V. Phương pháp.
6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR (Polymerase Chain Reaction).
a). Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25µl/ phản ứng).
Nước cất 2 lần 10,75
dNTPs 4
P1 (mồi ngược) 1
P2 (mồi xuôi) 1
0,1% BSA 0,25
Taq polymerase Fer 0,5
ADN 2
b). Qui trình PCR.
- Biến tính ADN ở 950C trong 5 phút.
- Tiếp theo là 30 chu kỳ được gia nhiệt như sau: + 950C trong 1 phút
+ 490C trong 1 phút + 720C trong 1 phút
- Bước cuối cùng là 720C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -200C để chạy điện di.
c). Điện di
Sản phẩn ADN sau khi trích, được tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật
Trung tâPmCRH, sọaucđlóiệkuiểmĐtHra CbằnầgnphTưhơnơg @phápTđàiệinlidệi utrêhn ọgcel taậgaprovseà1%ngchó icêhnứa cứu utrêhn ọgcel taậgaprovseà1%ngchó icêhnứa cứu
ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di được chụp bằng máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000 (Hoa Kỳ).
- Chuẩn bị gel nhỏ: ( 20ml) + Agarose (1%): 0,2g +TAE buffer (1X): 20ml
- Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave). - Sau khi nấu để nguội khoảng 500 - 600C, bổ sung EtBr: 0,4µl - Rót gel vào khuôn.
- Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu.
- Load mẫu: dùng Micropipet hút 10µl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10µl mẫu ADN vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
PHẦN IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum