Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật lên men lactic để tạo chất cấy vi sinh vật (inoculants) dùng trong chế biến, bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN LACTIC ĐỂ TẠO CHẤT CẤY VI SINH VẬT (INOCULANTS) DÙNG TRONG CHẾ BIẾN, BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI Bùi Thị Thu Huyền, Trần Quốc Việt2 1Ninh Thị Len Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, Viện Vi sinh vật CNSH Đại Bộ môn Dinh dưỡng, TACN Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi học Quốc Gia Hà Nội; Tóm tắt Từ nguồn khác tự nhiên, 134 chủng vi khuẩn lactic phân lập có 131 chủng vi khuẩn đồng hình chủng dị hình Các chủng tuyển chọn cách thử hoạt tính catalaza, nhuộm Gram, khả sinh axit lactic, kháng vi khuẩn kiểm định, enzyme ngoại bào… Tám chủng có hoạt tính sinh học cao 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17, L01 L19 lựa chọn để định danh Kết hợp phương pháp sinh lý, sinh hóa (lên men nguồn đường, khả di động, dải nhiệt độ pH thích hợp cho sinh trưởng…) sinh học phân tử (giải trình tự rADN 16S) xếp chủng L19 2-9 thuộc loài L pentosus; chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L plantarum chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis Các chủng lựa chọn chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh sử dụng phổ biến chế phẩm probiotic Đặt vấn đề Từ thời cổ đại, người biết sử dụng vi sinh vật (VSV) để chế biến bảo quản thực phẩm, phải đến nửa cuối kỷ 19, việc chế biến thức ăn xanh theo phương pháp ủ chua dựa bắt đầu phát triển nước châu Âu (Mc Donald, 1991) Đến nay, kỹ thuật ủ chua thức ăn xanh phụ phẩm nông nghiệp trở nên phổ biến hầu giới Mặc dù kỹ thuật cổ điển dựa sở lên men VSV, điều khiển trình lên men để nâng cao hiệu chế biến, bảo quản, giảm tối đa thất thoát, thối, hỏng, nâng cao hiệu sử dụng thức ăn suất vật nuôi làm việc khó Để khắc phục điều đó, nhiều chất bổ trợ truyền thống loại nguyên liệu giầu nguồn đường dễ lên men (rỉ mật, bột sắn, cám gạo…vv) thường sử dụng để thúc đẩy trình lên men VSV (Sadahiro Ohmono, 2002) Tuy nhiên, hiệu sử dụng chất bổ trợ khác nhau, phụ thuộc vào chất vật liệu ủ, thời gian, nhiệt độ hỗn hợp ủ vv (Mc Donald, 1991) Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, sử dụng chất cấy vi sinh vật (Bacterial Inoculants) chất bổ trợ sinh học tạo bước ngoặt công nghệ chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp nhiều nước giới (Sadahiro Ohmono, 2002; Machin, 2005) Theo Weinberg ctv (2007), sử dụng VSV lactic chất VSV nâng cao rõ rệt hiệu chế biến bảo quản thân ngô, làm tăng khả ăn vào tăng suất sữa bị Các chất cấy VSV khơng thúc đẩy nhanh trình lên men vi khuẩn lactic hỗn hợp ủ thông qua hiệu sản sinh axit lactic, làm giảm pH, tạo bacterioxin ức chế vi khuẩn gây thối, mà chúng cịn có tác dụng vi sinh vật probiotic, làm thay đổi đáng kể hệ vi sinh vật cỏ lồi nhai lại theo hướng có lợi cho vật chủ (Wallace ctv, 1993; Nocek ctv, 2006) Nội dung nghiên cứu thuộc đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu sử dụng thức ăn thô xanh, phế phụ phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” thực nhằm phân lập, tuyển chọn, xác định đặc điểm phân loại, đặc tính sinh lý, sinh hố số chủng vi khuẩn lên men lactic phục vụ cho việc sản xuất chất cấy vi sinh vật (Innocunants) Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mẫu cỏ voi, thân ngô sau thu bắp ủ chua, bã dứa - Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà - Các hóa chất ni cấy vi sinh vật, định tính, định lượng phân loại sử dụng hãng Merck, Sigma, Wako… 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, phân loại định danh vi khuẩn lactic nguồn sản xuất chất cấy VSV 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic - Mẫu pha loãng 10-3 10-5, lấy 0,05 ml gạt môi trường MRS, nuôi cấy nhiệt độ 30oC Sau 48 quan sát hình thái khuẩn lạc đĩa kính lúp, chọn khuẩn lạc có vịng bao quanh Các chủng sau khiết cấy truyền ống thạch nghiêng để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo, đồng thời chủng bảo quản lạnh sâu - 800 C nhằm giữ giống thời gian dài - Các chủng vi khuẩn phân lập thử khả sinh catalaza (bằng cách nhỏ giọt 3% H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn Nếu dương tính sủi bọt Vi khuẩn lactic phải có catalaza (-)) Các chủng có catalaza âm tính nhuộm Gram chủng Vi khuẩn Gram dương xác định khả lên men đồng hình (Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm mơi trường MRS dịch thể có chứa ống Durham, để 1-3 ngày Nếu khơng sinh khí CO2 ống Durham lên men đồng hình) khả kháng vi khuẩn kiểm định Các phương pháp định tính định lượng - Định lượng axit phương pháp chuẩn độ Therner (Emanuel et al., 2005) - Xác định nồng độ axit lactic (%) sắc ký lỏng cao áp - Xác định khả kháng khuẩn sinh enzyme ngoại bào phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Xác định khả sinh trưởng mật độ quang (OD) (đo dịch nuôi cấy tế bào máy quang phổ bước sóng 600nm) 2.3.2 Phương pháp phân loại 2.3.2.1 Xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992) - Xác định khả lên men sinh axit từ loại đường: Cấy vi khuẩn vào môi trường dịch thể MRS (có chứa bromocresol purple làm chất thị pH) chứa loại đường khác (1%) thay cho glucoza Sau 2-3 ngày, vi khuẩn phát triển, sinh axit từ nguồn đường dịch ni cấy chuyển sang màu vàng - Xác định khả di động: Môi trường MRS dịch thể bổ sung 0.15% thạch Cấy đứng, để 2-3 ngày 300C, vi khuẩn mọc loang ra, đục mơi trường chủng vi khuẩn có khả di động - Khả làm đông tụ sữa: Môi trường chứa 10% skim milk bổ sung bromocresol purple thị pH Cấy vi khuẩn, để 300C 5-7 ngày Chủng có khả đơng tụ sữa mơi trường biến đổi từ tím thành màu vàng nhạt, sữa đông lại - Ảnh hưởng nồng độ NaCl môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng sinh axit chủng vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường dịch thể (pH = 6) có nồng độ muối 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8%, lắc 220 vòng/phút 30oC ngày - Đánh giá khả năng chịu nhiệt: Các chủng vi khuẩn ni mơi trường dịch thể có pH ổn định (pH =7.0), máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với dải nhiệt độ khác 20, 25, 30, 37, 450C - Đánh giá khả sinh trưởng mơi trường có độ pH khác nhau: Tương tự trên, chủng vi khuẩn nuôi cấy mơi trường dịch thể có độ pH khác (3, 4, 5, 6, 7, 9), máy lắc ổn nhiệt (37oC) 2.3.2.2 Phân loại dựa giải trình tự rADN 16S - Xác định trình tự rADN 16S chủng vi khuẩn theo phương pháp Sakiyama cs (2009) - Đọc trình tự ADN Sản phẩm PCR tinh xác định trình tự máy đọc trình tự tự động 3100 Avant Kết đọc trình tự xử lý phần mềm Clustal W 1.83 Các trình tự so sánh với trật tự ADNr 16S loài xác định ngân hàng gen, để xác định đến tên loài Kết thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình 3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh axit lên men đồng hình Với mục đích phân lập vi khuẩn lên men lactic đồng hình mạnh, sử dụng nguồn mẫu cỏ voi, thân ngô sau thu bắp ủ chua, bã dứa làm đối tượng cho nghiên cứu, 134 chủng vi sinh vật phân lập Tất chủng có Catalaza âm tính vi khuẩn Gram dương Trong xác định 131 chủng lên men đồng hình Trong số chủng lên men dị hình, chủng L19 có khả sinh axit cao (dựa vào vịng CaCO3) lựa chọn cho nghiên cứu 132 chủng nuôi cấy lắc 200 vịng/phút/370C, sau ngày quan sát thấy có 70 chủng phát triển nhiệt độ 370C Các chủng xác định hàm lượng axit sinh dịch ni phương pháp chuẩn độ Therner Sở dĩ có điều q trình ủ chua thức ăn cho động vật nhai lại, nhiệt độ thường tăng cao, nên chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động phải có khả chịu nhiệt Kết đánh giá khả sản sinh axit lactic thể bảng Bảng Khả sản sinh axit vi khuẩn TT Ký hiệu Hàm lượng TT chủng axit (g/l) Ký hiệu Hàm lượng TT chủng axit (g/l) Ký hiệu Hàm lượng chủng axit (g/l) 1-1 21 25 4-7 17 48 7-11 13 1-2 26 4-10 21 49 7-13 14 1-9 11 27 4-12 18 50 7-14 15 1-12 28 4-13 18 51 8-3 18 1-14 15 29 4-14 21 52 8-4 2-2 19 30 5-3 15 53 8-5 18 2-5 21 31 5-5 16 54 8-8 12 2-9 20 32 5-6 18 55 8-10 20 2-10 21 33 5-10 17 56 8-11 16 10 2-11 19 34 5-11 15 57 9-1 19 11 2-12 19 35 5-14-1 19 58 9-2 16 12 2-13 20 36 5-16 15 59 9-3-1 17 13 2-14 19 37 6-2 11 60 9-4 21 14 3-3 19 38 6-3 15 61 9-6 20 15 3-4 19 39 6a 15 62 9-7 19 16 3-5 21 40 6b 17 63 9-8 16 17 3-8 21 41 6d-2 17 64 9-10 17 18 3-9 21 42 6e 16 65 9-11 18 19 3-10 21 43 6g 19 66 9-13-1 14 20 3-12 21 44 6h 18 67 9-14 18 21 3-14 20 45 7-1 16 68 9-17 21 22 4-2 20 46 7-3 17 69 L01 20 23 4-3 19 47 7-4 17 70 L19 21 24 4-6 21 Trong số 70 chủng nghiên cứu, chọn 19 chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ 37 C, có khả sinh axit cao (20 - 21 g/l) đánh giá sản sinh axit lactic thiết bị sắc ký lỏng cao áp khả kháng khuẩn dịch ni nhằm tìm chủng sinh axit lactic đồng hình cao lại có khả kháng vi khuẩn gây bệnh Kết trình bày bảng Bảng Khả sản sinh axit lactic kháng khuẩn dịch nuôi vi khuẩn Ký hiệu Nồng độ (%) Kích thước vịng kháng khuẩn (D-d, mm) chủng axit lactic Shigella sp Salmonella sp E coli M luteus 1-1 17.3 18 30 26 20 2-5 19.5 34 34 20 14 2-9 21 20 30 26 14 2-10 20.8 28 34 24 18 2-13 16.8 10 34 28 18 3-5 19.6 10 30 26 14 3-8 19.6 16 20 30 16 3-9 18.4 12 22 28 14 3-10 19.5 22 34 30 18 3-12 19.4 20 34 28 16 4-6 15.3 30 34 28 20 4-10 18 20 34 30 20 4-14 19.8 24 34 28 18 8-10 19.6 10 30 20 18 9-4 18.6 28 34 30 20 9-6 18.8 22 30 30 20 9-17 19.8 20 30 30 20 L01 19.6 20 34 26 14 L19 19.8 20 34 20 24 Kết cho thấy hàm lượng axit lactic chủng vi khuẩn nghiên cứu sinh không chênh lệch nhiều, thấp chủng 4-6 (15,3%) cao chủng 2-9 Mặt khác kết bảng cho thấy 19 chủng có khả kháng vi sinh vật kiểm định, phổ kháng khuẩn rộng (kháng vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus Gram âm E.coli, Salmonella Shigella) thể qua vòng kháng khuẩn cao Kết phù hợp với kết nghiên cứu Mai Thị Đàm Linh cs (2008) chủng lactic Lo, L1, L2 Dr1 Mourad Kacem cs (2005) chủng Lactobacillus plantarum OL2, OL9, OL15 Enterococcus feacalis OL20, chủng có phổ kháng khuẩn rộng Từ kết bảng 2, chọn chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 414, 8-10; 9-17; L10; L19) chủng có hoạt tính cao đại diện cho mẫu phân lập (cỏ Nghệ An, cỏ Mộc Châu, cỏ Ba vì, Ngơ Mộc châu, dứa…) để phân loại nghiên cứu đặc điểm sinh học 3.1.2 Xác định khả đối kháng chủng lựa chọn Tám chủng lựa chọn nuôi môi trường MRS theo phương pháp cấy vạch tiếp xúc với chủng khác Sau ngày nhiệt độ 37oC, tất mẫu sinh trưởng tốt Điều cho thấy chủng lựa chọn không kháng 3.1.3 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng lựa chọn Tám chủng lựa chọn ni mơi trường MRS có chứa chất tinh bột, CMC, pectin, protein xylan Sau ngày nhiệt độ 37oC, xác định hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán thạch Khả phân giải chất đánh giá qua vòng phân giải chất D-d, mm Bảng Khả sinh enzyme ngoại bào phân giải chất vi khuẩn Ký hiệu Hoạt tính enzym (D-d, mm) chủng Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase 2-9 12 8 13 2-10 10 0 12 3-5 10 11 11 4-14 10 10 8-10 12 9-17 13 11 12 13 L01 0 0 L19 13 16 18 17 17 Kết bảng cho thấy trừ chủng L01, chủng nghiên cứu có khả sinh enzym ngoại bào, vòng phân giải chất từ 5-18 (mm) Trong chủng sinh enzyme xylanase cao Đặc biệt chủng L19 – chủng lên men dị hình – phân giải chất mạnh nhất, mạnh chủng lên men đồng hình Như vậy, đặc điểm tốt chủng lựa chọn làm chất cấy q trình ủ chua, ngồi khả sinh axit cao, kháng khuẩn chủng nghiên cứu có khả sinh enzyme ngoại bào phân giải chất đống ủ 3.2 Phân loại chủng tuyển chọn 3.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn Việc phân loại chủng vi khuẩn tiến hành vào kết hợp kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố phân tích, giải trình tự rADN 16S Bảng trình bày đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố chủng vi khuẩn nghiên cứu Tất 08 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính, khơng có khả di động hình thái tế bào có dạng: hình que hình cầu Các chủng phân lập sinh trưởng mơi trường ni cấy có pH - 8, nhiệt độ nuôi cấy 25 – 370C, nồng độ NaCl - %, nhiên sinh trưởng mức độ khác Bảng Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố chủng vi khuẩn Các đặc tính Chủng vi khuẩn 2-9 2-10 3-5 + + + que que que - Vi khuẩn Gram Hình dạng tế bào Hoạt tính Catalaza Khả di động Khả lên men tạo axit từ nguồn hyđratcacbon: D-glucoza + L-arabinoza + D-fructoza Galactoza Glycerol Maltoza D-mannitol D-lactoza D-raffinoza D-riboza Saccaroza D-sorbitol Trehaloza D-xyloza Lên men đồng hình Sinh trưởng pH 4-8 Sinh trưởng NaCl (%) 0-6 10 4-14 + que - 8-10 + que - 9-17 + que - L01 + cầu - L19 + que - + + + + + - + + - + + + + + + (yếu) + + + + + + (yếu) + + - + + (yếu) + + - + + + - + + (yếu) + + - + + + + (yếu) + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + (yếu) + - + + + + - - - + + (yếu) + - + + + + + + + (yếu) + + (yếu) + + (yếu) + + + + (yếu) + + + (yếu) + + + (rất yếu) + + (rất yếu) + (rất yếu) + + (rất yếu) + (rất yếu) + + (rất yếu) + (rất yếu) + + (rất yếu) + (rất yếu) + + (rất yếu) + (rất yếu) + + (rất yếu) +( yếu) + +( yếu) +(rất yếu) + +(rất yếu) + + (yếu) + (rất yếu) + + (yếu) + (rất yếu) + + (yếu) + (rất yếu) + + (yếu) - + + (yếu) + (rất yếu) + + (yếu) + (rất yếu) + + (yếu) - + + (yếu) - + + + (yếu) + + + + (yếu) + + + + + + (yếu) - Các đặc tính Chủng vi khuẩn 2-9 2-10 3-5 Nhiệt độ sinh trưởng (0C) 20 25 - 37 45 Khả đông tụ sữa 4-14 8-10 9-17 L01 L19 + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) - + (rất yếu) + + (yếu) + + (rất yếu) + + (yếu) + Chú thích: (+) dương tính; (-) âm tính 3.2.2 Xác định trình tự 16S rADN xây dựng phân loại Các chủng vi khuẩn tuyển chọn, thu sinh khối tế bào tách ADN genom Đoạn gen mã cho 16S rARN khuyếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F 1525R, sau tinh dùng làm khuôn phản ứng đọc trình tự với mồi xi mồi ngược Kết đọc trình tự (phụ lục) xử lý phần mềm Clustal X so sánh với ngân hàng liệu GeneBank công cụ Blast Search để xác định đến tên lồi Trình tự 16S rADN chủng nghiên cứu xác định Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự ADNr 16S 1400 bp chủng nghiên cứu với loài gần gũi với lồi biết thuộc chi Enterococcus, Lactobacillus Pediococcus acidilactici sử dụng làm nhóm ngồi Quan sát phả hệ, có chủng nghiên cứu nằm vị trí với lồi nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 tạo nhánh khác vị trí với Enterococcus lactis (hình 1- phần phụ lục) So sánh trình tự ADNr 16S chủng nghiên cứu với chủng chuẩn loài biết cho thấy: chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 L19 có mức tương đồng 99,7-100 % với lồi nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 có mức tương đồng 99,9 với Enterococcus lactis (bảng 6) Bảng Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần Chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus paraplantarum (99,8%) Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus paraplantarum (99,9%) Lactobacillus pentosus (99,8%), Lactobacillus plantarum (99,7%), Lactobacillus paraplantarum (99,7%) Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus paraplantarum (99,8%) Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus paraplantarum (99,9%) 9-17 L01 L19 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus paraplantarum (99,9%) Enterococcus lactis (99,9 %) Lactobacillus pentosus (100%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus paraplantarum (99,9%) Kết cho thấy chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 L19 có độ tương đồng gen 16S rRNA 99.7%-100% so với gen 16S rRNA lồi thuộc nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); Như khó kết luận chúng thuộc xác lồi dựa trình tự gen 16S rRNA Đối với L plantarum, L paraplantarum L pentosus, để phân biệt loài cần sử dụng số kỹ thuật phân tử khác lai ADN-ADN (Zanoni et al., 1987; Curk et al., 1996), lai với gen đặc hiệu pyrDEF (Bringel et al., 1996), hay phân tích trình tự gen đặc hiệu recA (Torriani et al., 2001) Do điều kiện không cho phép, chưa thể tiến hành phân loại chủng dựa vào gen đặc hiệu Tuy nhiên theo số nghiên cứu trước đây, L pentosus thường lên men xyloza L plantarum L paraplantarum không lên men nguồn cacbon (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni et al., 1987) Khác với L plantarum L paraplantarum, L pentosus thường lên men glycerol (Zanoni et al., 1987; Bringel et al., 1996; Curk et al., 1996) Khác với L plantarum, L paraplantarum thường khơng đồng hóa arabinose sorbitol (Curk et al., 1996) Kết hợp đặc điểm sinh học phân tử đặc điểm sinh lý, sinh hố xếp chủng L19 2-9 thuộc loài L pentosus Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L plantarum Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis Các chủng lựa chọn chủng vi sinh vật an tồn, khơng gây bệnh sử dụng phổ biến chế phẩm probiotic Đây chủng nằm danh sách loài vi sinh vật AFCO (American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng chế biến thức ăn Kết luận - Từ nguồn cỏ voi, thân ngô sau thu bắp ủ chua, phân lập 134 chủng vi khuẩn Dựa vào khả lên men đồng hình, khả chịu nhiệt, khả sinh axit lactic, bacteriocin enzyme ngoại bào phân giải chất, chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 4-14, 8-10; 9-17; L10; L19) chọn cho nghiên cứu - Kết hợp đặc điểm sinh học phân tử đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố xếp chủng L19 2-9 thuộc loài L pentosus Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L plantarum Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis Các chủng lựa chọn chủng vi sinh vật an tồn, khơng gây bệnh sử dụng phổ biến chế phẩm probiotic Tài liệu tham khảo Mai Thị Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh Nguyễn Thị Giang 2008 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập địa bàn thành phố Hà nội Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24, pp 221 – 226 2 10 11 12 13 14 15 16 Bringel, F., Curk, M C & Hubert, J C 1996 Characterization of lactobacilli by Southern-type hybridization with a Lactobacillus plantarum pyrDFE probe Int J Syst Bacteriol 46: 588–594 Curk M.C., Hubert J.C & Bringel F 1996 Lactobacillus paraplantarum sp nov., a new species related to Lactobacillus plantarum Int J Syst Bacteriol 46: 595–598 Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P., Gheorghe, C 2005 Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders African Journal of Biotechnology 4(5) 403-408 Kandler O & Weiss N 1986 Regular, nonsporing Gram-positive rods In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol 2, pp 1208–1234 Edited by P H A Sneath, N S Mair, M E Sharpe & J G Holt Baltimore: Williams & Wilkins Kozaki M., Uchimura T & Okada S 1992 Experimental manual of lactic acid bacteria Asakurasyoten, Tokyo, Japan McDonald P, Henderson N, Heron S 1991 The Biochemistry of Silage, Second Edition Chalcombe Publications, Marlow, Buckinghamshire, England Machin D H 2005 The potential use of tropical silage for livestock production with special reference to smallholders FAO Electronic Conference on Tropical Silage Mourad Kacem, Halima Zadi-Karam and Nour-Eddine Karam 2005 Isolation of lactic acid bacteria from naturally fermented Algerian olives J.King Saud Univ., Vol 18, Science (2), pp 89-98 Nocek, J E., andW P Kautz 2006 Direct-fed microbial supplementation on ruminal digestion, health and performance of pre- and postpartum dairy cattle J Dairy Sci 89:260–266 Sadahiro Ohomono, Osamu TANAKA, Hiroko K KITAMOTO and Yimin CAI 2002 Silage and and Micobial Performance, Old Story but New Problems Review JARQ 36 (2) 59-71 (2002) http://www Jrcas.affrc.go.jp Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009) Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554 Torriani S., Felis G.E & Dellaglio F 2001 Differentiation of Lactobacillus plantarum, L pentosus, and L paraplantarum by recA sene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers Appl Environ Microbiol 67: 3450-3454 Wallace, R J., and C T Newbold 1993 Rumen fermentation and its Manipulation: The development of yeast cultures as feed additives Pages 173–192 in Biotechnology in the Feed Industry Proc Alltech’s Ninth Annu Symp Alltech Tech Publ., Nicholasville, KY Weinberg, Z G., O Shatz, Y Chen, E Yosef, M Nikbahat, D Ben-Ghedalia, and J Miron 2007 Effect of Lactic Acid Bacteria Inoculants on In Vitro Digestibility of Wheat and Corn Silages Dairy Sci 90:4754–4762 Zanoni, P., Farrow, J A E., Phillips, B A & Collins, M D (1987) Lactobacillus pentosus (Fred, Petersen, and Anderson) sp nov., nom rev Int J Syst Bacteriol 37: 339-341 Phụ lục Môi trường nuôi cấy vi sinh 1.1 Môi trường MRS (g/l) Glucoza-20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0; CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28; Tween 80- ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 7,0; khử trùng 121oC/15 phút Môi trường dịch thể bỏ thạch CaCO3 1.2 Môi trường thạch thường (g/l): nuôi vi sinh vật kiểm định Cao thịt - 2,0; Pepton- 5,0; NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1000ml (pH= 7,0); khử trùng 121oC/15 phút Cây phân loại chủng nghiên cứu 0.02 Enterococcus faecalis_AB012212 Enterococcus gallinarum_ AF039900 100 Enterococcus pseudoavium_ AF061002 54 Enterococcus mundtii_AF061013 64 Enterococcus hirae_Y17302 98 Enterococcus durans_AJ276354 Enterococcus faecium_AJ301830 82 L01 94 86 Enterococcus lactis_DQ255948 56 63 72 75 72 56 62 53 52 55 54 100 2-10 8-10 3-5 2-9 9-17 4-14 Lactobacillus paraplantarum_AJ306297 66 100 Lactobacillus plantarum_AJ965482 64 L19 Lactobacillus pentosus_D79211 Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556 Lactobacillus versmoldensis_AJ496791 Lactobacillus malefermentans_AM113783 Lactobacillus parabuchneri_AB205056 Lactobacillus acidifarinae_AJ632158 Lactobacillus brevis_M58810 Pediococcus acidilactici_ EF059987 Hình Vị trí phân loại chủng nghiên cứu lồi có quan hệ họ hàng gần ... dụng thức ăn thô xanh, phế phụ phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại? ?? thực nhằm phân lập, tuyển chọn, xác định đặc điểm phân loại, đặc tính sinh lý, sinh hoá số chủng vi khuẩn lên men lactic. .. để xác định đến tên loài Kết thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình 3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh axit lên men đồng hình Với mục đích phân lập vi khuẩn lên men. .. Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà - Các hóa chất ni cấy vi sinh vật,