NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN ECHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ NGAN BỆNH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y NGUYỄN THỊ LIÊN HƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN ECHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ NGAN BỆNH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số : 62 62 50 10 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ NƠNG NGHIỆP CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI VIỆN THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CÙ HỮU PHÚ TS ĐỖ NGỌC THÚY Phản biện 1: GS TS Nguyễn Như Thanh Phản biện 2: PGS TS Hoàng Đạo Phấn Phản biện 3: PGS TS Phạm Ngọc Thạch Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp tại: Viện Thú y Quốc gia Có thể tìm luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Thú y Quốc gia - Thư viện Trung tâm Nghiên cứu gia cầm Thụy Phương DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC Đà CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Thị Liên Hương Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh E coli Salmonella gây cho ngan Pháp Tuyển tập cơng trình nghiên cứu Khoa học- Công nghệ chăn nuôi ngan, ngỗng NXB Nông nghiệp, 2004 Trang 197 – 203 Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Liên Hương, Lê Thị Minh Hằng, Trần Việt Dũng Kiên Một số đặc tính chủng vi khuẩn E coli phân lập từ ngan mắc Colibacillosis Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XVI, số 2009 Trang 32-38 Nguyễn Thị Liên Hương, Cù Hữu Phú, Đỗ Ngọc Thúy, Lê Minh Hằng, Trần Việt Dũng Kiên Tỷ lệ phân lập khả mẫn cảm kháng sinh chủng E coli phân lập từ ngan mắc bệnh trực khuẩn coli Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XVI, số 2009 Trang 20-24 Nguyễn Thị Liên Hương, Đỗ Ngọc Thúy, Lê Thị Minh Hằng Kết gây nhiễm thử nghiệm số chủng vi khuẩn E coli gây bệnh cho ngan phơi trứng Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XVI, số 2010 Trang 58- 63 Nguyễn Thị Liên Hương, Cù Hữu Phú, Đỗ Ngọc Thúy, Lê Thị Minh Hằng Tình hình nhiễm số đặc điểm Colibacillosis ngan ni Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XVI, số 2010 Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Liên Hương, Lê Thị Minh Hằng, Trần Việt Dũng Kiên Xác định số gen liên quan đến vi khuẩn E coli gây bệnh cho ngan phương pháp PCR Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XVI, số 2010 D N Thuy, N T L Huong, C H Phu, L T M Hang, T V D Kien 2010 Characterization of pathogenic E coli associated with Colibacillosis in muscovy ducks in VietNam Proceedings of the 14th Animal Science Congress of the Asian – Australasian association of animal production societies August 23- 27, 2010 Pingtung , Taiwan , ROC p 467 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APEC BG BHI bp CR cs DNA dNTP E coli ELISA EMB ETEC LT MRHA MSHA NCCLS NXB μl OMPs PBS PCR RBC rpm SĐK SIM SL ST TSB VK TAE TE w/v : Avian Pathogenic Escherichia coli : Brilliant Green : Brain Heart Infusion : Base pair : Congo Red : Cộng : Deoxyribonucleic Acid : Deoxyribonucleotide triphosphate : Escherichia coli : Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay : Eosin Methylen Blue : Enterotoxigenic E.coli : Labile Heat Toxin : Mannose Resistance Haemagglutination : Mannose Sensitive Haemagglutination : National Committee of Clinical Laboratory Standards : Nhà xuất : Microlitre : Outer Membrane Proteins : Phophate Buffered Saline : Polymerase Chain Reaction : Red blood cell : Revolutions per minute : Sức đề kháng : Sulfide – Indole - Motility : Số lượng : Stable Heat Toxin : Tryptose Soy Broth : Vi khuẩn : Tris - Acetate - EDTA : Tris - EDTA : Weight/volume MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong chăn nuôi ngan, bệnh vi khuẩn gây nên thường xuyên xảy ra, Pasteurellosis, Salmonellosis, Colibacillosis, Mycoplasmosis…., đó, Colibacillosis vi khuẩn E coli gây (hay gọi bệnh trực khuẩn E coli) phổ biến nhất, gặp nơi, lứa tuổi ngan, đặc biệt nơi có điều kiện chăn nuôi không hợp lý, công tác vệ sinh thú y kém, nuôi với mật độ đông, chuồng trại ẩm thấp có nhiều yếu tố bất lợi ảnh hưởng đến sức khỏe đàn ngan, bệnh phát sinh gây thiệt hại đáng kể kinh tế Trên giới Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh cho vật nuôi Tuy nhiên, vi khuẩn E coli gây bệnh cho gia cầm có đặc tính khơng hồn tồn giống với chủng gây bệnh cho người động vật có vú (Delicato cs, 2003) Ở Việt Nam, cơng trình nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh cho gia cầm hạn chế, đặc biệt vi khuẩn E coli gây bệnh ngan, chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố Để có thêm hiểu biết nguyên gây bệnh nhằm phục vụ công tác phịng trị bệnh có hiệu quả, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ ngan bệnh biện pháp phòng, trị” Mục tiêu đề tài Xác định số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh ngan biện pháp phòng trị bệnh Ý nghĩa đề tài ™ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Đây nghiên cứu đầy đủ số đặc điểm Colibacillosis ngan, đặc tính sinh học, vai trị vi khuẩn E coli gây bệnh ngan biện pháp phòng trị bệnh - Là nghiên cứu Việt Nam xác định số khác biệt kháng nguyên, yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ ngan bệnh ngan khỏe - Kết nghiên cứu thông tin sử dụng luận án tài liệu tham khảo cho giảng dạy nghiên cứu Colibacillosis ngan; đặc tính sinh học, vai trị vi khuẩn E coli gây bệnh ngan biện pháp phòng trị bệnh ™ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Kết nghiên cứu sở khoa học giúp chẩn đốn xác Colibacillosis ngan - Dựa vào kết nghiên cứu, giúp đề xuất giải pháp có hiệu cao phịng trị Colibacillosis ngan ™ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Lần xác định khác biệt serotyp số yếu tố gây bệnh (bằng PCR) chủng vi khuẩn E coli phân lập từ ngan bệnh ngan khỏe - Là nghiên cứu khả gây bệnh phôi ngan, vịt gà chủng vi khuẩn E coli phân lập từ ngan Bố cục luận án Luận án gồm 138 trang, đó: Mở đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (36 trang), nội dung, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (17 trang), kết nghiên cứu thảo luận (61 trang), kết luận đề nghị (2 trang), danh mục công trình cơng bố tác giả (1 trang) Luận án có 32 bảng, sơ đồ biểu đồ, 40 hình ảnh, 146 tài liệu tham khảo (18 trang), gồm 29 tài liệu tiếng Việt, 116 tài liệu tiếng Anh tài liệu tiếng Đức PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số nghiên cứu giới Colibacillosis gia cầm Bệnh truyền nhiễm gia cầm gây vi khuẩn E coli lần David báo cáo năm 1938 Twisselman năm 1939 (Gross, 1994) bệnh thường gặp gây thiệt hại kinh tế đáng kể (Kikuyasu Nakamura, 2000; Ewers cs, 2003) Bệnh làm tăng tỷ lệ chết, giảm suất tăng tỷ lệ loại thải (Barnes cs, 2003) Bệnh nguyên phát kế phát sau bệnh nhiễm trùng khác hay vấn đề quản lý không tốt (Alastair Johnston, 2007) Ở gia cầm chủ yếu chủng E coli thuộc nhóm gây bệnh cho gia cầm gây (APEC) (Gross, 1994; Dho-Moulin Fairbrother, 1999; Vandekerchove cs, 2005; Jordan cs, 2005) 1.2 Colibacillosis gia cầm Mặc dù vi khuẩn E coli phát triển rộng rãi đường tiêu hóa mơi trường sống gia cầm khỏe, chủng mang yếu tố độc lực có khả gây bệnh (Delicato cs, 2003) Bệnh xảy với tất lồi gia cầm, thường thấy gà, vịt, ngan, gà tây; gây tỷ lệ chết cao gia cầm Mầm bệnh dù có sẵn thể hay từ ngồi vào, xâm nhập vào hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, theo máu đến khí quan gây tổn thương viêm túi khí (sacculitis), viêm bao tim (pericarditis), viêm màng gan (perihepatitis), viêm phúc mạc (peritonitis), viêm vòi trứng (salpingitis), viêm ruột (enteritis) (Dho-Moulin Fairbrother, 1999), gây nhiều thể bệnh Chẩn đoán bệnh dựa vào triệu chứng, bệnh tích vi trùng học 1.3 Một số đăc tính vi khuẩn E coli nói chung chủng gây bệnh gia cầm nói riêng E coli trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước - x 0,6 μm, bắt màu gram âm Trực khuẩn hiếu khí hiếu khí tuỳ tiện, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển 37oC, pH thích hợp 7,4 Vi khuẩn E coli có khả lên men sinh đường glucose, fructose, galactose, lactose, manitol, levulose, xylose; làm đơng vón sữa, khơng làm tan chảy gelatin, phản ứng Indol, catalase, MR dương tính; oxidase, VP, urease, H2S âm tính; có khả khử nitrat thành nitrit Ở mơi trường bên ngồi, chủng E coli gây bệnh tồn đến tháng (Gross, 1994) Vi khuẩn E coli có khoảng 250 loại kháng nguyên O, 89 loại kháng nguyên K, 56 loại kháng nguyên H số định kháng nguyên F (Fairbrother, 1992, Carter, 1995) 1.4 Một số nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh cho vật nuôi Việt Nam Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh cho lợn, tác giả Nguyễn Thị Nội (1985); Lê Văn Tạo cs (1993, 1996); Cù Hữu Phú (1999, 2004), Nguyễn Khả Ngự (2000); Lý Thị Liên Khai (2001); Bùi Xuân Đồng (2002); Đỗ Ngọc Thuý cs (2002); Trần Thị Hạnh cs (2004); Trịnh Quang Tuyên cs (2004); Trương Quang (2005)…Một số tác giả nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh bê, nghé, trâu bò Nguyễn Văn Quang cs (2002); Trương Quang cs (2006); Vũ Khắc Hùng cs (2007)… Nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh gà có tác giả Tơ Minh Châu cs (2002); Võ Thành Thìn cs (2008a, b) Nghiên cứu khả mẫn cảm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli có nghiên cứu Phạm Khắc Hiếu cs (1995, 1999); Đỗ Ngọc Thuý cs (2002); Tô Liên Thu cs (2004), Tuy nhiên, nay, chưa có nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh ngan tiến hành Việt Nam PHẦN II: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Xác định số đặc điểm Colibacillosis ngan - Đánh giá tình hình ngan nghi mắc Colibacillosis - Xác định tỷ lệ ngan mắc nghi Colibacillosis theo lứa tuổi, mùa vụ - Xác định số triệu chứng bệnh tích điển hình 2.1.2 Phân lập xác định số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn E coli phân lập - Phân lập giám định vi khuẩn E coli từ mẫu bệnh phẩm - Xác định số đặc tính sinh học - Xác định số yếu tố gây bệnh chủng E coli gồm: Yếu tố bám dính, khả thu nhận sắt, kháng bổ thể huyết - Xác định serotype, mối liên quan với tổ hợp yếu tố gây bệnh - Gây nhiễm thực nghiệm chủng E coli phôi trứng - Xác định khả mẫn cảm với kháng sinh 2.1.3 Nghiên cứu biện pháp phòng trị Colibacillosis cho ngan - Biện pháp trị bệnh kháng sinh - Phòng bệnh axit hữu chế phẩm sinh học 2.2 Nguyên liệu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu: Colibacillosis ngan vi khuẩn E coli phân lập từ ngan bệnh, ngan khỏe 2.2.2 Mẫu nghiên cứu: Các mẫu bệnh phẩm (tim, phổi, gan, lách, túi khí, ruột) ngan nghi mắc bệnh Mẫu phân ngan khỏe 2.2.3 Phơi trứng thí nghiệm: Phơi trứng (ngan, vịt, gà) khoẻ mạnh, ấp tương ứng 15, 13 ngày 2.2.4 Mơi trường, hố chất - Các loại mơi trường, hóa chất dùng để ni cấy, phân lập, bồi dưỡng, xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn E coli; giấy tẩm kháng sinh; số kháng sinh chế phẩm dùng để phòng, trị thử nghiệm - Các kháng huyết O chuẩn (đa giá đơn giá) (Denka - Nhật) 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm: Trung tâm Nghiên cứu gia cầm Thụy phương; sở ni ngan Sóc Sơn, Ba Vì, Hà Nam; môn Vi trùng - Viện Thú Y - Thời gian: Từ năm 2007 đến năm 2010 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp chẩn đoán bệnh - Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào biểu triệu chứng, bệnh tích - Chẩn đốn phi lâm sàng: dựa vào kết phân lập vi khuẩn 2.4.2 Phương pháp lấy mẫu: Bệnh phẩm (gồm tim, phổi, gan, lách, túi khí, ruột) ngan nghi mắc Colibacillosis mẫu phân ngan khỏe giữ 4oC chuyển phịng thí nghiệm thời gian từ 1-4 2.4.3 Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn Theo quy trình thường quy Bộ mơn Vi trùng - Viện Thú Y 2.4.4 Phương pháp xác định số yếu tố liên quan đến độc lực - Xác định F1 fimbriae phản ứng ngưng kết hồng cầu (Jones & Rutter, 1974) - Kiểm tra khả kháng bổ thể huyết phương pháp ức chế bổ thể đo độ đục (Vandekerchove, 2005) - Xác định số yếu tố độc lực phương pháp PCR (Delicato cs, 2003; Vandekerchove cs, 2005) 2.4.5 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O chủng vi khuẩn phân lập được: ngưng kết nhanh phiến kính (Sojka cs, 1965) 2.4.6 Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn E coli phân lập được: Bằng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch đánh giá kết theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ (NCCLS) (1999) 10 Bảng 3.2 Tỷ lệ ngan mắc chết nghi Colibacillosis theo mùa Mùa xuân Năm Mùa hạ Mùa thu Mùa đông Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan nghi nghi nghi nghi chết chết chết chết Số ngan Số ngan Số ngan Số ngan mắc mắc mắc mắc (con) theo dõi (con) theo dõi theo dõi (con) theo dõi (con) (con) (con) (con) (con) (tỷ lệ (tỷ lệ (tỷ lệ (tỷ lệ (con) (con) (con) (con) (tỷ lệ (tỷ lệ (tỷ lệ (tỷ lệ %) %) %) %) %) %) %) %) 2007 580 2008 1650 2009 1850 Tổng hợp 4080 96 35 16,55 6,03 266 95 16,12 5,76 275 87 14,86 4,7 637 217 15,61 5,32 580 1650 1850 4080 91 30 15,69 5,2 246 78 14,91 4,73 239 76 12,92 4,11 571 184 14 4,51 580 1650 1850 4080 34 5,86 1,38 95 31 5,76 1,88 105 29 5,68 1,57 243 68 5,74 1,67 580 1650 1850 4080 41 15 7,07 2,59 110 43 6,67 2,61 114 37 6,16 265 95 6,5 2,33 11 3.1.3 Kết thống kê ngan nghi mắc bệnh Colibacillosis theo lứa tuổi Bảng 3.3 Ngan mắc chết nghi Colibacillosis theo lứa tuổi Ngan nghi mắc Colibacillosis Năm 2007 2008 2009 Tổng hợp Ngan chết nghi Colibacillosis Tổng số 1-8 >8-16 >16-24 >24-bán 1-8 ngan (tuần) (tuần) (tuần) (tuần) (tuần) theo dõi SL SL SL SL SL lứa (con) (con) (con) (con) (con) tuổi Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ (%) (%) (%) (%) (%) 110 46 27 36 35 620 17,74 7,42 4,35 5,80 5,65 251 102 63 84 82 1500 16,73 6,80 4,2 5,60 5,47 208 82 52 71 69 1280 16,25 6,41 4,06 5,55 5,39 569 230 167 191 186 3400 16,74 6,76 4,91 5,60 5,47 >8-16 (tuần) SL (con) Tỷ lệ (%) 15 2,42 36 2,40 48 3,75 99 2,91 >16-24 >24-bán (tuần) (tuần) SL SL (con) (con) Tỷ lệ Tỷ lệ (%) (%) 13 1,45 2,10 18 36 1,20 2,40 16 31 1,25 2,42 43 80 1,27 2,35 Từ 1-8 tuần tuổi giai đoạn ngan con, chức thể chưa hoàn thiện, tốc độ tăng khối lượng thể nhanh, đồng thời ngan thay lông, mọc lông ống mới, riêng ngan nuôi sinh sản, phần ăn bắt đầu bị hạn chế, tỷ lệ ngan mắc chết bệnh cao (16,74 5,47%), cao hẳn giai đoạn khác (P24 tuần tuổi), thời điểm tỷ lệ đẻ gần đến đỉnh cao, sức đề kháng ngan giảm, ngan dễ mắc chết bệnh 3.1.4 Triệu chứng ngan nghi mắc Colibacillosis Bảng 3.4 thống kê kết kiểm tra triệu chứng ngan nghi mắc Colibacillosis: Kết cho thấy triệu chứng đường tiêu hoá (tiêu chảy phân xanh, nhày, lẫn máu) chiếm tỷ lệ 65,62%; khó thở chiếm 51,11%; bỏ ăn ủ rũ chiếm 47,66%; Ngan sinh sản mắc bệnh, tiêu chảy phân xanh có lẫn máu, đẻ giảm, trứng non, mỏng vỏ, méo mó Điều quan trọng ngan có triệu chứng khó thở tiêu chảy máu thường chết 12 nhanh với tỷ lệ cao, tỷ lệ chết trung bình ngan mắc Colibacillosis sở 27,47% Đây thiệt hại đáng quan tâm Cơ sở theo dõi Tổng số ngan nghi mắc Colibacillosis (con) Bảng 3.4 Các triệu chứng ngan nghi mắc Colibacillosis 200 500 950 1200 2100 Tổng hợp 4950 Bỏ ăn, ủ rũ SL (con) Tỷ lệ (%) 105 52,5 235 47 426 44,84 530 44,17 1063 50,62 2359 47,66 Các triệu chứng bệnh Phân xanh, Khó thở nhày, lẫn máu SL (con) SL (con) Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) 137 81 68,50 40,5 351 215 70,2 43 650 531 68,42 55,89 780 648 65 54 1330 1055 63,33 50,24 3248 2530 65,62 51,11 Các triệu chứng khác SL (con) Tỷ lệ (%) 13 6,5 34 6,8 81 8,53 107 8,92 183 8,71 418 8,44 Ngan chết Colibacillosis SL (con) Tỷ lệ (%) 59 29,5 143 28,6 269 28,32 328 27,33 561 26,71 1360 27,47 3.1.5 Bệnh tích ngan nghi mắc Colibacillosis Kết hợp với chẩn đốn phịng thí nghiệm (sẽ trình bày chi tiết phần sau), mổ khám 293 ngan với triệu chứng trên, hầu hết ngan có biểu hai loại bệnh tích Thể viêm túi khí phổ biến (54,27%), viêm ruột (49,49%) Ngan sinh sản mắc bệnh, ngồi bệnh tích chung nêu trên, buồng trứng biến dạng, trứng non bị vỡ ra, gây viêm dính xoang phúc mạc, bệnh tích dễ nhầm lần với bệnh thương hàn, vậy, chẩn đốn lâm sàng khơng chắn phải kết hợp với chẩn đốn phịng thí nghiệm (phân lập, xác định nguyên gây bệnh) Các triệu chứng bệnh tích ngan nghiên cứu tương tự tác giả: Nguyễn Xuân Bình (2006) mô tả Colibacillosis gà; tác giả Gross (1994), Dho-Moulin Fairbrother (1999), Kikuyasu Nakamura (2000) mô tả Colibacillosis gia cầm 13 3.2 Kết phân lập giám định vi khuẩn E coli từ phủ tạng ngan nghi mắc Colibacillosis 3.2.1 Kết phân lập vi khuẩn E coli từ phủ tạng ngan bệnh Từ 122 mẫu phủ tạng ngan ốm chết nghi mắc Colibacillosis, số mẫu gan phân lập vi khuẩn E coli chiếm tỷ lệ cao (100%), tiếp đến lách (97,54%), phổi túi khí 83,61% 82,79%, máu tim 30,33% 3.2.2 Kết giám định số đặc tính sinh hóa chủng E coli phân lập Kết giám định đặc tính sinh hóa 122 chủng E coli (mỗi chủng vi khuẩn đại diện cho ngan bệnh): 6/122 chủng (4,9%) có khả gây dung huyết; 100% chủng có khả di động sản sinh Indol, khơng chủng có khả sinh H2S; 100% chủng có khả tạo khuẩn lạc màu đỏ thạch Congo; phản ứng sinh Indol MR dương tính Các phản ứng VP Citrat âm tính Tỷ lệ chủng lên men đường lactose glucose 100%, mannitol 95,1%, sorbitol 93,4%; maltose 91,0%; xylose 79,5%, với đường Inositol 100% âm tính 122 chủng vi khuẩn phân lập có đặc điểm hoàn toàn phù hợp với cách phân loại giám định vi khuẩn E coli Edwards & Ewing (1972) công bố 3.3 Kết xác định số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn E coli phân lập 3.3.1 Kết xác định yếu tố bám dính 3.3.1.1 Kết xác định yếu tố bám dính F1 (F1 fimbirae) * Kết xác định F1 fimbriae phản ứng ngưng kết hồng cầu Số chủng vi khuẩn E coli có khả gây ngưng kết hồng cầu bò, cừu gà theo thứ tự 44, 38, 43 chủng phản ứng có mặt 2,5% đường D-Mannose với hiệu giá pha lỗng vi khuẩn >1/4 Đây 14 chủng kháng lại đường D-Mannose Số chủng lại mẫn cảm với đường D-Mannose, chủng mang F1 fimbriae * Kết xác định F1 fimbriae phản ứng PCR Trong 122 chủng kiểm tra, có 109/122 chủng (89,34%) mang gen FimA 30/122 chủng (24,59%) mang gen FimH Bảng 3.9 Kết xác định gen quy định khả sản sinh F1 fimbriae phản ứng PCR Yếu tố độc lực Gen xác định Mã hóa protein FimA F1 fimbriae FimH Protein F1 Fimbriae Tiểu phần bám dính F1 Fimbriae Kết Số chủng (+)/Số chủng kiểm tra Tỷ lệ % 109/122 89,34 30/122 24,59 Tổng hợp kết xác định F1 fimbriae kiểu hình (bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu) kiểu gen (phương pháp PCR), kết cho thấy: có 78-84 chủng (63,9-68,9%) có bộc lộ F1 firmbiae điều kiện in vitro, có tới 109 chủng (89,34%) mang gen FimA, có 30/122 chủng (24,59%) mang gen FimA FimH 3.3.1.2 Kết xác định yếu tố bám dính P fimbriae yếu tố xâm nhập (Intimin) Bảng 3.10 Kết xác định gen quy định khả sản sinh P fimbriae Intimin vi khuẩn E coli Yếu tố độc lực Gen xác định P Fimbriae PapC Mã hóa protein Kết Số chủng (+)/Số Tỷ lệ chủng kiểm tra % 65/122 53,28 P Fimbriae Protein Intimin (bám Intimin eae 6/122 4,92 dính xâm nhập) Kết có 65/122 chủng mang gen PapC (53,28%) 6/122 chủng mang gen eae (4,92%) Kết tỷ lệ chủng mang gen PapC eae 15 nghiên cứu cao nhiều so với số nghiên cứu Janβen cs (2001), Delicato cs (2003), công bố 3.3.2 Kết xác định số gen liên quan đến khả thu nhận sắt Bảng 3.11 Kết xác định gen quy định khả thu nhận sắt chủng E.coli phân lập Gen xác định Yếu tố độc lực Hệ thống nhu nhận sắt Mã hóa protein Yếu tố cảm thụ aerobactin Tổng hợp aerobactin IutA IucA Kết Số chủng (+)/Số chủng Tỷ lệ kiểm tra % M 112/122 91,80 98/122 80,32 10 11 12 13 14 15 821 bp 508 bp 331 bp 300 bp 760 bp 559 bp 478 bp Hình 3.17: Các sản phẩm phản ứng PCR sau trình điện di để xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn E coli Ghi chú: Hàng trên: Giếng 1: IutA dương tính (Đối chứng dương) Giếng 2: IutA IucA dương tính (Đối chứng dương) Giếng 3: IutA, FimA, FimH IucA dương tính (Chủng phân lập - CPL) Giếng 4, 9: IutA, FimA, FimH dương tính (CPL) Giếng 5, 6, 13: IutA FimH dương tính (CPL) Giếng 7: IutA dương tính (CPL) Giếng 8: IutA, FimA dương tính (CPL) Giếng 10: IutA IucA dương tính (CPL) Giếng 11: IutA, FimA IucA dương tính (CPL) Giếng 12: Âm tính Giếng 14, 15, 16: IutA dương tính (CPL) M: 100 bp marker Hàng dưới: Giếng 1: CvaC Iss dương tính (Đối chứng dương) Giếng 2, 9, 11: CvaC Tsh dương tính (CPL) Giếng 3, 5, 6, 13, 14, 15: CvaC, Tsh Iss dương tính (CPL) Giếng 4: CvaC Iss dương tính (CPL) Giếng 7, 8, 10: Tsh dương tính (CPL) Giếng 12: CvaC dương tính (CPL) Giếng 16: Tsh Iss dương tính (CPL) M: 100 bp marker Bảng 3.11 cho thấy có 112/122 chủng (91,80%) mang gen iutA 16 98/122 chủng (80,32%) mang gen iucA Kết tương đương với nghiên cứu Võ Thành Thìn cs (2008a) nghiên cứu chủng E coli gà phát thấy có 90% số chủng mang gen iutA; kết nghiên cứu Dozois cs (1992), Delicato cs (2003) 3.3.3 Kết xác định khả kháng bổ thể huyết * Kết xác định phương pháp ức chế bổ thể Tất chủng vi khuẩn kiểm tra có khả đề kháng với bổ thể huyết gà, có 103 chủng (84,43%) đề kháng mạnh 19 chủng (15,57%) đề kháng trung bình Kết tương đương với số nghiên cứu Võ Thành Thìn cs (2008b), Vandekerchove cs (2005), Brenda cs (1993) * Kết xác định phương pháp PCR Trong số 122 chủng E coli kiểm tra, có 84 chủng mang gen Iss (chiếm 68,85%), 73 chủng mang gen Tsh (chiếm 59,84%) 87 chủng mang gen CvaC (chiếm 71,31%) Bảng 3.13 Kết xác định số gen liên quan đến khả kháng bổ thể huyết chủng E coli Yếu tố độc lực Khả kháng bổ thể huyết Mã hóa protein Kết Số chủng dương tính/Số chủng kiểm tra Tỷ lệ % Iss Tăng khả sống huyết 84/122 68,85 Tsh Ngưng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ 73/122 59,84 CvaC Colicin V 87/122 71,31 Gen xác định 3.3.4 Kết xác định số loại độc tố Trong số 122 chủng E coli kiểm tra, không chủng có gen Cnf1 Stx2, nhiên, có tới 30/122 chủng (24,59%) có mang gen Cnf2 6/122 chủng mang gen Stx1 (4,92%) 17 Bảng 3.14 Kết xác định số gen liên quan đến độc tố chủng E coli phân lập phương pháp PCR Yếu tố độc lực Gen xác định Cnf1 Độc tố Cnf2 Stx1 Stx2 Mã hóa protein Kết Số chủng dương tính/Số chủng kiểm tra Tỷ lệ % 0/122 30/122 24,59 6/122 0/122 4,92 Yếu tố gây độc hoại tử tế bào loại Yếu tố gây độc hoại tử tế bào loại Độc tố Shiga Độc tố Shiga 3.3.5 Tổng hợp yếu tố độc lực có chủng E coli phân lập từ ngan bệnh ngan khỏe Khảo sát có mặt 13 loại gen (FimA, FimH, PapC, eae, IutA, IucA, Iss, Tsh, CvaC, Cnf1, Cnf2, Stx1, Stx2) 122 chủng E coli phân lập từ ngan bị bệnh 12 chủng từ ngan khỏe sau: Có 11/13 loại gen phát số 122 chủng E coli từ ngan bệnh hai loại gen không phát thấy Cnf2 Stx2; đó, 6/13 loại gen phát thấy chủng E coli phân lập từ ngan khỏe FimA, IutA, IucA, Iss, Tsh CvaC Như vậy, loại gen có khác biệt rõ rệt chủng E coli từ ngan bệnh ngan khỏe, gen phát thấy chủng từ ngan bệnh (FimH, PapC, eae, Cnf2 Stx1) gen (Iss, Tsh CvaC) với tỷ lệ cao hẳn từ ngan bệnh (P0,05), có khác biệt rõ chủng từ ngan, gà bệnh với chủng từ ngan khỏe (P