phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn azospirillum trên cây lúa

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN VĂN CHIÊU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP. TRÊN CÂY LÚA TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT Mã số: 62-42-01-07 CẦN THƠ - 2012 1 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Năng suất lúa chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như thời tiết, loại đất, khí hậu và các chất dinh dưỡng khác nhau trong đó quan trọng nhất là chất đạm, để tăng năng suất nông dân phải bón thêm phân đạm vô cơ cho cây lúa. Hậu quả là đất bị chai cứng, lượng phân đạm thừa gây ô nhiễm môi trường không khí và nguồn nước, hơn nữa việc nhập khẩu phân hóa học tốn nhiều ngoại tệ. Để nền nông nghiệp phát triển bền vững, việc tiến hành phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn Azospirillum sp. có khả năng cố định đạm trên cây lúa tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) ứng dụng cho việc trồng lúa tại tỉnh Bạc Liêu là việc làm cần thiết. 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và bước đầu nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum sp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR. Trắc nghiệm khả năng hoạt động của các dòng vi khuẩn đến sự sinh trưởng và phát triển cây lúa ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng tại Bạc Liêu. 1.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum sp. từ cây lúa dài ngày, lúa ngắn ngày và lúa hoang thu tại các tỉnh vùng ĐBSCL bằng kỹ thuật PCR. - Khảo sát sự tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn Azospirillum sp.ở điều kiện phòng thí nghiệm. - Khảo sát sự ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn Azospirillum sp. lên cây lúa Một bụi đỏ ở điều kiện phòng thí nghiệm. - Khảo sát sự ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn Azospirillum sp. lên sự sinh trưởng và phát triển cây lúa OM 4655 và lúa Một bụi đỏ ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 2 1.4 Ý nghĩa của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án bổ sung kiến thức về cố định đạm của loài vi khuẩn Azospirillum sp. hội sinh với cây lúa trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây cũng là cơ sở để khuyến cáo cho nông dân ứng dụng bón phân sinh học trong canh tác nông nghiệp nhằm tăng năng suất cây lúa đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Các số liệu của luận án có thể sử dụng để bổ sung vào giáo trình giảng dạy, là tiền đề cho các bước nghiên cứu sâu hơn trước khi khuyến cáo ứng dụng vi khuẩn Azospirillium sp. trong canh tác lúa ở vùng ĐBSCL. 1.5 Điểm mới của luận án Đóng góp mới của Luận án đã phân lập được ba dòng vi khuẩn nội sinh “bản địa” từ cây lúa vùng ĐBSCL là: Azospirillum sp1(R7b1); Azospirillum sp2(R8b2) và Azospirillum sp3(R29b1). Các dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp kích thích tố IAA mà không cần bổ sung chất dẫn xuất Tryptophan vào môi trường nuôi. Ở điều kiện thực tiễn đồng ruộng, khi xử lý dòng vi khuẩn Azospirillum sp3(R29b1) cho lúa Một bụi đỏ không bón phân đạm vô cơ đã giúp năng suất tăng 0,2 tấn/ha so với đối chứng. Hơn thế nữa, khi xử lý dòng vi khuẩn này cho lúa OM 4655 không bón phân đạm vô cơ thì năng suất tăng lên đến 0,4 tấn/ha so với đối chứng. Kết quả của luận án cho thấy ba dòng vi khuẩn Azospirillum sp1(R7b1); Azospirillum sp2(R8b2) và Azospirillum sp3(R29b1) là những dòng vi khuẩn nội sinh triễn vọng có thể ứng dụng vào canh tác lúa tại tỉnh Bạc Liêu. 3 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Phân loại vi khuẩn Azospirillum sp. Vi khuẩn Azospirillum sp. thuộc lớp: Alphaproteobacteria; Bộ: Rhodospirillales; Họ: Rhodospirillaceae; Giống : Azospirillum. Vi khuẩn Azospirillum sp. có dạng hình que thẳng hay hơi cong, kích thước tế bào (0,6- 1,7 x 2,1 - 3,8mm), thuộc Gram âm hay Gram thay đổi, có thể chuyển động trong môi trường lỏng nhờ có 1 tiên mao ở một đầu tế bào, trong môi trường đặc nhiệt độ 30 0 C nhiều tiên mao bên có thể hình thành. Vi khuẩn sinh trưởng trong môi trường không có chứa đạm ở điều kiện vi hiếu khí, hoặc môi trường có nguồn đạm là ammonium hay muối glutamate, khi môi trường có chứa nồng độ đạm cao thì enzyme nitrogenase sẽ bị ức chế (Shrestha và Maskey, 2005), một số loài Azospirillum sp. cần có Biotin để phát triển, vi khuẩn sống tự do trong đất hay sống hội sinh với rễ, thân, lá và hạt một số loại ngũ cốc, rau, trái cây, cây họ đậu, cây cho củ. 2.2 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Azospirillum sp. Azospirillum sp. lần đầu tiên được Beijerinck (1925) phân lập trên đất cát ở Hà Lan với tên Spirillum lipoferum. Loài vi khuẩn này cũng được phân lập từ đất (Schorder, 1932), từ loài rong biển khô ở Indonesia và trên một số cây trồng nhiệt đới (Becking, 1982). Các nhà khoa học đã phát hiện Azospirillum sp. xuất hiện khắp nơi trên thế giới và họ đã phân lập thành công Azospirillum sp. trong rễ của đại bộ phận các loài cỏ dại, cỏ trồng, ngũ cốc, và cây họ đậu trên các vùng đất nhiệt đới và bán nhiệt đới (Hill, 1992; Horemans và ctv., 1986; Ladha và ctv., 1987; Li và Castellano, 1987). Một số loài vi khuẩn Azospirillium sp. đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, ngoài khả năng cố định đạm cho cây 4 trồng, Azospirillum sp. còn có thể tiết ra các kích thích tố tăng trưởng như: IAA, IBA, ABA và Cytokynins (Bashan và Levanony, 1990), những kích thích tố này làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích và số lượng rễ, nên giúp cây có khả năng hấp thu khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây trồng (Okon và Kapulnik, 1986). Những thí nghiệm ứng dụng Azospirillum sp. đã làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23-63% (Paredes- Cardona và ctv., 1988). Những thử nghiệm bước đầu trên cây bắp trồng ở Cù Lao Dung, Sóc Trăng, Việt Nam cho thấy Azospirillum lipoferum HA28 có thể giúp nông dân tiết kiệm 90N/ha và giúp gia tăng năng suất bắp (Nguyễn Thị Phương Tâm, 2006). Ngoài ra vi khuẩn Azospirillum sp. còn làm tăng trọng lượng khô của cây, tăng đạm tổng số ở chồi và hạt, tăng tổng số chồi hữu hiệu, giúp cây lúa trổ bông sớm hơn, làm tăng số bông và số hạt trên bông, tăng trọng lượng hạt, tăng chiều cao cây, tăng kích thước lá và tỉ lệ hạt nảy mầm cao hơn (Merten và Hess, 1984; Warembourg và ctv., 1987), đặc biệt năng suất cây trồng có thể tăng từ 10% đến 20% so với cây đối chứng (Bashan và Hanna Levanony, 1990). Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện được các nhóm vi khuẩn Azospirillum sp. có khả năng cố định đạm cho cây lúa và giúp gia tăng năng suất lúa từ 15% đến 54% (Favilli và ctv., 1987; Osmar và ctv., 1989). Một số nước trên thế giới đã sử dụng phân bón sinh học thành công như: Hoa Kỳ, Ấn Độ, Thái Lan, Israel, Ai Cập, Ý, Pháp, Brazil, Mexico, Uruguay, Argentina, Việt Nam,… Tại Ai Cập, khi xử lý giống Azospirillum brasilense N040 làm gia tăng sản lượng lúa từ 15% đến 20% ở đồng bằng sông Nile (Osmar và ctv., 1989). 5 Tại Pháp, khi sử dụng Azogreen TM để xử lý cho bắp làm tăng năng suất 100% được thực hiện ở trạm nghiên cứu Agbasar, Châu Phi (Fages, 1994). Tại Mexico, nhóm nghiên cứu ở Đại học Puebla đã xử lý vi khuẩn cho lúa mì đã làm tăng năng suất từ 23% đến 63% (1986) và từ 24% đến 43% (1987) (Caballero-Mellado và ctv., 1993; Paredes-Cardona và ctv., 1988). Tại Uruguay, những thí nghiệm trên ruộng lúa miến cho thấy khi có xử lý vi khuẩn Azospirillum brasilense cd vào hạt lúa (1.10 7 CFU/hạt) đã làm tăng năng suất từ 10% đến 15% (Okon và Labandera- Gonzalez, 1994). Tại Argentina, nhiều thí nghiệm cho thấy khi xử lý vi khuẩn Azospirillum brasilense làm tăng năng suất lúa mì (Triticum aestivum cv. Marcos Juarez INTA) lên 33% so với đối chứng (Barrios và ctv., 1986). 6 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu - Thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm: Bảng 3.1 Một số thiết bị, máy móc phục vụ trong nghiên cứu Tên thiết bị Q uố c gi a Công dụng Máy ly tâm Eppendorf -5417 Đ ức Lắng mẫu Máy lắc Đ ức Nuôi cấy sinh khối VK Tủ ủ Vi sinh vật Ph áp Ủ VK Tủ cấy VSV Incucell 111 Đ ức Cấy VK Lò vi sóng Panasinic T há i La n Đun môi trường Nồi khử trùng Pbi- international Ý Khử trùng môi trường Kính hiển vi N hậ Quan sát VK 7 t Cân điện tử Sartorius Đ ức Cân mẫu Máy PCR Perkin Elmer PE 9700 H oa K ỳ Thực hiện phản ứng PCR Máy Beckman DU- 600 Đ ức Đo nồng độ DNA VK Máy Bio-Rad UV 2000 H oa K ỳ Chụp hình gel điện di Bộ điện di một chiều H oa K ỳ Điện di gel Tủ lạnh Akira Vi ệt N a m Trữ mẫu Máy ảnh SONY 7.2 Megapixels N hậ t Chụp hình mẫu lúa Bộ micropipet Bio- Rad, Kính lúp, lame, lammelle, que cấy, dao kéo, kẹp, các loại ống tuýp 1,5ml, 2ml… Vi ệt N a m Thực hiện thí nghiệm 8 - Giống lúa: Lúa cao sản (OM 4655); giống lúa mùa (Một bụi đỏ); Cây lúa ngắn ngày; lúa dài ngày (lúa mùa); lúa hoang thu tại các tỉnh ĐBSCL. - Địa điểm và thời gian thí nghiệm Bảng 3.3 Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm TT Nội dung Thời gian Địa điểm 01 Thu mẫu lúa Tháng 12/2005- 10/2006 Các tỉnh vùng ĐBSCL 02 Phân lập, nhận diện vi khuẩn Tháng 3/2006- 12/2006 Phòng thí nghiệm Viện NC&PTCNSH - Đại học Cần Thơ 03 Khảo sát sự tổng hợp IAA của vi khuẩn Tháng 01/2007- 02/2007 Phòng thí nghiệm Viện NC&PTCNSH - Đại học Cần Thơ 04 Khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên ST cây lúa Một bụi đỏ ở điều kiện phòng thí nghiệm Tháng 3/2007 -4/2007 Phòng thí nghiệm Viện NC&PTCNSH - Đại học Cần Thơ 05 Khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên ST&PT cây lúa OM 4655 và Một bụi đỏ ở điều kiện nhà lưới Tháng 5/2007 -9/2007 Trung tâm giống Nông nghiệp-Thủy sản tỉnh Bạc Liêu. 06 Khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên ST&PT cây lúa OM 4655 và Một bụi đỏ ở điều kiện ngoài đồng Tháng 10/2007 - 02/2008 Trung tâm giống Nông nghiệp-Thủy sản tỉnh Bạc Liêu. + Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm VSV và Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện NC&PTCNSH, Trường Đại học Cần Thơ. 9 + Thí nghiệm trồng lúa trong nhà lưới và ngoài đồng tại Trung tâm giống nông nghiệp tỉnh Bạc Liêu, địa chỉ Km số 2195- Quốc lộ IA, ấp An Khoa, Xã Vĩnh Mỹ B, huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu. 3.2 Phương pháp nghiên cứu - Thu và xử lý mẫu lúa thu tại các tỉnh vùng ĐBSCL + Tiến hành thu mẫu các cây lúa dài ngày, ngắn ngày và cây lúa hoang tại các tỉnh vùng ĐBSCL. + Phân lập và làm thuẩn mẫu các dòng vi khuẩn. + Chiết suất DNA của vi khuẩn để thực hiện phản ứng PCR. + Điện di sản phẩm của phản ứng PCR và nhận diện các dòng vi khuẩn + Khảo sát sự tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn + Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Azospirillum sp. lên chiều dài rễ lúa trong phòng thí nghiệm. (Theo dõi: Chiều cao cây sau 7 ngày, dài rễ sau 7,14 và 28 ngày). + Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong nhà lưới (Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây; Số chồi/bụi ; Trọng lượng khô thân, lá; Trọng lượng khô rễ; Phân tích đạm tổng số trong thân và hạt ; Chiều dài bông; số hạt chắc/bông; số hạt lép/bông; Trọng lượng 1000hạt) + Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng ngoài đồng (Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây; Số chồi/bụi ; Trọng lượng khô thân, lá; Trọng lượng khô sễ ; Phân tích đạm tổng số trong thân và hạt ; Chiều dài bông; số hạt chắc/bông; số hạt lép/bông; Trọng lượng 1000hạt ; năng suất (tấn/ha)). + Sử dụng phương pháp phân tích Anova và Duncan test với phần mềm STATGRAPHICS 7.0 để xử lý các số liệu của Luận án. CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn [...]...10 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu lúa ngắn ngày, lúa dài ngày và lúa hoang Kết quả phân lập 71 mẫu lúa ngắn ngày, lúa dài ngày và lúa hoang (gồm 65 mẫu lúa trồng và 6 mẫu lúa hoang) thu được 12 dòng vi khuẩn nội sinh và đặt tên với các ký hiệu như sau: R7b1, R8b2, R29b1, RBL32, RBL35, RBL40n, RBL41a, RBL43n, RBL43t, RBL45, RBL54b và RBL56a Các dòng vi khuẩn này đều có chung tính... lý vi khuẩn dòng Azospirillum sp2(R8b2) đã tác động tăng chiều cao cây lúa cao hơn nghiệm thức đối chứng 4,8cm (21,59%) Các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn Azospirillum sp1(R7b1) và Azospirillum sp3(R29b1) chưa có tác động làm tăng chiều cao cây lúa 4.3 Ảnh hưởng của xử lý vi khuẩn lên cây lúa trồng trong nhà lưới 4.3.1 Ảnh hưởng của xử lý vi khuẩn lên cây lúa OM 4655 4.3.1.1 Ảnh hưởng của xử lý vi khuẩn. .. điểm phát hiện ra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập Phân lập 71 mẫu lúa thu được 12 dòng vi khuẩn tại 06 tỉnh và 01 thành phố (Bảng 4.1) Bảng 4.1 Địa điểm phát hiện ra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập TT Ký hiệu Giống lúa Địa điểm thu mẫu dòng VK 01 R7b1 OM.2718 Xã Vĩnh Phú Đông, Phước Long, tỉnh BLiêu 02 R8b2 OM.2717 Xã Long Thạnh, Vĩnh Lợi,tỉnh Bạc Liêu 03 R29b1 Lúa hoang Xã An Hoà,... KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận *Mười hai dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa hoang, lúa ngắn ngày và dài ngày thu tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, trong đó có ba dòng vi khuẩn được xác định bằng kỹ thuật PCR thuộc dòng vi khuẩn Azospirillium sp1(R7b1); Azospirillium sp2 (R8b2) và Azospirillium sp3(R29b1) * Cả ba dòng vi khuẩn thuộc loài vi khuẩn trên đều có khả năng tổng hợp ra kích thích... khô rễ lúa Một bụi đỏ một cách đáng kể 4.4.2.6 Ảnh hưởng của VK lên chiều cao cây lúa Một bụi đỏ lúc thu hoạch Chiều cao cây lúa chín của nghiệm thức không xử lý vi khuẩn có bón 100% phân đạm cao hơn chiều cao cây lúa ở nghiệm thức không xử lý vi khuẩn không bón đạm 9,7cm, khác biệt này có ý nghĩa thống kê Chiều cao 25 cây lúa ở nghiệm thức có xử lý vi khuẩn Azospirillum sp3(R29b1) không bón phân đạm... hưởng của VK lên số hạt lép/bông lúa MBĐ lúc thu hoạch Số hạt lúa lép ở nghiệm thức có bón 100% phân đạm không xử lý vi khuẩn cao hơn số hạt lúa lép của nghiệm thức không xử lý vi khuẩn không bón phân đạm 7,1 hạt Điều này cho thấy vi c bón lượng đạm cao cho cây lúa Một bụi đỏ trồng ngoài đồng sẽ làm gia tăng thêm số hạt lúa lép/bông lúa 4.4.2.10 Ảnh hưởng của VK lên trọng lượng 1000 hạt lúa Một bụi đỏ trồng... trường nuôi vi khuẩn Lượng IAA do các dòng này tạo ra cao hơn các dòng vi khuẩn đối chứng Trong đó dòng Azospirillum sp3(R29b1) sinh ra lượng IAA cao nhất (19,9 µg/ml) vào ngày thứ 4 so với hai dòng còn lại (Hình 4.7) Hình 4.7 Sự tổng hợp IAA của ba dòng vi khuẩn Azospirillum sp1(R7b1), Azospirillum sp2(R8b2) và Azospirillum sp3(R29b1) 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự sinh trưởng lúa Một bụi... Cần Thơ “Ảnh hưởng của Indole Acetic Acid do vi khuẩn Azospirillum tổng hợp lên sự phát triển rễ lúa trồng ở điều kiện nhà lưới” TÀI LIỆU THAM KHẢO Số 15b- 2010 28 TIẾNG VI T 1 Nguyễn Thị Phương Tâm, 2006 Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum trên cây bắp Luận văn cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học... vậy vi khuẩn cố định đạm ngoài vi c cung cấp đạm cho cây lúa sinh trưởng và phát triển tốt vi khuẩn còn có khả năng làm tích lũy hàm lượng đạm tổng số trong thân cây lúa OM 4655 4.3.1.9 Ảnh hưởng của VK lên hàm lượng đạm tổng số trong hạt lúa OM 4655 lúc thu hoạch Hàm lượng đạm tổng số trong hạt lúa ở nghiệm thức có xử lý vi khuẩn Azospirillum sp2(R8b2) không bón thêm phân đạm có hàm lượng đạm tổng số. .. chiều dài bông lúa MBĐ lúc thu hoạch Chiều dài bông lúa ở nghiệm thức có xử lý vi khuẩn Azospirillum sp3(R29b1) không bón phân đạm dài hơn đối chứng 0,5cm, như vậy vi khuẩn chưa có ảnh hưởng làm tăng thêm chiều dài bông lúa Một bụi đỏ 4.4.2.8 Ảnh hưởng của VK lên số hạt chắc/bông lúa MBĐ lúc thu hoạch Số hạt lúa chắc/bông ở nghiệm thức có bón 100% phân đạm không xử lý vi khuẩn nhiều hơn số hạt chắc của . QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 10 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu lúa ngắn ngày, lúa dài ngày và lúa hoang Kết quả phân lập 71 mẫu lúa ngắn ngày, lúa dài ngày và. vững, vi c tiến hành phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn Azospirillum sp. có khả năng cố định đạm trên cây lúa tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) ứng dụng cho vi c trồng lúa. pellicle Không xử lý vi khuẩn Không xử lý vi khuẩn 11 4.1.2 Địa điểm phát hiện ra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập Phân lập 71 mẫu lúa thu được 12 dòng vi khuẩn tại 06 tỉnh và 01 thành