Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật lên men lactic để tạo chất cấy vi sinh vật (inoculants) dùng trong chế biến, bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN LACTIC ĐỂ TẠO CHẤT CẤY VI SINH VẬT INOCULANTS DÙNG TRONG CHẾ BIẾN, BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN LACTIC ĐỂ TẠO CHẤT CẤY VI SINH VẬT (INOCULANTS) DÙNG TRONG CHẾ BIẾN, BẢO

QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

CHO GIA SÚC NHAI LẠI

1 Trần Quốc Việt2 và 1 Ninh Thị Len

Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội;

1 Bộ môn Dinh dưỡng, TACN và Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi

Tóm tắt

Từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên, 134 chủng vi khuẩn lactic được phân lập trong đó có 131 chủng vi khuẩn đồng hình và 3 chủng dị hình Các chủng này được tuyển chọn bằng cách thử hoạt tính catalaza, nhuộm Gram, khả năng sinh axit lactic, kháng vi khuẩn kiểm định, enzyme ngoại bào… Tám chủng có hoạt tính sinh học cao nhất là 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17, L01 và L19 được lựa chọn để định danh Kết hợp cả phương pháp sinh

lý, sinh hóa (lên men các nguồn đường, khả năng di động, dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng…) và sinh học phân tử (giải trình tự rADN 16S) có thể xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L pentosus; các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L plantarum và chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis Các chủng được lựa chọn đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic

1 Đặt vấn đề

Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng vi sinh vật (VSV) để chế biến và bảo quản thực phẩm, nhưng phải đến nửa cuối thế kỷ 19, việc chế biến thức ăn xanh theo phương pháp ủ chua dựa mới bắt đầu được phát triển ở các nước châu Âu (Mc Donald, 1991) Đến nay, kỹ thuật ủ chua thức ăn xanh và phụ phẩm nông nghiệp đã trở nên rất phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới Mặc dù là một kỹ thuật cổ điển dựa trên cơ sở lên men của các VSV, nhưng điều khiển quá trình lên men để nâng cao hiệu quả chế biến, bảo quản, giảm tối đa sự thất thoát, thối, hỏng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất vật nuôi làm một việc rất khó Để khắc phục điều đó, rất nhiều chất bổ trợ truyền thống như các loại nguyên liệu giầu nguồn đường dễ lên men (rỉ mật, bột sắn, cám gạo…vv) thường được sử dụng để thúc đẩy quá trình lên men của các VSV (Sadahiro Ohmono, 2002) Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng các chất bổ trợ cũng rất khác nhau, phụ thuộc vào bản chất của vật liệu ủ, thời gian, nhiệt độ hỗn hợp ủ vv (Mc Donald, 1991) Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, sử dụng chất cấy vi sinh vật (Bacterial Inoculants) như chất bổ trợ sinh học đã tạo ra một bước ngoặt mới trong công nghệ chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Sadahiro Ohmono, 2002; Machin, 2005)

Theo Weinberg và ctv (2007), sử dụng các VSV lactic như chất VSV đã nâng cao rõ rệt hiệu quả chế biến và bảo quản thân cây ngô, làm tăng khả năng ăn vào và tăng năng suất sữa ở

bò Các chất cấy VSV không chỉ thúc đẩy nhanh quá trình lên men của các vi khuẩn lactic trong hỗn hợp ủ thông qua hiệu quả sản sinh axit lactic, làm giảm pH, tạo ra các bacterioxin ức chế các

vi khuẩn gây thối, mà chúng còn có tác dụng như những vi sinh vật probiotic, làm thay đổi đáng

kể hệ vi sinh vật dạ cỏ của loài nhai lại theo hướng có lợi cho vật chủ (Wallace và ctv, 1993; Nocek và ctv, 2006)

Nội dung của nghiên cứu này thuộc đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phế phụ phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, xác định các đặc điểm phân loại, đặc tính sinh lý, sinh hoá của một số chủng vi khuẩn lên men lactic phục vụ cho việc sản xuất chất cấy vi sinh vật (Innocunants)

2 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi

sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà

- Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật, định tính, định lượng và phân loại sử dụng của các hãng Merck, Sigma, Wako…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, phân loại và định danh các vi khuẩn lactic như nguồn sản xuất các chất cấy VSV

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic

- Mẫu được pha loãng 10-3 và 10-5, lấy 0,05 ml gạt trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt

độ 30o

C Sau 48 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc trên các đĩa dưới kính lúp, chọn các khuẩn lạc

có vòng trong bao quanh Các chủng này sau đó được thuần khiết và cấy truyền ra các ống thạch nghiêng để sử dụng ngay cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu ở - 800 C nhằm giữ được giống trong thời gian dài

- Các chủng vi khuẩn phân lập đầu tiên được thử khả năng sinh catalaza (bằng cách nhỏ 1 giọt 3% H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn Nếu là dương tính thì sủi bọt Vi khuẩn lactic phải có catalaza (-)) Các chủng có catalaza âm tính được nhuộm Gram và chỉ các chủng là Vi khuẩn Gram dương mới được xác định khả năng lên men đồng hình (Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường MRS dịch thể có chứa ống Durham, để 1-3 ngày Nếu không sinh khí CO2 trong ống Durham thì đó là lên men đồng hình) và khả năng kháng vi khuẩn kiểm định

Các phương pháp định tính và định lượng

- Định lượng axit bằng phương pháp chuẩn độ Therner (Emanuel et al., 2005)

- Xác định nồng độ axit lactic (%) bằng sắc ký lỏng cao áp

- Xác định khả năng kháng khuẩn và sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

- Xác định khả năng sinh trưởng bằng mật độ quang (OD) (đo dịch nuôi cấy tế bào trên máy quang phổ ở bước sóng 600nm)

2.3.2 Phương pháp phân loại

2.3.2.1 Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992)

- Xác định khả năng lên men sinh axit từ các loại đường: Cấy vi khuẩn vào môi trường dịch thể MRS (có chứa bromocresol purple làm chất chỉ thị pH) chứa các loại đường khác nhau (1%) thay cho glucoza Sau 2-3 ngày, nếu vi khuẩn phát triển, sinh axit từ các nguồn đường thì dịch nuôi cấy chuyển sang màu vàng

- Xác định khả năng di động: Môi trường MRS dịch thể bổ sung 0.15% thạch Cấy đứng,

để 2-3 ngày ở 300C, nếu vi khuẩn mọc loang ra, đục cả môi trường thì chủng vi khuẩn đó có khả năng di động

- Khả năng làm đông tụ sữa: Môi trường chứa 10% skim milk bổ sung bromocresol purple là chỉ thị pH Cấy vi khuẩn, để 300

C trong 5-7 ngày Chủng nào có khả năng đông tụ sữa thì môi trường biến đổi từ hơi tím thành màu vàng nhạt, sữa đông lại

- Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thể (pH = 6) có các nồng độ muối 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8%, lắc 220 vòng/phút ở 30oC trong 3 ngày

- Đánh giá khả năng năng chịu nhiệt: Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường dịch thể có pH ổn định (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 20, 25, 30, 37, 450C

- Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau: Tương tự như trên, các chủng vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (3, 4,

5, 6, 7, 8 và 9), trên máy lắc ổn nhiệt (37oC)

2.3.2.2 Phân loại dựa trên giải trình tự rADN 16S

- Xác định trình tự rADN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama

và cs (2009)

- Đọc trình tự ADN

Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động 3100

Avant Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal W 1.83 Các trình tự được so sánh

với trật tự ADNr 16S của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên loài

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình

3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh axit lên men đồng hình

Với mục đích phân lập được các vi khuẩn lên men lactic đồng hình mạnh, chúng tôi sử dụng các nguồn mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa làm đối tượng cho nghiên cứu, 134 chủng vi sinh vật đã được phân lập Tất cả các chủng này đều có Catalaza âm

tính và là vi khuẩn Gram dương Trong đó xác định được 131 chủng lên men đồng hình Trong

số 3 chủng lên men dị hình, chủng L19 có khả năng sinh axit cao (dựa vào vòng trong của CaCO3) cũng được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

132 chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút/370C, sau 2 ngày quan sát thấy có 70 chủng phát triển được tại nhiệt độ 370C Các chủng này được xác định hàm lượng axit sinh ra trong dịch nuôi bằng phương pháp chuẩn độ Therner Sở dĩ có điều đó là do trong quá trình ủ chua thức ăn cho động vật nhai lại, nhiệt độ thường tăng cao, nên các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động phải có khả năng chịu nhiệt

Kết quả đánh giá khả năng sản sinh axit lactic được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Khả năng sản sinh axit của các vi khuẩn

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng axit (g/l)

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng axit (g/l)

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng axit (g/l)

Trong số 70 chủng nghiên cứu, đã chọn được 19 chủng vi khuẩn chịu được nhiệt độ là

370C, có khả năng sinh axit cao (20 - 21 g/l) được đánh giá sự sản sinh axit lactic trên thiết bị sắc

ký lỏng cao áp và khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi nhằm tìm ra các chủng sinh axit lactic đồng hình cao lại có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh

Kết quả được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn

Ký hiệu

chủng

Nồng độ (%)

axit lactic

Kích thước vòng kháng khuẩn (D-d, mm)

Shigella sp Salmonella sp E coli M luteus

Kết quả cho thấy hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn nghiên cứu sinh ra không chênh lệch nhiều, thấp nhất là chủng 4-6 (15,3%) và cao nhất là chủng 2-9 Mặt khác kết quả ở bảng 2 cho thấy cả 19 chủng này đều có khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định, phổ kháng

khuẩn rộng (kháng được cả vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus và Gram âm E.coli, Salmonella và Shigella) thể hiện qua vòng kháng khuẩn cao Kết quả này cũng phù hợp với kết

quả nghiên cứu của Mai Thị Đàm Linh và cs (2008) trên các chủng lactic Lo, L1, L2 và Dr1 và

của Mourad Kacem và cs (2005) trên các chủng Lactobacillus plantarum OL2, OL9, OL15 và Enterococcus feacalis OL20, các chủng này đều có phổ kháng khuẩn rộng

Từ các kết quả bảng 1 và 2, chúng tôi đã chọn được 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5;

4-14, 8-10; 9-17; L10; L19) là các chủng có hoạt tính cao và đại diện cho các mẫu phân lập (cỏ Nghệ An, cỏ Mộc Châu, cỏ Ba vì, Ngô Mộc châu, dứa…) để phân loại và nghiên cứu các đặc điểm sinh học

3.1.2 Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn

Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS theo phương pháp cấy vạch tiếp xúc với các chủng khác nhau Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, ở tất cả các mẫu đều sinh trưởng tốt Điều này cho thấy cả 8 chủng lựa chọn đều không kháng nhau

3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng lựa chọn

Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS có chứa cơ chất tinh bột, CMC, pectin, protein và xylan Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Khả năng phân giải cơ chất được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất D-d, mm

Bảng 3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của các vi khuẩn

Ký hiệu

chủng

Hoạt tính enzym (D-d, mm)

Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase

Kết quả bảng trên cho thấy trừ chủng L01, thì hầu như cả 7 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym ngoại bào, vòng phân giải cơ chất từ 5-18 (mm) Trong đó các chủng sinh enzyme xylanase là cao nhất Đặc biệt chủng L19 – chủng duy nhất lên men dị hình – phân giải các cơ chất mạnh nhất, mạnh hơn cả các chủng lên men đồng hình Như vậy, đây là một đặc điểm rất tốt đối với các chủng được lựa chọn làm chất cấy trong quá trình ủ chua, bởi ngoài khả năng sinh axit cao, kháng khuẩn các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất trong các đống ủ

3.2 Phân loại các chủng được tuyển chọn

3.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào kết hợp các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự rADN 16S

Bảng 5 trình bày các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu Tất cả 08 chủng vi khuẩn đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính, không có khả năng di động và hình thái tế bào có 2 dạng: hình que và hình cầu Các chủng phân

lập đều sinh trưởng được khi môi trường nuôi cấy có pH 4 - 8, nhiệt độ nuôi cấy 25 – 370C, nồng

độ NaCl 0 - 6 %, tuy nhiên sự sinh trưởng ở các mức độ khác nhau

Bảng 5 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Các đặc tính Chủng vi khuẩn

2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19

Khả năng lên men và tạo axit từ

các nguồn hyđratcacbon:

(yếu)

+ (yếu)

(yếu)

(yếu)

(yếu)

(yếu)

+ (yếu)

(yếu)

(yếu)

+

(yếu)

+ (yếu)

+ + + +

(yếu)

+ (yếu)

+

(yếu)

+ (yếu)

Sinh trưởng ở các pH

yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+( rất yếu)

+(rất yếu)

yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+( rất yếu)

+(rất yếu)

Sinh trưởng trong NaCl (%)

(yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

- + (rất

yếu)

+ (rất yếu)

- -

Các đặc tính Chủng vi khuẩn

2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19

Nhiệt độ sinh trưởng ( 0

C)

yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

+ (rất yếu)

(yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

+ (yếu)

Chú thích: (+) dương tính; (-) âm tính

3.2.2 Xác định trình tự 16S rADN và xây dựng cây phân loại

Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, được thu sinh khối tế bào và tách ADN genom Đoạn gen mã cho 16S rARN được khuyếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi

và mồi ngược Kết quả đọc trình tự (phụ lục) được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với ngân hàng dữ liệu GeneBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài

Trình tự 16S rADN của 8 chủng nghiên cứu được xác định Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S của 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với

các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus, Lactobacillus Pediococcus acidilactici được sử

dụng làm nhóm ngoài Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các

loài của nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus

lactis (hình 1- phần phụ lục)

So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài

đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 và L19 có mức tương đồng 99,7-100 %

với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 có mức tương đồng 99,9 với Enterococcus lactis (bảng 6)

Bảng 6 Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất

Chủng Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất

2-9 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus

paraplantarum (99,8%)

2-10 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus

paraplantarum (99,9%)

3-5 Lactobacillus pentosus (99,8%), Lactobacillus plantarum (99,7%), Lactobacillus

paraplantarum (99,7%)

4-14 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus

paraplantarum (99,8%)

8-10 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus

paraplantarum (99,9%)