PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

d BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO T Ạ O TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH Ơ KHOA KHOA H Ọ C o&o LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30 Năm 2008 LỜI CẢM TẠ ------------- eaae ------------- Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ và được thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của quý Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Thầy PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Th ơ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt th ờ i gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghi ệ p. - Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và PhátTtri ể n Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ tr ợ dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghi ệ p. - Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Tâm, Trung tâ c m án b H ộ ọ n c gh l iê iệ n u cứ Đ u, H Bộ C m ầ ôn n V T i h sin ơ h @ vật, T Vi à ện i l N iệ gh u iê h n ọ C c ứu tậ và p Ph v á à t T n ri g ển h C iê ô n ng cứu Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên C ứ u và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt ki ế n thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần Thơ. - Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều ki ệ n tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này. - Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài. LÊ HOÀNG THĂNG MỤC LỤC TÓM LƯỢC . Trang 1 ABSTRACT . Trang 1 PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ . Trang 2 PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu về cây lúa 1. Oryza satival L. Trang 4 2. Oryza rufipogon Griff . Trang 4 3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa. Trang 4 4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. Trang 4 II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa . Trang 5 III. Sự cố định đạm sinh học . Trang 6 IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghi ệ p 1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum . Trang 7 2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum . . Trang 9 V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử. 1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). .Trang 10 2. Điện di agarose gel. .Trang 11 PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Địa điểm và thời gian. 1. Địa điểm. .Trang 12 2. Thời gian. Trang 12 II. Vật liệu thí nghiệm. .Trang 12 III. Phương ti ệ n 1.Phương tiện để phân lập vi khuẩn. Trang 12 2.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện di Trang 13 IV. Hóa ch ấ t. 1. Hóa chất để phân lập vi khuẩn. Trang 13 2. Hóa chất nhuộm Gram. Trang 14 3. Hóa chất trích DNA .Trang 14 4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR. Trang 15 5. Hóa chất điện di .Trang 15 V. Phương pháp. 1. Phân lập vi khuẩn Azospirillum Trang 15 2. Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn. .Trang 17 3. Nhuộm Gram .Trang 17 4. Đo kích thước tế bào vi khuẩn .Trang 18 5. Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum .Trang 19 6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân l ậ p bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). .Trang 19 PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum 1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi Trung tâm Học liệu t Đ rư H ờng C n ầ uô n i c T ấy hơ các @ dòn T g à v i i l k iệ hu u ẩn h A ọ z c osp tậ iri p llu v m à đã ng ph h ân iê l n ập cứu đ ượ c. . Trang 21 2. Màu sắc khuẩn lạc, màu môi trường, hình dạng và kích th ướ c của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. .Trang 25 3. Một số đặc điểm của các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập. Trang 28 II. Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Trang 30 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận Trang 32 II. Đề nghị Trang 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 33 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang Trang 23 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 24 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 25 Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Trang 26 Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập (tt) Trang 27 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào Trang 28 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) .Trang 29 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) .Trang 30 DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) Trang 12 Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa Trang 17 Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường Trang 21 Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc làm thay đổi màu môi trường .Trang 22 Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram Trang 28 Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi chuyên biệt Azospirillum lipoferum. Trang 31 SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30 CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 1 TÓM L ƯỢ C 44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa và lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các dòng vi khuẩn Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác giả khác trước đây. Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển động được, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc màu trắng trong, xanh .Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế d ự a trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum là AR8 và AR41. Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR, nifH. ABSTRACT Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system of Trung tâ w m ild H ric ọ e c , w l i i n ệ te u r c Đ ro H p an C d ầ hi n gh T p h ro ơ duc @ tivit T y à ric i e li i ệ n u som h e ọ p c ro t v ậ in p es v o à f th n e g M h e i k ê o n ng cứu Delta. These strains have some characteristics which are the same to the descriptions of previous research. All of them are negative Gram, motile, short rods or long rods, short rods in pair, white or blue colony . Using PCR technique with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified Azospirillum lipoferum. Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH. CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 2 SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30 PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Vi ệ t Nam. Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (International Rice Research Institute (IRRI), 2007). Trong tình hình dân số thế giới đông (h ơ n 6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quan trọng. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp ứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới. Trong điều kiện eo hẹp đó, người ta phải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo. Một trong những chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an toàn và có giá trị kinh tế cao. Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn nhất của cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước (http:// w ww. o nthi.c o m/ly- Trung tâ t m huy H et/ ọ do c ng l - i b ệ a u ng- Đ so H ng- C cu ầ u- n lon T g h _4 ơ 71 @ .htm T l). à Đ i ể li c ệ u u ng h cấ ọ p c đủ tậ lư p ơn v g à thự n c g t h hì iê tă n ng cứu năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể m ở rộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp. Muốn đạt năng suất cao chúng ta ph ả i kiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, n ướ c, phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng vì nó quyết định năng suất cây trồng và mùa vụ. Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng. Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa. Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón hóa học đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển. Đ iều này đã nảy sinh nhiều mối lo ngại. Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất theo qui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả các nguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được. Điều này CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 3 SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30 sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên. Hơn nữa việc sản xuất phân CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 3 SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30 bón sẽ sinh ra khí CO 2 là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính (Shenoy và ctv, 2001). Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% l ượ ng phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở dạng NH 3 , NO x , N 2 (Nguyễn Huy Phiêu, 2000). Bên cạnh đó, sự l ạ m dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ng ạ i. Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững. Trung tâm H Q ọ ua c n l h iệ iề u u n Đ gh H iên C c ầ ứu n , d T ò h ng ơ vi @ khu T ẩn ài Az li o ệ sp u iri h llu ọ m c c t ó ập khả và năn n g g c h ố iê đị n nh cứu đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Dòng Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống r ễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985). Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóa học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân. ¶ Mục tiêu đề tài: Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây lúa. [...]... trựng vi thc trc vi th kớnh - m s khong cỏch ca thc trc vi th kớnh trựng vi thc trc vi vt kớnh Ta cú tr s mt khong cỏch ca thc trc vi th kớnh (x) theo cụng N *10àm n thc: x = Trong ú: + N l s khong ca thc trc vi vt kớnh, N = 6 + n l s khong ca thc trc vi th kớnh, n = 35 Nh vy : x= 6 *10àm 35 - Thay thc trc vi vt kớnh bng vi mu, iu chnh cho thy rừ nh ca vi mu Di chuyn vi mu th no cho mt u ca mu o trựng vi. .. chỳng c nh c 26kg m/ha so vi khụng v lng NPK cha trong cõy tng 80 - 90% (Fages v ctv, 1994) Theo d liu ca th gii thp k qua, khi th nghim ht ging vi Azospirillum hoc kt hp vi vi khun c nh m khỏc dn n kt qu l vi khun cú kh nng gia tng sn lng nụng nghip trờn nhng loi t v khu vc khỏc nhau (Sumner v ctv, 1990; Fages v ctv, 1994) iu ny c gii thớch nh sau: khi ht ging vi vi khun vi Azospirillum khụng ch giỳp... Hip Trang 10 Ti Vin Khoa Hc K Thut Nụng Nghip Vit Nam, b mụn Vi sinh vt hc, thớ nghim v x lý mm m vi ch phm Azospirillum cho thy m cng chc v ln hn, chng chu rột tt hn nu m gp rột m kộo di 0 (di 10 C) Lỳa chớn sm hn t 3 - 5 ngy so vi cõy lỳa khụng x lý vi ch phm Azospirillum (Nguyn Bo V, 2004) Theo Phm Th Ngc Lan v Lý Kim Bng (2004), s lng vi khun c nh m trong mu t phõn lp (trong ú cú Azospirillum) t... Azospirillum c nh m cng sinh vi cõy khụng thuc h u Vi khun Azospirillum l vi khun c nh m hin din trong r, vựng t quanh r, thõn v lỏ ca cõy Chỳng sng t do trong t hay cng sinh vi r ca cỏc loi ng cc, cỏc loi cõy c v cõy cú c (Dửbereiner v ctv, 1995) Azospirillum lipoferum l mt trong by loi vi khun ó c phỏt hin: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand v ctv, 1978); Azospirillum amazonese (Magalhaes... ca thc trc vi th kớnh, t ú tỡm 1 vch th 2 trựng vi u kia ca mu o m s khong trc vi nm trong 2 vch ny Suy ra kớch thc vi mu bng cỏch ly s khong trựng nhõn vi tr s 1 khong cỏch ca thc trc vi th kớnh Trung tõm H5.TcrớlcihnuhanhHACDNnt Tvihkhu@n ATzospi irliilluumh c tp v nghiờn cu - Cy vi khun Azospirillum trờn mụi trng LB c - Sau 1 ngy cy, dựng u nhn ca tm tre ly khun lc ri, nh, non hũa tan vi 25àl nc... hin nhiu nhúm vi khun Azospirillum Vi khun Azospirillum cú kh nng c nh m t do hoc kt hp vi vựng r ca cõy h hũa bn, c bit vựng r ca cõy c nhit i , lỳa nc, mớa, ngụ, lỳa mỡ (Boddy v ctv, 1995) Saleeana v ctv (2002) ó tỡm ra nhng loi vi khun thuc ging Azospirillum trong r lỳa trng Tamil Nadu, n CBHD: PGS TS Nguyn Hu Hip Trang 7 Ngoi ra, Nguyn Hu Hip v ctv (2005) cng tỡm ra dũng vi khun Azospirillum c... trc vi vt kớnh c t trờn mt ming kớnh c bit di 2mm chia thnh 200 khong Khong gia mi khong l 10àm b) Phng phỏp o - t thc trc vi vt kớnh vo bn kớnh, iu chnh cho thy nh rừ ca thc - Xờ dch thc trc vi vt kớnh v xoay thc trc vi th kớnh sao cho 2 thc song song v gn sỏt nhau, tip tc xờ dch thc trc vi vt kớnh th no cho 1 vch ca thc trc vi vt kớnh trựng vi 1 vch ca thc trc vi th kớnh v 1 vch th 2 no ca thc trc vi. .. cũn mu tớm na - Ra nc vi giõy, chm nh - Nh Fushin hay Safranin t 1 - 2 git trong 60 giõy - Ra nc vi giõy - Dựng giy thm chm nh hay h cho khụ bt nc trờn ngn la Trung tõmốn cHn c liu H Cn Th @ Ti liu hc tp v nghiờn cu - Quan sỏt di kớnh hin vi 4 o kớch thc t bo vi khun Quan sỏt hỡnh dng v o kớch thc t bo vi khun Azospirillum di kớnh hin vi vt kớnh X40 a) Mụ t thc o - Thc trc vi th kớnh l mt ming kớnh... Tỡnh hỡnh sn xut lỳa go Vit Nam i vi Vit Nam cõy lỳa cú vai trũ quan trng trong vic gii quyt CBHD: PGS TS Nguyn Hu Hip Trang 4 SVTH: Lờ Hong Thng Lp: Cụng Ngh Sinh Hc K.30 nhu cu lng thc cho nhõn dõn Gn lin vi quỏ trỡnh phỏt trin ca lch s, CBHD: PGS TS Nguyn Hu Hip Trang 5 SVTH: Lờ Hong Thng Lp: Cụng Ngh Sinh Hc K.30 cõy lỳa c coi l ngi bn gn gi nht i vi ng rung v ngi nụng dõn Vi tp quỏn canh tỏc v tiờu... c trng cho s phỏt trin ca vi khun Nhng c im ny phự hp vi mụ t trong nhng nghiờn cu trc õy ca Rodriguez v ctv (1982), Hip v ctv (2005), Nguyn Khc Minh Loan (2005), o Thanh Hong (2005) Vũng pellicle Hỡnh 3: S phỏt trin ca vi khun Azospirillum to dũng pellicle cỏch mt mụi trng NFb bỏn c 2-5mm v lm thay i mu mụi trng S phỏt trin ca vi khun Azospirillum trong mụi trng NFb bỏn c vi cht ch th mu l bromothymol