ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VÀ TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU MẶN TỪ CÁC GiỐNG LÚA OM4498, VND95-20, IR64, CR203 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY IN VITRO

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VÀ TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU MẶN TỪ CÁC GiỐNG LÚA OM4498, VND95-20, IR64, CR203 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY IN VITRO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VÀ TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU MẶN TỪ CÁC GiỐNG LÚA OM4498, VND95-20, IR64, CR203 BẰNG

CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Tâm

Học viên : Nguyễn Thị Hồng Liên

Thái Nguyên - 2010

Cây lúa (Oryza sativa L.) là

loại cây trồng rất mẫn cảm

với các điều kiện ngoại

cảnh

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro

mở ra một hướng mới trong

công tác cải tạo giống cây

trồng và góp phần làm phong

phú thêm nguồn vật liệu khởi

đầu trong công tác chọn giống

Ở những vùng ven biển một

trong những nguyên nhân

quan trọng làm giảm năng

suất là đất nhiễm mặn

MỞ ĐẦU

Đánh giá khả năng chịu mặn và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ các giống lúa OM4498, VND95-20, IR64, CR203 bằng công nghệ nuôi cấy in vitro

Mục tiêu nghiên cứu

MỞ ĐẦU

Tạo được vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

- Sàng lọc dòng tế bào chịu mặn, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh Phân tích đặc điểm nông học quần thể R0, thế hệ R1.

- Tách chiết ADN tổng số

từ lá lúa Nhân gen liên quan đến khả năng chịu mặn từ các giống lúa nghiên cứu.

Tạo được vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

- Sàng lọc dòng tế bào chịu mặn, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh Phân tích đặc điểm nông học quần thể R0, thế hệ R1.

- Tách chiết ADN tổng số

từ lá lúa Nhân gen liên quan đến khả năng chịu mặn từ các giống lúa nghiên cứu.

Đánh giá được khả năng chịu mặn của

một số giống lúa nghiên cứu

- Đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm thông

qua xác định ảnh hưởng của NaCl đến hàm

lượng đường tan và hoạt độ của α - amylase.

- Đánh giá nhanh khả năng chịu mặn của các

giống nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá bằng

phương pháp gây mặn nhân tạo Xác định

hàm lượng prolin sau khi xử lý mặn sinh lí

cây mạ ba lá bằng dung dịch NaCl

- Đánh giá khả năng chịu mặn ở mức độ mô

sẹo.

Đánh giá được khả năng chịu mặn của

một số giống lúa nghiên cứu

- Đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm thông

qua xác định ảnh hưởng của NaCl đến hàm

lượng đường tan và hoạt độ của α - amylase.

- Đánh giá nhanh khả năng chịu mặn của các

giống nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá bằng

phương pháp gây mặn nhân tạo Xác định

hàm lượng prolin sau khi xử lý mặn sinh lí

cây mạ ba lá bằng dung dịch NaCl

- Đánh giá khả năng chịu mặn ở mức độ mô

sẹo.

Nội dung nghiên cứu

MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chúng tôi đã tham khảo 60 tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh

liên quan đến các vấn đề sau:

- Giới thiệu về cây lúa

- Đặc điểm sinh học cây lúa nước

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Vật liệu nghiên cứu là hạt của các giống lúa: OM4498, VND95-20, IR64 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Cần Thơ cung cấp, CR203 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Bắc Giang cung cấp

Phương pháp

- Phương pháp nuôi cấy mô- tế bào

- Phương pháp phân tích hoá sinh

- Phương pháp phân tích sinh lý

- Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng

- Phương pháp sinh học phân tử

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm

2 Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase

ở giai đoạn hạt nảy mầm

0 1 2 3 4 5 6 7

Ngày

Hình 3.2 Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Giống Phương trình hồi quy Hệ số tương quan (r)

Bảng 3.3 Tương quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường tan

ở giai đoạn hạt nảy mầm

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Giống Tỉ lệ nảy mầm sau 96 giờ (%) Chiều dài rễ (mm) Chiều dài mầm (mm)

Giống Thời gian xử lí

(ngày)

Tỉ lệ không ảnh hưởng (%)

Tỉ lệ sống sót (%)

Khả năng giữ nước (%)

5 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa bằng

phương pháp gây mặn nhân tạo

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

6 Xác định chỉ số chịu mặn tương đối ở mức độ cây mạ các giống

lúa

0 20 40 60 80

100 a

b

c

d e

g

OM4498 IR64 VND95-20 CR203

Giống Chỉ số chịu mặn tương đối của cây mạ Thứ tự

Giống 3 ngày 5 ngày

xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá (µM/g khối lượng tươi)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

8 Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của mô sẹo các giống lúa nghiên cứu

Bảng 3.8 Khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái

sinh cây của các giống lúa nghiên cứu

Giống

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) sau

3 tuần

Tốc độ sinh trưởng (đvms/hạt/

9 Ảnh hưởng của NaCl đến tỷ lệ sống sót của mô sẹo

Bảng 3.9 Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau 3 tuần nuôi phục hồi

10 Ảnh hưởng của NaCl đến tốc độ sinh trưởng của mô sẹo

Tên giống

Tốc độ sinh trưởng tương đối (đvms/mô/3tuần)

ĐC NaCl 0,03M NaCl 0,07M NaCl 0,1M

OM4498 2,41 ± 0,02 2,91 ± 0,01 2,14 ± 0,01 1,73 ± 0,02VND95-20 2,66 ± 0,02 2,74 ± 0,01 2,15 ± 0,02 1,25 ± 0,01

IR64 2,04 ± 0,01 2,17 ± 0,02 1,61 ± 0,01 0

Bảng 3.11 Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo

sau xử lý NaCl 3 tuần

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

11 Tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo sau khi xử lý NaCl

Bảng 3.12 Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý NaCl 0,1M

Giống

Khả năng tái sinh chồi (%)

Hình 3.8 Một số hình ảnh trong nuôi cấy in vitro

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

12 Phân nhóm các giống lúa nghiên cứu dựa trên sự phản ứng với NaCl ở mức độ

mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non

Bảng 3.13 Hệ số khác nhau về sự biểu hiện các tính trạng của các giống lúa đối với mặn

Hình 3.9 Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lúa dựa trên

sự biểu hiện kiểu hình của 14 tính trạng

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

13 Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu mặn

- Ngưỡng chọn dòng tế bào chịu mặn đối với các giống OM4498,

VND95-20 là 0,1M, ngưỡng chọn dòng chịu NaCl của giống IR64, CR203 là 0,07M

- Kết quả thu được 68 dòng mô có khả năng chịu NaCl và 180 dòng cây xanh của 4 giống lúa phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

14 Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R0

Bảng 3.14 Mức độ biến động một số chỉ tiêu nông học của quần thể R0 tái sinh từ mô sẹo chịu mặn của giống OM4498

Chỉ tiêu theo dõi

15 Đánh giá mức độ ổn định một số đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc thế hệ R1

Hình 3.10 Một số hình ảnh về các dòng tái sinh thế hệ R1 có nguồn gốc mô sẹo chịu

mặn trồng ngoài đồng ruộng

A: Biến dị về thời gian sinh trưởng của dòng R1.OM16;

B: Biến dị về chiều cao cây ở dòng R1.VND8;

C: Thế hệ R1 giống VND95-20

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

16 Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN

Tên giống Hàm lượng ADN

17 Nhân gen NACx bằng kĩ thuật PCR

Hình 3.11 Nhân gen từ các giống lúa bằng kĩ thuật PCR

A: Phổ điện di ADN của 4 giống lúa;

B: Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen NACx của 4 giống lúa với mồi DBF và DBMF ở nhiệt độ 45 0 C và 46 0 C

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I Kết luận

1 Ở giai đoạn hạt nảy mầm, hoạt độ của α - amylase, hàm lượng đường tan có xu hướng tăng từ 1 đến 3 ngày tuổi, bắt đầu giảm ở 5 ngày tuổi Dưới tác động của NaCl 0,1M, tốc độ nảy mầm, chiều dài mầm và chiều dài rễ của các giống lúa đều giảm Trong đó, giảm nhiều nhất là giống CR203, giảm ít nhất là giống OM4498

2 Ở giai đoạn cây non 3 lá, các giống lúa phản ứng khác nhau đối với mặn Khi tiến hành gây mặn nhân tạo ở giai đoạn cây non 3 lá, các giống lúa nghiên cứu đều tăng tổng hợp axit amin prolin

3 Cả 4 giống lúa đều có khả năng tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây từ

mô sẹo Xử lý mô sẹo ở ngưỡng NaCl 0,03M không làm ảnh hưởng tới

sự sinh trưởng của mô sẹo, ngược lại còn kích thích sự sinh trưởng của

mô sẹo Tăng nồng độ xử lý NaCl lên 0,07M và 0,1M làm ức chế sự sinh trưởng của mô sẹo so với đối chứng

4 Ngưỡng chọn dòng chịu mặn của các giống lúa phụ thuộc vào khả năng chịu mặn của từng giống Kết quả đã tạo được 68 dòng mô và 180 dòng cây xanh

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5 Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền cao ở nhiều tính trạng nông học, cho phép lựa chọn những dòng có tính trạng mong muốn Qua 2 vụ theo dõi đã thu được một số dòng R1 có những đặc điểm nổi bật

6 Đã nhân bản thành công gen liên quan đến khả năng chịu mặn của các giống lúa nghiên cứu từ ADN hệ gen, đó là gen NACx với kích thước khoảng 1kb

7 Khả năng chịu mặn của các giống nghiên cứu được sắp xếp theo thứ

tự sau: OM4498 >VND95-20 > IR64 > CR203

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

II Đề nghị

1 Để có thể đưa ra kết luận đầy đủ và chính xác về cấu trúc và bản chất của gen chịu mặn NACx ở cây lúa cần phải xác định trình tự của các nucleotit của gen này.

2 Tiếp tục theo dõi các dòng thu được ở thế hệ tiếp theo, tiến hành phân tích sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử các dòng chọn lọc làm cơ sở tuyển chọn các dòng mang nhiều đặc điểm ưu việt để bồi dưỡng thành giống lúa có khả năng chịu mặn cao.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ