm 1974 lần đầu tiên người ta phân lập được một loài xoắn khuẩn

sống trên rễ một số cây cỏ nhiệt đới và đặt tên là Spirillum lipoferum (Döbereiner

và cộng tác viên (ctv), 1987) Về sau căn cứ vào tỷ lệ các base trong ADN người

ta xác định chúng thuộc về một giống mới, được đặt tên là Azospirillum (Döbereiner và ctv, 1995) Azospirillum có số lượng khá lớn ở vùng rễ và trong

2007)

Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn

Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp

với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa nước,mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995) Saleeana và ctv (2002) đã tìm ra những

loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum trong rễ lúa trồng ở Tamil Nadu, Ấn Độ.

Trang 17

Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn

Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu.

Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,

vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinhvới rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và ctv,1995)

Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được phát

hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv, 1978);

Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum halopraeferrans

(Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai loài còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được Dekhil

và ctv tìm ra năm 1997 Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram

âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt ở

được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar

Trung tâfmlageHlluọmc) tlếiệbàuo Đ(ĐHào TChầannh HTohànơg, @2005T).ài liệu học tập và nghiên cứu

Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2 điều

kiện hiếu khí và kỵ khí Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ởđiều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi trường(Döbereiner và Pedrosa, 1987) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi

-khoai tây có màu hồng nhạt hay đậm

Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như

IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisicacid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990) Sự sản xuất hormone thực vật

của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó

giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp cây

chống chịu khô hạn Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng 30%

lượng phân bón trong nông nghiệp (http:/ / w w w.hinduonn r t.co m /thehind u /se ta /2002/04/04/stories/2002040400120400.htm)

Trang 18

2 Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum.

Thí ngiệm về tác động của các dòng Azospirillum lên năng suất cây

trồng đã được tiến hành ở nhiều loài cây và các nơi trên thế giới

Năng suất mùa vụ đã tăng từ 3 - 54% khi được chủng Azospirillum là

kết quả của 18 thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại Ý (Favilli và ctv, 1987)

Ngoài ra Azospirillum còn làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23 - 26%

(Paceres và ctv, 1988), ở Argentina 13 - 30 % (Rodriguez - Caceres, 1982)

Thí nghiệm ngoài đồng trên lúa Miến cho thấy khi có chủng giống

Azospirillum brasilense vào hạt lúa Miến (107CFU/hạt) làm gia tăng năng suất từ

10 - 15% (Okon và ctv, 1994)

Ủ hạt với vi khuẩn cho kết quả tốt hơn khi ủ với phân bón hóa học Ủ

Trung tâhmột lHúaọmcạlcihệuvớiĐAHzosCpiầrilnlumThliêơn @tục

chúng cố định được 26kg đạm/ha so với không ủ và lượng NPK chứa trong câytăng 80 - 90% (Fages và ctv, 1994)

Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống

với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là

vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khuvực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994) Điều này được giải

thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố

định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, giatăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩmthấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan vàHolguin, 1997; Boddey và ctv, 1986)

v Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt Nam

Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh (nhóm

Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter ) cho thấy lúa có thể tăng năng

Trang 19

suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg đạm/ha

Trang 20

Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi

sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy

mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài

phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ, 2004).

Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi khuẩn

cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0

-428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân với

tế bào/ml

Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập

được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây lúa Riêng Đào

Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ lúatrồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31 là

Trung tâAmzosHpirọilclumliệliupofĐerHumCcóầnnguTồnhơgốc@từ Tthâàni,

lriễệluúahtrọồncg t(ậlúpa cvaào snảng)hviàêlnúa cứu

hoang Tác giả cho rằng nồng độ acid malic, nguồn carbon chính cho

Azospirillum trong môi trường NFb, thích hợp nhất là 4g/lít.

Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum phân

bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây trồng,thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm thiểu

ô nhiễm môi trường

V Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử.

1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis vàcộng tác viên phát minh năm 1985 Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của ADNpolymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADNpolymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sungvào mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của

Trang 21

ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh

Trang 22

P

h ả n ứ n g PCR g ồm nhi ề u chu k ỳ , m ỗi chu k ỳ có 3 b ư ớ c :

- Bước 1: Biến tính (denaturation) Phân tử ADN được tách thành 2

mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn này kéo dài 1 phút

giúp cho ADN polymerase tổng hợp ADN, giai đoạn này kéo dài 1 phút

Các ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp chocác chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ,tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n (với n là số chu kỳ nhiệt) Sản phẩmPCR sau đó sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê,2006)

2 Điện di agarose gel.

Điện di là một quá trình mà các phân tử mang điện tích được tách ratrong một điện trường do khả năng di chuyển khác nhau của các phân tử Đây là

Trung tâpmhươHngọpchálpiệthuônĐg HdụnCg dầùnngTđhể

tơách@rờiTcáàciđloiệạnuachidọncuctlậeipc cvó àkícnhgthhưiớêcntừ cứu

200bp đến 50kb (Võ Công Thành, 2004; Trần Thị Xuân Mai, 2005)

Trong điện di, người ta thường sử dụng thang ADN chuẩn (ADNladder) Đó là hỗn hợp nhiều đoạn ADN có kích thước đã biết khi cho điện dicùng lúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn ADN của mẫu

Kỹ thuật điện di trên gel sẽ tách các phân tử ADN tùy theo kích thướccủa chúng (http://ww w .se m vn.net/sem/ m o d u les ph p ?na m e= F o r u m s & f ile=viewtopic&p=7)

Vận tốc và sự phân ly ADN phụ thuộc vào một số yếu tố sau: kíchthước phân tử ADN, nồng độ gel agarose, kiến trúc ADN, cường độ điện trường,chiều của điện trường, … (Trần Thị Xuân Mai, 2005)

Trang 23

PHẦN III - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

I Địa điểm và thời gian.

1 Địa điểm.

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Phòng thínghiệm Sinh Học Phân Tử - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ SinhHọc, Trường Đại Học Cần Thơ

2 Thời gian.

Từ tháng 02/2008 đến 06/2008

II Vật liệu thí nghiệm.

- Lúa hoang (hình 1): mẫu được thu tại 2 địa điểm: Khoa NôngNghiệp Trường Đại Học Cần Thơ, đường Huỳnh Thúc Kháng - Thành Phố CầnThơ

III Phương tiện.

1 Phương tiện để phân lập vi khuẩn.

- Cối chày, chai khử trùng mẫu, eppendorf 1,5 ml

- Bình tam giác, đĩa Petri đường kính 10 cm

- Máy khuấy (vortex), máy sấy, cốc

- Kính hiển vi Olympus, tủ ủ Incucell

Trang 24

- Lò vi sóng Panasonic, đũa thủy tinh.

2 Phương tiện trích ADN, thực hiện phản ứng PCR, điện di.

- Micropipet Bio - Rad,

- Eppendorf 1,5 ml và 2,0 ml

- Bộ chạy điện di Embi - Tec

- Máy PCR Bio - Rad

- Máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000

- Môi trường NFb (môi trường bán đặc và đặc)

Công thức môi trường NFb đặc (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997)

Trang 25

- B ro m ot hy m ol b lue 0,5% tr o ng KOH 0 ,2M 2ml

Trang 26

Dung dịch vi lượng:

Na2MoO4.2H2O 1MnSO4.H2O 1,5

H2BO3 1,4CuSO4 0,4ZnSO4.H2O 0,12Thêm nước cất cho đủ 1000mlDung dịch vitamine

Biotin 10mgPyridoxyl - HCl 20mgThêm nước cất cho đủ 100ml

- Trường hợp trữ ống thêm vào công thức môi trường trên

Trung tâm Học liệu ĐHKNCOầ3 n Thơ @ Tài liệ50umlh/lọc tập và

nghiên cứu

2 Hóa chất nhuộm Gram.

- Crystal violet, iod

- Tăm tre đầu nhọn

- Môi trường LB (Lauria Betan)

Công thức môi trường LB (Lauria Betan) (g/l)

Dịch trích nấm men 5g

Trang 27

- Mồi dùng nhận diện Azospirillum lipoferum:

+ Mồi xuôi: 5’- GTA AAT CCA CCA CCT CCC - 3’

+ Mồi ngược: 5’- TGT AGA TTT CCT GGG CCT - 3’

(Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được

Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ

thiết kế dựa theo trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên

website htpp://www n c bi.nlm.nih.gov/ G en b a n k/index.ht m l )

- Ethidium bromide (EtBr)

- Thang chuẩn /pstI

- Loading buffer Fer

- Nước cất 2 lần đã khử trùng

V Phương pháp.

1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum.

a) Thu mẫu.

- Các mẫu lúa được thu lấy từ bờ ruộng hay ven kênh và rạch

- Dùng xẻng đào đất xung quanh bụi lúa để có thể thu được toàn bộcây lúa Sau đó cho vào bao nylon và được mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật

để tiến hành xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn Azospirillum.

Trang 28

b) Xử lý mẫu và phân lập.

- Rửa sạch đất bám quanh thân và rễ lúa

- Tách rời thân và rễ lúa

- Thân (lúa hoang): lột bỏ lớp bao bên ngoài thân lúa, cắt thành từngđoạn 5cm và để ráo nước

- Rễ lúa: rửa thật sạch đất quanh rễ, rửa lại 2 lần với nước cất, sau đócắt thành từng đoạn 2 - 3cm

- Tiến hành khử trùng bề mặt mẫu thân và rễ lúa với Tween 20 (1:20)

nước cất 1 lần 5 - 6 lần đến khi sạch bọt thì ta tiến hành giã mẫu

- Mẫu được giã nhuyễn trong cối, sau đó cho 1ml nước cất vô trùngvào mẫu và trộn đều

- Hút 200µl phần trong cho vào 800µl nước cất đựng sẵn trongeppendorf (đã pha loãng 5 lần), đem Vortex Tiến hành pha loãng 10 lần, 100lần,…nếu cần thiết

Trung tâm Học- lHiệúut 1Đ0µHl dCịchầmnẫuTđhãơph@a

loTãnàgiclhioệuvàohọmcôi ttrậưpờngvàNFnbgbhániêđnặc cứu

- Sau 2 - 3 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu trắng (vòng pellicle), cách

bề mặt môi trường 2 - 5mm, làm cho môi trường xanh lá dần chuyển sang màu

xanh dương Đó là dấu hiệu của sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum.

- Hơ nóng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, chấm đầu kim cấy vào ốnglấy vi khuẩn từ vòng pellicle cấy lên đĩa petri có môi trường NFb đặc theo đường

- Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trênđường cấy tiến hành cấy chuyển Tiếp tục phân lập nhiều lần trên môi trườngNFb đặc

- Sau vài lần cấy chuyển, chọn lọc những khuẩn lạc rời trên môi trườngđĩa, trữ lại trên môi trường ống NFb như là một dòng, sau đó kiểm tra các dòng

vi khuẩn này dưới kính hiển vi để xem ròng hay không Nếu chưa ròng ta phảicấy chuyển lại đĩa và tiếp tục phân lập cho đến khi ròng

Trang 29

Trang 30

Vòng pellicle

Sau 2-3 ngày Vòng pellicle

Vòng pellicle

Sau 2-3 ngày

Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa.

2 Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn.

Trung tâm HTiọếnchlàiệnhuquĐanHsáCt

cầhnuyểTnhđơộng@củaTAàzioslipệiruilluhmọbcằntgậpphưvơàngnpghhápiêginọt

cứu

ép dưới kính hiển vi ở vật kính X40 (độ phóng đại 400 lần) như sau:

- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên kính mang vật

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và đểnguội

- Dùng đầu kim cấy lấy một ít vi sinh vật rồi chấm vào giọt nước cấttrên kính mang vật (trong điều kiện vô trùng)

- Lấy kính đậy vật đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của

từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật

- Quan sát dưới kính hiển vi để thấy chuyển động

3 Nhuộm Gram

Phương pháp nhuộm được tiến hành theo các bước sau

a) Chuẩn bị mẫu vật

- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa kính mang vật

Trang 31

- Áp dụng thủ thuật vô trùng lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước,trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc.

- Lướt mặt dưới của kính mang vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng10cm từ độ 3 lần để giết chết vi sinh vật và dán chúng lên kính mang vật

b) Nhuộm Gram

- Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet phủ nơi cố định mẫu, để 2 phút

- Rửa từ 2 - 3 giây (tránh làm trôi mẫu), chậm nhẹ cho khô bớt nước

- Nhỏ dung dịch Iot trong 60 giây

- Rửa nước, chậm nhẹ

- Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, rửa đến khi giọt cồn + aceton không còn màu tím nữa

- Rửa nước vài giây, chậm nhẹ

- Nhỏ Fushin hay Safranin từ 1 - 2 giọt để trong 60 giây

- Rửa nước vài giây

- Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ cho khô bớt nước trên ngọn lửa

Trung tâđmèn cHồnọ c liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên

cứu

- Quan sát dưới kính hiển vi

4 Đo kích thước tế bào vi khuẩn.

Quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum

dưới kính hiển vi ở vật kính X40

a) Mô tả thước đo

- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính hình tròn có khắc 100 vạch giữa 2 thấu kính của thị kính

- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài2mm chia thành 200 khoảng Khoảng giữa mỗi khoảng là 10µm

b) Phương pháp đo

- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy ảnh rõ của thước

- Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho

2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	2,11 MB