phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân giải đạm từ nước thải làng nghề làm bánh pía sóc trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - -   - - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN: NGUYỄN HOÀI PHONG MSSV: 3108498 LỚP: VSVH K36 Cần Thơ, tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - -   - - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP Cần Thơ, tháng 12/2013 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN HOÀI PHONG MSSV: 3108498 LỚP: VSVH K36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS. NUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN HOÀI PHONG DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày..... tháng..... năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trước tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành nhất đến cha mẹ và mọi người trong gia đình đã có công nuôi dạy và luôn cổ vũ con đến ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình theo học tại Viện. Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS-TS Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình hướng dẫn, gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cảm ơn các anh chị tại phòng Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt là hai chị Nguyễn Thị Thúy Duy và Trần Trà My và các bạn đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn tất cả những anh chị, những người bạn và những người em đã luôn giúp đỡ, cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn này. Xinh kính chúc cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị dồi dào sức khỏe! Chúc các bạn của tôi báo cáo luận văn tốt đẹp! Chúc các em đạt kết quả tốt trong kỳ thi sắp tới! Tp. Cần Thơ, ngày 6 tháng 12 năm 2013 Nguyễn Hoài Phong TÓM LƯỢC Ô nhiễm đạm là vấn đề đã và đang được quan tâm trong sử lý môi trường hiện nay. Hàm lượng đạm cao trong nước thải ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thủy sinh động-thực vật và đặc biệt là sức khỏe con người. Việc xử lý ô nhiễm đạm bằng vi khuẩn phân giải đạm đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước. Đề tài nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm cao từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Xác định khả năng tạo enzyme protease trên môi trường MSB có bổ sung sữa gầy (2%) cho thấy chín trong số mười tám dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng sinh enzyme protease, khảo sát khả năng phân giải đạm bằng phương pháp đường chuẩn trên môi trường Lewis đã tìm ra được ba dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng phân giải đạm cao nhất là: M4, T1.1, T9. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S ribosomal RNA kết hợp sử dụng phần mềm Blast trên ngân hàng gene NCBI cho thấy hai dòng vi khuẩn này lần lược thuộc loài Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter towneri. Từ khóa: Bánh Pía, đạm amôn, vi khuẩn phân giải đạm, vi khuẩn Pseudomonas, vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn Acinetobacter. Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................. TÓM LƯỢC ............................................................................................................. MỤC LỤC ............................................................................................................ i DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................. 3 2.1. Sơ lược về nghề làm bánh Pía ........................................................................... 3 2.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất) ................................ 4 2.3. Khái quát quá trình amôn hóa ........................................................................ 4 2.3.1. Quá trình amôn hóa protein..................................................................... 5 2.3.2. Quá trình amôn hóa ure ........................................................................... 6 2.3.3. Quá trình amôn hóa kitin......................................................................... 7 2.3.4. Quá trình amôn hóa mùn ......................................................................... 8 2.4. Đại cương về enzyme protease ...................................................................... 9 2.4.1. Định nghĩa ............................................................................................... 9 2.4.2. Nguồn thu nhận ..................................................................................... 10 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme .... 11 2.4.4. Ứng dụng ............................................................................................... 13 Một số giống vi khuẩn phân giải đạm tiêu biểu ........................................ 15 2.5. 2.5.1. Giống Acinetobacter ................................................................................. 15 2.5.2. Giống Bacillus ........................................................................................... 18 2.5.3. Giống vi khuẩn Pseudomonas ................................................................... 22 2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới ....................................... 26 2.6.1. Vấn đề môi trường ................................................................................ 26 Vi sinh vật học K36 i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.6.2. Trong nước ............................................................................................ 26 2.6.3. Thế giới ................................................................................................. 28 CHƯƠNG 3: 3.1. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 30 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 30 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 30 3.1.2. Nguyên vật liệu ..................................................................................... 30 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 30 3.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu và hóa chất ......................... 30 3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 31 3.2.1. Phương pháp thu mẫu nước thải ........................................................... 31 3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn khử đạm ............................................. 32 3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập ............................................................................................................... 32 3.2.4. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn phân giải đạm ................................ 35 3.2.5. Định danh bằng kỹ thuật PCR ............................................................... 37 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 39 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................................... 39 4.1.1. Kết quả phân lập và địa điểm của các dòng vi khuẩn ............................... 39 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập .......................... 40 4.2. Đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn đã phân lập ..................................... 43 4.3. Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...................... 45 4.4. Khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn ............................................. 47 4.5. Nhận diện vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................ 49 CHƯƠNG 5: 5.1. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 53 Kết luận ........................................................................................................ 53 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 54 Vi sinh vật học K36 ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Tân Huê Viên - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng ........ 3 Hình 2.2: Bánh Pía thành phẩm.................................................................................... 4 Hình 2.3: Tế bào vi khuẩn Bacillus sp. ...................................................................... 19 Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn Pseudomonas sp. ............................................................. 23 Hình 3.1: Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm............................................. 30 Hình 4.1: Mẫu cấy trải vi khuẩn trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar............ 40 Hình 4.2: Đặc điểm một số khuẩn lạc ròng phân lập được ........................................ 42 Hình 4.3: Khả năng di động của các dòng vi khuẩn trên môi trường Meat extractPepton bán đặc ......................................................................................................... 44 Hình 4.4: Hình nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập ......................................... 44 Hình 4.5: Hiện tượng sủi bọt khí khi nhỏ H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn phân lập ..... 46 Hình 4.6: Vòng sáng phân giải protein của các dòng vi khuẩn trên môi trường MSB+2% sữa gầy ....................................................................................................... 46 Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR các dòng vi khuẩn phân lập ............................ 49 Hình 4.8: Kết quả blast DNA của M4 tương đồng với Acinetobacter radioresistens 50 Hình 4.9: Kết quả Blast DNA của T1.1 tương đồng với Acinetobacter towneri strain CCM7201 Vi sinh vật học K36 ......................................................................................................... 52 iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Môi trường Meat Extract – pepton (MP) ................................................... 30 Bảng 3.2: Môi trường LB (Luria-Bertani) ................................................................. 31 Bảng 3.3: Môi Trường MSB + 2% Skim milk ........................................................... 31 Bảng 3.4: Môi Trường Lewis (1958) ......................................................................... 31 Bảng 4.1: Nguồn gốc vi khuẩn đã phân lập ............................................................... 39 Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar ................................................................................................... 42 Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập............................. 45 Bảng 4.4: Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................ 47 Bảng 4.5: Hiệu quả phân giải đạm trong môi trường Lewis của các dòng vi khuẩn phân lập theo thời gian (µg/ml) .................................................................................. 48 Vi sinh vật học K36 iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nước ta đang tiến hành Công Nghiệp Hóa – Hiện Đại Hóa đồng thời kéo theo đô thị hóa đã và đang làm môi trường sống bị ô nhiễm nghiêm trọng. Theo ước tính của Tổng cục Môi trường - Bộ Tài nguyên và Môi trường (2012) tổng thiệt hại kinh tế của nước ta do ô nhiễm môi trường gây ra trong thời gian qua chiếm từ 1,5-3% GDP. Hầu hết môi trường từ đất, nước, không khí, các khu dân cư, khu công nghiệp từ thành thị đến nông thôn đã và đang bị xuống cấp, trở thành vấn đề bức xúc của toàn xã hội. Tại thành phố Hồ Chí Minh có 25 khu công nghiệp tập trung hoạt động với tổng số 611 nhà máy trên diện tích 2298 ha đất. Theo kết quả tính toán, hoạt động của các khu công nghiệp này cùng với 195 cơ sở trọng điểm bên ngoài khu công nghiệp, thì mỗi ngày thải vào hệ thống sông Sài Gòn - Đồng Nai tổng cộng 1.740.000 m3 nước thải công nghiệp, trong đó có khoảng 671 tấn cặn lơ lửng, 1.130 tấn BOD5 (làm giảm nhu cầu oxy sinh hoá), 1789 tấn COD (làm giảm nhu cầu oxy hoá học), 104 tấn Nitơ, 15 tấn photpho và kim loại nặng. Lượng chất thải này gây ô nhiễm cho môi trường nước của các con sông vốn là nguồn cung cấp nước sinh hoạt cho một địa bàn dân cư rộng lớn, làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật và hệ sinh thái vốn là tác nhân thực hiện quá trình phân huỷ và làm sạch các dòng sông. Ở Sóc Trăng, số doanh nghiệp vừa và nhỏ là 2.290 doanh nghiệp và đóng một vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế - xã hội. Sự phát triển doanh nghiệp vừa và nhỏ ở các ngành nghề sản xuất (đặc biệt là việc phát triển các làng nghề truyền thống như: làng cá xã Trung Bình (Long Phú), làng nghề hầm than củi xã Xuân Hòa (Kế Sách), làng nghề bánh Pía, lạp xưởng xã Phú Tâm (Châu Thành)...), dịch vụ theo thế mạnh của địa phương trong những năm gần đây tạo được thêm nhiều việc làm cho người lao động, do đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho người lao động. Bên cạnh đó việc ô nhiễm môi trường phát sinh từ phần lớn các cơ sở chế biến sản xuất phát triển tự phát, có từ lâu đời, với qui mô sản xuất thủ công nhỏ lẻ, công nghệ lạc hậu, không có thiết bị xử lý chất thải, khí thải. Chế biến thực phẩm là một trong những loại hình sử dụng nước tương đối lớn, mức độ nước thải ô nhiễm hữu cơ cao và phụ thuộc vào công nghệ và nguyên liệu sản xuất. Nhưng phần lớn lượng nước thải được đưa trực tiếp ra nguồn nước mà không qua hệ thống xử lý nước thải, làm ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân xung quanh, làm giảm số lượng sinh vật thủy sinh,... Vi sinh vật học K3 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Từ đó việc đưa ra các biện pháp xử lý nước thải từ các làng nghề ngày càng trở nên cấp thiết đối với các cấp quản lý và các nhà khoa học. Các nhà nghiên cứu khoa học và bảo vệ môi trường đã và đang không ngừng tìm hiểu, đề xuất, áp dụng mọi phương pháp vật lý, hóa học và sinh học nhằm mục đích tăng cường việc làm giảm mức độ ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao nhận thức về việc sử dụng, bảo vệ đi đôi với việc tái sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên. Việc xử lý nước thải bằng các biện pháp sinh học, sử dụng những vi sinh vật có khả năng phân hủy hoặc kết tụ các chất hữu cơ và vô cơ có trong nước thải thành những chất ít gây hại, dễ dàng thu gom và xử lý hoặc có thể thu được khí sinh học để sử dụng, nước thải sau khi qua xử lý có thể cho trực tiếp vào môi trường tự nhiên mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân cũng như các sinh vật thủy sinh. Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm mạnh sẽ giúp ích cho việc xử lý nước thải trong công nghiệp, sinh hoạt và các làng nghề truyền thống. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn triển vọng có khả năng phân giải đạm trong nước thải từ các làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng nhằm hướng tới việc ứng dụng những dòng vi khuẩn này vào một số quy trình xử lý nước thải và sản xuất chế phẩm Sinh học. Vi sinh vật học K3 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về nghề làm bánh Pía Bánh pía có nguồn gốc từ bánh Trung Thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ). Bánh do một số người Minh Hương di cư sang Việt Nam từ thế kỷ 17 mang theo. Trước đây, việc làm bánh Pía hoàn toàn mang tính thủ công và phục vụ cho nhu cầu của từng gia đình. Đến đầu thế kỷ 19, người đầu tiên làm bánh Pía để kinh doanh và truyền nghề cho con cháu sau này là ông Đặng Thuận sinh sống ở làng Vũng Thơm (nay là xã Phú Tâm, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng). Hình 2.1: Tân Huê Viên - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng (Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx, ngày 21/07/2013) Bánh Pía Sóc Trăng có hương vị rất đặc trưng, đó là mùi thơm của sầu riêng, vị béo của hột vịt muối (trứng vịt muối), vị bùi của đậu xanh, khoai môn, và thơm mùi bột mì của vỏ bánh nướng vàng. Vi sinh vật học K3 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 2.2: Bánh Pía thành phẩm (Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx, ngày 21/07/2013) 2.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất) Nước thải công nghiệp là loại nước thải từ các nhà máy đang hoạt động sản xuất, phụ thuộc loại hình công nghiệp. Nước thải công nghiệp nói chung khác nhau ở mỗi ngành nghề, ở mỗi cơ sở sản xuất. Phụ thuộc vào quá trình sản xuất của mỗi làng nghề (nước rửa nguyên liệu, sản phẩm, thiết bị, nước thải trong quá trình chế biến) Đặc tính ô nhiễm và nồng độ của nước thải công nghiệp rất khác nhau phụ thuộc vào loại hình công nghiệp và chế độ công nghệ lựa chọn. Nước thải chế biến có chứa hàm lượng cặn lơ lửng và chất hữu cơ rất cao, thường có lượng oxy hòa tan tương đối thấp. Thành phần nước thải chế biền gồm tinh bột, đường, protein, cellulose, các khoáng chất và độc tố công nghiệp,… * Đặc điểm nước thải của cơ sở sản xuất bánh Pía: Màu sắc: Trắng Mùi: Thối Độ đục: Rất đục 2.3. Khái quát quá trình amôn hóa Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất Vi sinh vật học K3 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đồng hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S. Bao gồm: quá trình amôn hóa bùn, amôn hóa Protein, quá trình amôn hóa Urê, acid Uric, Xianamit Canxi, Kitin. 2.3.1. Quá trình amôn hóa protein 2.3.1.1. Khái niệm Protein là thành phần cơ bản của nguyên sinh chất tế bào, chứa khoảng 15-17,6% N (tính theo chất khô). Protein thường xuyên được đưa vào đất với một số lượng lớn cùng với xác động, thực vật, phân chuồng, rác,... Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (protein) để tạo ra NH 3 cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng dưới tác dụng của các loài sinh vật được gọi là quá trình amôn hóa protein. Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được thực hiện bởi các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi. 2.3.1.2. Các loại vi sinh vật phân giải protein Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải protein, chẳng hạn: Nấm mốc: Aspergillus candidus, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Fusarium solani, Mucor pusillus,... Nấm men: Candida albicans, Endomycopsis fibuligera, Saccharomyces carlsbergensis,... Vi khuẩn: Bacillus cereus, Bacillus pasteurianus, Bacillus subtilis, Aeromonas hydrophyla, Pseudomonas aeruginosa,... Vi sinh vật học K3 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Xạ khuẩn: Streptomyces erythreus, Streptomyces griseus, Thermonospora fusca, Thermonospora vulgaris,... Trong điều kiện: nhiệt độ: 25 – 35oC; pH: 4.5 - 9; độ ẩm: 30 - 60%; với sự xúc tác của enzyme protease sẽ diễn ra quá trình phân giải protein. 2.3.1.3. Cơ chế phân giải protein Để phân giải protein các vi sinh vật này phải có enzyme protease ngoại bào. Các enzyme này xúc tác cho quá trình thủy phân protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn (các polipeptide và oligopeptide). Các chất này tiếp tục phân giải thành các acid amin hoặc hấp thụ ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần trong số các acid amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác tiếp tục phân giải để tạo ra NH3, CO2, H2S và nhiều sản phẩm trung gian khác. Các vi sinh vật không có khả năng sinh enzyme phân giải protein ngoại bào, không có khả năng đồng hóa các protein thiên nhiên mà chỉ có thể sử dụng các sản phẩm thủy phân của protein (polipeptide, oligopeptide, acid amin). Protein Protease Peptidase Oligopeptit và polipeptit acid amin hấp thụ hoặc phân giải ra NH3, NH4(+) Khi phân giải các acid amin chứa S (như methionine, cystine, cysteine) vi sinh vật giải phóng ra H2S và nếu tích lũy nhiều trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng. Khi phân giải tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon và scaton. Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các acid amin có thể độc với người và gia súc, đáng chú ý là histamin, acmatin, putrexin, cadavein. 2.3.2. Quá trình amôn hóa ure 2.3.2.1. Khái niệm Urê là một loại hợp chất hữu cơ đơn giản chứa 46,6% N, được sản xuất trong các nhà máy phân bón bằng cách tổng hợp: Lượng hữu cơ được vùi vào đất rất lớn, hàm lượng dinh dưỡng các chất này nằm trong đất khá nhiều nhưng cây trồng không thể hấp thụ được trực tiếp từ các chất hữu cơ đó, mà phải thông qua quá trình phân hủy và chuyển hóa của các loài vi sinh vật để thành các chất dinh dưỡng dễ tiêu cây trồng mới hấp thụ được. Nếu không có quá trình Vi sinh vật học K3 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ amôn hóa thì dù có giàu hữu cơ đến đâu cũng đều vô hiệu với cây trồng và càng gây độc hại cho môi trường sinh thái. Đơn giản nhất đó là lượng ure chứa trong nước tiểu. Người ta đã tính rằng, trong nước tiểu có khoảng 2% ure. Mỗi ngày một người lớn thải ra khoảng 1,2 lít nước tiểu, chứa khoảng 30g ure. Vậy nhân loại mỗi ngày thải ra hàng vạn tấn ure, đó là chưa kể lượng ure do các loại động vật thải ra. 2.3.2.2. Cơ chế của quá trình amôn hóa ure Dưới tác dụng của men urease do các loài vi sinh vật tiết ra làm xúc tác cho quá trình chuyển hóa ure. CO(NH2)2+ 2H2O (NH4)2CO3 VSV Urease (NH4)2CO3 2NH3+ CO2+ H2O Vi khuẩn ure có khả năng phân giải acid uric và xianamit canxi. Sau đó các sản phẩm ure lại được phân giải như phương trình trên để giải phóng ra NH3. 2.3.2.3. Các loại vi sinh vật phân giải ure Paster (1862) là người đầu tiên đã phát hiện ra vi khuẩn phân giải ure. Cho đến nay người ta đã phát hiện và phân lập được rất nhiều chủng vi khuẩn: Planosarcina ureae, Micrococcus eurae, Sarcina hansenii, Bacillus pasteurii, B. hesmogenes, B. psichrocatericus, B. amylovorum, Pseudobacterium eruolyticum, Chromobacterium, Proteus vulgaris. Nhiều loại nấm mốc và xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải ure. Vi khuẩn phân giải ure thường thuộc loại háo khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, chúng phát triển tốt ở pH = 6,5 –8,5. 2.3.3. Quá trình amôn hóa kitin 2.3.3.1. Khái niệm chung Kitin là hợp chất cao phân tử bền vững. Cấu trúc của kitin gần với cấu trúc của cellulose, nhưng trong phân tử các gốc glucose, người ta thấy gốc hydroxin ở nguyên tử C thứ hai được thay thế bằng những gốc amin đã được acetin hóa. Kitin có mặt trong thành tế bào của nhiều loại nấm (nhất là Acomycetes và Basidimomycetes), trong vỏ của nhiều loại côn trùng. Vi sinh vật học K3 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hàng năm có tới hàng triệu tấn kitin của giáp xác hình thành trong các đại dương. Kitin cũng có số lượng không nhỏ trong đất. Với khối lượng lớn như vậy, nhờ có các loài vi sinh vật, kitin được phân giải và chuyển hóa để thành các chất hữu cơ đơn giản, sau đó lại tiếp tục phân giải để cho ra các dinh dưỡng cung cấp cho cây trồng. 2.3.3.2. Những vi sinh vật phân giải kitin Có rất nhiều loài vi sinh vật phân giải kitin như: Vi khuẩn gồm: Achromobacter, Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Pseudomonas, Nocardia, Micromonospora. Nấm gồm: Aspergillus, Mortierella. Xạ khuẩn: Streptomyces gricecus. 2.3.4. Quá trình amôn hóa mùn 2.3.4.1. Khái niệm Mùn là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ phì của đất, là chất vô định hình, màu tối, khi bị vi sinh vật phân giải nó cho các chất hữu cơ như: lipit, sáp, glucide, protein,... Cứ 1 ha đất canh tác ở tầng 0 –20 cm có khoảng 30 –300 tấn mùn, tương ứng với mùn chứa khoảng 1,5 –15 tấn nitơ. Loại đất hữu cơ có tới 20% mùn, loại đất bạc màu, đất đồi feralit chỉ có 0,3 –0,5% mùn. Đất ở vùng thung lũng, rừng núi thường chứa hàm lượng mùn cao hơn ở vùng đồng bằng, trung du. Song hàm lượng mùn nhiều hay ít mà không được các loài vi sinh vật phân giải, chuyển hóa thì không có ý nghĩa dinh dưỡng đối với cây trồng. 2.3.4.2. Thành phần mùn Theo Nikitin (1960) thì trong chất mùn tự nhiên của đất Secnozem (đất xám) có chứa các thành phần sau: Carbohydrat: 1,3% Hemicellulose: 3,0% Cellulose: 0,4% Lignin: 4,2% Acid humic: 29,6% Vi sinh vật học K3 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Acid fulvic: 22,0% Humin: 36,5% Vi sinh vật Chất mùn + O2 NH3 + CO2 + Q 2.3.4.3. Các vi sinh vật phân giải mùn Phân giải chất mùn có rất nhiều các loài sinh vật đất tham gia, kể cả háo khí và yếm khí: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nguyên sinh động vật (các loại trùng). 2.4. Đại cương về enzyme protease 2.4.1. Định nghĩa Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton. Phản ứng thủy phân bởi enzyme có thể biểu diễn theo sơ đồ: A – B + H2 O (Cơ chất + H2O Enzyme Protease AH + BOH Sản phẩm) Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân. Nhưng do trong phản ứng thủy phân lượng nước rất lớn và coi như không đổi trong suốt quá trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. Trong quá trình phản ứng, các phân tử cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các phân tử khác. Cần lưu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản ứng chính nhưng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ như: trong phản ứng thủy phân protein thành acid amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng phân huỷ acid amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các hợp chất màu… Vi sinh vật học K3 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.2. Nguồn thu nhận 2.4.2.1. Từ thực vật Có ba loại protease thực vật như: Bromelain, Papin và Ficin. Papin thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling prooring) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus caria). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên. 2.4.2.2. Từ động vật Protease động vật thường có ở tuỵ tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày,… Gồm: - Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số enzyme khác có ở tuỵ tạng, chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ. - Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị. - Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage. 2.4.2.3. Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dược. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, Harley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau: - Protease serine - Protease kim loại - Protease acid - Protease thiol. Vi sinh vật học K3 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme - Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng. Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng. Vì vậy, với từng Enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme. - Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất, tùy từng enzyme. Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein. Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Vi sinh vật học K3 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp. Ở nhiệt độ thấp (0-41oC), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng. Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 45oC), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80-100oC. Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường. - Ảnh hưởng của pH môi trường pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 5-9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như: cơ chất, coenzyme, Ca2+… Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ… Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật,…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10. - Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt. Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể. - Ảnh hưởng của lượng nước Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước có ảnh hưởng đến tốc độ Vi sinh vật học K3 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Vì thế, nước là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác. 2.4.4. Ứng dụng 2.4.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm - Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các dạng dịch thuỷ phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá. - Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease sử dụng để làm trong dịch quả, dịch bia tạo điều kiện cho quá trình lọc. - Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat. - Sản xuất nước chấm: nước mắm, tương, chao,… - Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản phẩm có giá trị thấp, như: dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen,…) thành các dạng hoà tan thu dịch đạm thủy phân cho người hoặc thức ăn chăn nuôi. - Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá hoặc để tinh chế guanine. 2.4.4.2. Trong công nghiệp dệt Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hưởng đến độ bền của tơ. 2.4.4.3. Trong công nghiệp phim ảnh Protease được dùng để sản xuất gellatin phủ trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X-quang. 2.4.4.4. Trong công nghiệp da Protease được dùng để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông thu hồi và tỷ lệ thu hồi tăng 25-30% so với khi dùng phương pháp hoá học, da có chất lượng cao. Vi sinh vật học K3 13 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.4.5. Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, thuốc đánh răng, để tẩy sạch các vết máu mủ hoặc bổ sung protease vào kem bôi mặt, có tác dụng loại được các lớp biểu bì chết, làm mịn da. 2.4.4.6. Trong công nghiệp dược phẩm Protease được dùng để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hoá, thuốc tiêu mủ ở các vết thương và giảm đau cho người bệnh. 2.4.4.7. Trong xử lý ô nhiễm môi trường Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptide tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối. Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ hoàn toàn. Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thuỷ phân, như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làm thức ăn. Protease ngoại bào được tiết ra từ Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas marinoglutinosa và Acromonas hydrophila có thể cố định trong canxi alginate để thực hiện các phản ứng liên tục thu được sản lượng cao trong các phản ứng thủy phân thịt cá. Vi sinh vật học K3 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.5. Một số giống vi khuẩn phân giải đạm tiêu biểu 2.5.1. Giống Acinetobacter Phân loài: (Brisou và prévot, 1954) Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Giống: Acinetobacter Giống Acinetobacter đã được biết đến trong nhiều năm, thường dưới tên chung khác. Chi tiết lịch sử và danh pháp của chúng được tìm thấy (Dijkshoorn, 1996; Towner, 1996), hay theo các chương trong cuốn sách xuất hiện chứng tỏ sự quan tâm ngày càng tăng và tầm quan trọng của nhóm vi khuẩn này (Bergogne - Bérézin et al, 1996). Về sinh lý, giống Acinetobacter có dạng hiếu khí, không di động, catalase dương tính và oxidase âm tính. Chúng phát triển tốt trên môi trường phức tạp và có thể phát triển trên môi trường khoáng đơn giản với một nguồn carbon duy nhất, bao gồm: acetate, các axit béo, và đôi khi hydrocarbon. Ngoài ra, hầu hết các thành viên của Acinetobacter điều tăng trưởng tốt trên môi trường thạch MacConkey chỉ ngoại lệ với một số chủng A. lwoffii (Bergogne - Bérézin và Towner, 1996). Giống Acinetobacter đã và đang thu hút sự quan tâm trong các ứng dụng về môi trường và công nghệ sinh học. Một số chủng của chi này được biết là có liên quan đến việc phân hủy sinh học của một số chất gây ô nhiễm khác nhau như: biphenyl clo và biphenyl, axit amin (analine), phenol, benzoat, dầu thô, acetonitrile, và trong việc loại bỏ phosphate hoặc các kim loại nặng. Chủng Acinetobacter cũng hiện diện ở giữa các vi khuẩn lên men để sản xuất một số sản phẩm enzyme bên ngoài ngoài và bên trong tế bào như: lipase, protease, cyanophycine, bioemulsifiers và một số loại biopolymers. Trọng tâm của đánh giá này, do đó, liên quan đến việc sử dụng của một số chủng Acinetobacter như một biocatalyst để khắc phục ô nhiễm môi trường khác nhau và các ứng dụng công nghệ sinh học khác. Một số có thể dễ dàng biến dạng bởi chiết xuất DNA, là đối tượng hấp dẫn cho các thao tác di truyền và các nghiên cứu về tổ chức và gen quy định. Vi sinh vật học K3 15 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Acinetobacter spp. được coi là phổ biến, đã được tìm thấy trong nhiều môi trường như đất, khí và nước muối, một số môi trường khắc nghiệt (đặc biệt là dòng chất thải và môi trường ô nhiễm), kết hợp với thực vật và động vật (kể cả con người), trên rau và các thực phẩm khác. Chúng có thể hình thành màng sinh học và tồn tại trên bề mặt khô trong thời gian dài. Chúng trao đổi chất rất linh hoạt (ví dụ như: khả năng phân huỷ một loạt các hợp chất hữu cơ hoặc giải độc kim loại nặng), khả năng tổng hợp các sản phẩm sinh học khác nhau với mục đích thương mại tiềm năng (ví dụ như: bioemulsans, biodispersants, men, kháng sinh chống nấm), và khả năng để thúc đẩy tăng trưởng thực vật và đối kháng tác nhân gây bệnh, đã dẫn đến việc sử dụng chúng hoặc đề nghị sử dụng chúng cho một số ứng dụng môi trường (ví dụ như: xử lý sinh học của các nơi bị nhiễm hydrocarbon và các kim loại nặng) và các ứng dụng nông nghiệp (ví dụ như: thực vật tăng trưởng thúc đẩy vi khuẩn hoặc các tác nhân kiểm soát sinh học đối với tác nhân gây bệnh nấm và vi khuẩn của thực vật). Đánh giá tác động của quá trình xử lý nước thải trên tỷ lệ kháng kháng sinh ở Acinetobacter spp. trong nước thải và nguồn nước sử dụng của nó. Trong hai sự kiện khác nhau (nhiệt độ cao, dòng chảy cao, 31oC và nhiệt độ thấp, dòng thấp, 8oC), 366 chủng Acinetobacter spp. được phân lập từ năm địa điểm khác nhau, ba nguồn trong một nhà máy xử lý nước thải (nguyên liệu vào, nước thải, nước thải cuối cùng) và hai nguồn trong cơ quan tiếp nhận (phía thượng lưu và hạ lưu của các điểm xả nước thải xử lý). Các kiểu hình nhạy cảm với kháng sinh được xác định theo phương pháp discdiffusion cho 8 loại thuốc kháng sinh, amoxicillin/clavulanic acid (AMC), chloramphenicol (CHL), ciprofloxacin (CIP), colistin (CL), gentamycin (GM), rifampin (RA), sulfisoxazole (SU), và trimethoprim (TMP). Tỷ lệ kháng kháng sinh trong Acinetobacter cho ra AMC, CHL, RA, và nhiều loại thuốc (kháng sinh ba hoặc hơn) tăng lên đáng kể (pb0.01) từ các mẫu nguyên liệu vào (AMC, 8,7%; CHL, tăng 25,2%; RA, 63,1%; nhiều loại thuốc, 33,0%) với mẫu nước thải cuối cùng (AMC, 37,9%; CHL, 69,0%; RA, 84,5%; nhiều loại thuốc, 72,4%), và cao hơn đáng kể (pb 0,05) trong mẫu hạ nguồn (AMC, bằng 25,8%; CHL, 48,4%; RA, 85,5%; nhiều loại thuốc, 56,5%) so với mẫu thượng nguồn (AMC, 9,5%; CHL, 27,0%; RA, 65,1%; nhiều loại thuốc, 28,6 %). Những kết quả này cho thấy quá trình xử lý nước thải góp phần gia tăng có chọn lọc các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh và sự xuất hiện của vi khuẩn kháng nhiều loại thuốc trong môi trường nước. Vi sinh vật học K3 16 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Điều kiện phát triển: Hầu hết các chủng Acinetobacter có thể phát triển trên môi trường khoáng đơn giản có chứa carbon và nguồn năng lượng. Phần lớn các giống Pseudomonads phân lập hoại sinh trong đó chúng có thể sử dụng bất kỳ một trong phạm vi rộng lớn của các hợp chất hữu cơ. Một số chủng Acinetobacter, đặc trưng bởi sự phổ dinh dưỡng tương đối hẹp, đã được tìm thấy trong nhiễm trùng bệnh viện, trong khi những người khác với một số lượng gene giàu được tìm thấy trong môi trường khác nhau. Các hợp chất chuyển hóa bởi các thành viên của chi Acinetobacter bao gồm rượu có hợp chất béo, một số axit amin, axit béo và decarboxylic, hydrocarbon không phân nhánh, một số chất đường, và nhiều hợp chất tương đối bền như 2,3 butanediol, benzoat, mandelate, n-hexadecan, cyclohexanol, cresol, và khử trùng bằng clo hợp chất phenol (Towner, 1996). Những đặc điểm linh hoạt dựa trên một số con đường sinh hóa bất thường. Mặc dù hầu hết các chủng không thể sử dụng glucose như một nguồn carbon, nhiều loài có thể bị oxy hóa một phần nhiều monosaccharides (glucose, galactose, mannose, xylose và arabinose ribose). Ví dụ, Acinetobacter sp. ADP1 có thể phát triển trên đường như nguồn carbon duy nhất mặc dù thiếu các gen quan trọng cho sự đồng hóa glucose (glucokinase, hexokinase và hệ thống phosphotransferase). Cách duy nhất rõ ràng sinh vật này có thể sử dụng glucose là bởi một quá trình oxy hóa periplasmic, thông qua một giới hạn màng glucose (Barbe et al., 2004). Theo nghiên cứu của Smith et al.,(2004) đưa ra giả thuyết rằng Acinetobacter sp. có thể đã phát triển một mối quan hệ hiệp đồng với nấm men để tạo điều kiện sử dụng glucose. Hầu hết các chủng Acinetobacter không thể giảm bớt nitrate thành nitrite, nhưng cả hai nitrate và nitrite có thể được sử dụng như là nguồn nitơ bằng cách đồng hoá nitrate bằng men khử. Khả năng amoni hoá nitơ hữu cơ đã được báo cáo. Phân tích bộ gen hoàn chỉnh của Acinetobacter ADP1 tiết lộ rằng các gen mã hóa cho protein tham gia vào sự đồng hoá nitrate hình thành từ một cluster (Barbe et al., 2004). Các thuộc tính sinh lý: Acinetobacter spp. là vi khuẩn Gram âm, do đó có một lớp màng bên ngoài để bảo vệ các tế bào và điều hòa tất cả các tương tác vi khuẩn trong môi trường. Thành phần chủ yếu của màng tế bào bên ngoài là lipopolysaccharide (LPS), một phân tử phức tạp bao gồm ba phần: một lipid được gắn vào trong màng bên ngoài, một polysaccharide trung tâm và một chuỗi O bên, O- kháng nguyên. Các phân tử Vi sinh vật học K3 17 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài của các loài Acinetobacter khác nhau rất khó thấy nhưng quan trọng từ Enterobacteria. Thành phần của chúng làm cho chúng kháng được thủy phân acid, có thể phù hợp với các sinh vật hình thành các acid hữu cơ từ glucose. Hơn nữa, LPS của chúng được tự do giải phóng vào môi trường bên ngoài, đặc biệt là khi các tế bào được phát triển trên nền kỵ nước (Borneleit và Kleber, 1991). LPS là yếu tố quyết định lớn của độc trong loài gây bệnh, chủ yếu một phần từ chất béo của chúng. Trong một chủ bị nhiễm, LPS được gọi là nội độc tố, nó hoạt động như một chất kích thích mạnh của phản ứng viêm. Cấu trúc của một số polysaccharides Okháng nguyên và đặc tính kháng nguyên của chúng đã được công bố làm cho chúng có sẵn như chemotaxonomic hữu ích và đánh dấu kháng nguyên cho việc xác định và phân biệt chủng Acinetobacter. Đáng chú ý, Acinetobacter sp. ADP1 không có Okháng nguyên (Barbe et al., 2004). Màng ngoài có chứa các protein điều hoà vận chuyển xuyên màng của các phân tử. Các phân tử nhỏ như monosaccharides có thể nhập vào các tế bào vi khuẩn thông qua Porins. Tuy nhiên, lượng phân tử lớn hơn đòi hỏi phải vận chuyển cụ thể. Có tầm quan trọng lâm sàng đáng kể, một biểu hiện thay đổi của protein màng tế bào bên ngoài và bơm bên ngoài này góp phần multiresistance kháng sinh của trực khuẩn Gram âm (Thomson và Bonomo, 2005). Protein khác của màng ngoài có liên quan đến độc tính. Các protein màng ngoài 38 (Omp38) có thể hoạt động như một yếu tố độc lực tiềm năng để tạo ra quá trình apoptosis của các tế bào biểu mô trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng A. baumannii. Protein màng ngoài khác liên quan đến tính độc hại là các protein màng ngoài sắt có quy định. Protein OM73-like và Fata-like đã được tìm thấy trong chủng A. baumannii. Chúng đóng góp vào hiệu quả của các vi khuẩn sử dụng sắt, và do đó góp phần vào độc lực của một chủng đặc biệt (Dorsey et al., 2003). Hệ thống gel SDS-polyacrylamide đã được sử dụng cho việc nghiên cứu bên ngoài màng hồ sơ protein của chủng lâm sàng của A. baumannii (Cuenca et al., 2003). 2.5.2. Giống Bacillus Phân loài: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Vi sinh vật học K3 18 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus truy cập ngày 10/10/2013) Hình 2.3: Tế bào vi khuẩn Bacillus sp. (Nguồn: http://www.psmicrographs.co.uk/bacteria-cells--bacillus-sp--/scienceimage/13961b-bacillus, ngày 18/11/2013) Vi khuẩn Bacillus đã được nhiều nhà khoa học quan tâm chú ý bởi tính năng về ứng dụng của chúng. Người Nhật hơn 400 năm nay đã biết sử dụng Bacillus subtilis để lên men một món ăn truyền thống ”Itohiki-Natto”. Ở phương Tây đã sản xuất protease kiếm từ Bacillus licheniformis dùng trong bột giặt, sản xuất α-amylase biến tinh bột thành siro bắp giàu fructose. Các vi khuẩn Bacillus còn là nguồn cung cấp nhiều loại kháng sinh, các chất làm tăng hương vị như purine nucleoside, surfactan... Các phẩm chất về công nghệ sinh học này, cùng với khả năng tạo bào tử và nảy mầm đã làm Bacillus trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn Gram dương (Lê Thị Lan, 1997). Hầu hết các vi khuẩn Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu khí, chúng được phân lập dễ dàng từ đất hoặc từ không khí. Khi xử lý mẫu bằng nhiệt độ, các tế bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ phá hủy, trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn sống (Nguyễn Đình Bảng et al., 1992). Vi sinh vật học K3 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Các vi khuẩn thuộc giống Bacillus thường mọc tốt trên môi trường có nguồn carbon duy nhất là đường, acid hữu cơ, rượu,… Với nguồn nitơ duy nhất là ammonium, ngoài ra có một số dạng phân lập cần bổ sung vitamin để tăng trưởng. Chúng có thể sử dụng các sản phẩm enzyme thủy giải ngoại bào do quá trình phân giải polysaccharide, acid nucleic và lipid làm nguồn carbon và chất cho điện tử. Nhiều trực khuẩn thuộc loại này còn có khả năng sản xuất kháng sinh như: gramicidin, bacitracin, circulin, polymycin, tyrocidin. Hầu hết việc tạo kháng sinh đều có liên quan đến quá trình bão hòa và kháng sinh được giải phóng ở giai đoạn tế bào bước vào pha tăng trưởng ổn định sau khi chuyển sang bào tử hóa (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978). Bacillus có ít cho sự sinh trưởng của thực vật bằng cách giúp đỡ thực vật ngăn ngừa bệnh tật, kiểm soát một vài loại bệnh do nấm thường gặp ở ngũ cốc, trái cây và rau củ, do nó tiết ra các kháng sinh chống nấm của vi khuẩn. Bacillus là một loại vi khuẩn không gây bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng đối kháng với các loại vi sinh vật khác để phục hồi thế cân bằng sinh thái của hệ vi khuẩn đường ruột. Đặc biệt là khả năng hình thành bào tử rất cao. Môi trường sống chủ yếu của vi khuẩn Bacillus là đất, nước và bùn có rất nhiều tế bào và bào tử (Greem et al., 1999). Hoàng Thùy Long (1991), Bacillus làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh enzyme: protease, amylase, cellulose, catalase,… phân hủy chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Nguyễn Lân Dũng (1997), Bacillus là trực khuẩn gram dương, di động, kích thước 0,7-0,8 x 2-3µm và chịu nhiệt độ cao. 2.5.1.1. Bacillus subtilis Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005). Đặc điểm Vi sinh vật học K3 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ - Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5-0,8 µm x 1,5-3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8-1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000). - Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Sinh lý: Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37oC Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy. Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0-7,4 Sinh hóa: Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3(+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+). Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Hóa lỏng gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Vi sinh vật học K3 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose -Maltose + Đặc điểm bào tử và khả năng tạo bào tử - Đặc điểm bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. - Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000). Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 2.5.3. Giống vi khuẩn Pseudomonas Giống Pseudomonas là một nhóm vi khuẩn đa dạng và có ý nghĩa về mặt sinh thái nhất trên hành tinh đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong các chu trình carbon và đạm (Spier et al., 2000). Phân loại: Vi sinh vật học K3 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas (Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas truy cập ngày 10/10/2013) Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn Pseudomonas sp. (Nguồn: http://www.psmag.com/science-environment/slick-willy-24318/ truy cập ngày 18/11/2013) Pseudomonas hiểu theo nghĩa đen là một “đơn vị giả” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, “pseudo” có nghĩa là giả và “monas” có nghĩa là một đơn vị nhỏ lẻ. Thuật ngữ “monas” được sử dụng rất sớm trong ngành vi sinh học và có nghĩa là những vi sinh vật đơn bào. Bởi vì Pseudomonas phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên chúng được quan sát rất sớm trong lịch sử của ngành vi sinh vật học. Tên Pseudomonas được đặt cho những loại sinh vật này, được xác định bằng những thuật ngữ khá mơ hồ vào năm 1984 như một giống vi khuẩn Gram âm, hình que và có chiên mao ở cực. Pseudomonas được phân lập nhiều từ tự nhiên và một số lượng lớn các dòng giống nhau được cho là cùng Vi sinh vật học K3 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ một giống ban đầu. Nhiều phương pháp mới và gồm cả việc dựa trên nghiên cứu về sinh học phân tử đã phân loại lại nhiều dòng vi khuẩn (Cornelis, 2008). Pseudomonas (viết tắt là Ps.): trực khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử, có một chiên mao (hoặc một chùm chiên mao) mọc ở đỉnh, thường sinh sắc tố. Kích thước khoảng 0,5-1x1-4µm (Nguyễn Lân Dũng et al., 1979). Theo Parales et al., (2004) tất cả các dòng Pseudomonas chuyển động bằng một hoặc hơn một chiên mao phân cực và có đặc tính kích thích hóa học cao. Cấu tạo hóa học không được nghiên cứu chi tiết cho bất kỳ loài Pseudomonas. Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ như cơ chất tăng trưởng. Tuy nhiên, chúng cũng có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ khác mà chúng không thể trao đổi được. Ortega – Calvo et al., (2003) đã nghiên cứu sự phản ứng kích thích hóa học của nhiều dòng Pseudomonas liên quan đến vi khuẩn phân giải hydrocarbon thơm polycyclic như là dòng 9A của Pseudomonas stutzeri. Dòng này phân hủy naphthalene, phenanthren và anthracen. Kết luận là dương tính với naphthalene và dịch trong rễ của nhiều loại cây. Đặc tính hóa học có thể tăng cường phân hủy sinh học ô nhiễm theo quan sát ở phòng thí nghiệm. Dòng KC khoáng hóa carbon tetracloric và vận động tăng cường xử lý sinh học trong mẫu nước hóa thạch (apuifer) đã được chứng minh. Pseudomonas phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-370C, tuy nhiên một số chủng Pseudomonas lại có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao khoảng 420C. Nhiệt độ tối hảo khoảng 350C. Một số dòng Pseudomonas có khả năng chịu lạnh và có thể tăng trưởng ở 40C (Rosselló – Mora et al., 2001). Pseudomonas có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy đơn giản, nhu cầu dinh dưỡng đơn giản. Phát triển tốt ở pH trung tính. Một vài chủng có khả năng tạo màu huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm. Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong điều kiện không có oxy. Một dòng Pseudomonas tăng trưởng hiếu khí trong môi trường khoáng với bất kỳ hợp chất carbon đơn giản, đáng chú ý là acid hữu cơ và alcohol nhưng không phải với các carbohydrate. Tăng trưởng tốt trên môi trường như pepton hoặc dịch trích nấm men, gelatin, có thể phát triển yếm khí khi có sự hiện diện của nitrat, nitrit, nitramid, hoặc N2O tạo ra nitơ, trong môi trường nồng độ nitrit cao, N2O thành dạng N2, pH tối hảo khoảng 7, nhưng có thể tăng trưởng ở pH = 9. Vi sinh vật học K3 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Một số Pseudomonas có khả năng khử nitrate trong nước, biến nitrate thành nitơ tự do. Quá trình khử nitrate diễn ra ở diều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng đặc biệt diễn ra mạnh mẽ khi không có mặt oxy không khí. Nhiều dòng của giống Pseudomonas có hoạt tính amylase và protease, có khả năng lên men nhiều loại đường và tạo vỏ nhầy. Trong môi trường có pH dưới 5.5 các vi khuẩn này bị kìm hãm phát triển và sinh tổng hợp protease; nồng độ NaCl tới 5-6% thì sinh trưởng bị ngừng trệ. Nhiều dòng Pseudomonas được dùng trong công nghiệp sản xuất enzyme và acid amin. Một số loài gây bệnh bacterioz cho cây trồng và cũng tham gia vào làm hư hỏng thực phẩm (Lương Đức Phẩm, 1998). Pseudomonas cho kết quả dương tính với các kiểm tra catalase và oxidase. Pseudomonas cũng cho kết quả âm tính với indol, methylred và Voges Proskauer. Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi nhưng được tìm thấy chính ở trong đất và nước, ngoài ra còn tìm thấy trên động vật, thực vật, và nhiều dòng cũng được phân lập từ các mẫu bệnh lý. Một số dòng Pseudomonas có khả năng khử nitrate: Pseudomonas fluoresens: trực khuẩn nhỏ, có khả năng chuyển động nhờ 3-4 chiên mao ở cực. Khuẩn lạc có sắc tố màu huỳnh quang vàng lục. Pseudomonas fluoresens là một dòng tự dưỡng, có nhiều trong đất và nước. Pseudomonas fluoresens là một loài kỵ khí bắt buộc có khả năng khử nitrate (Trần Thanh Thủy, 1998). Khuẩn lạc trơn tăng trưởng trên đĩa ở 30oC và bảo quản 4oC trong 24h thường phát triển đặc tính nhầy (Lalucat et al., 2006). Pseudomonas stutzeri có môi trường phân bố rất rộng, nó có thể sống được trong những điều kiện sinh thái khác nhau (Lalucat et al., 2006), chúng được tìm thấy trong đất, nước và các mẫu bệnh lý. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có giới hạn nhiệt độ rất rộng, từ 4oC đến 45oC, tùy thuộc vào đặc tính riêng của từng dòng (Lalucat et al., 2006). Pseudomonas pyocyanae: trực khuẩn nhỏ, kích thước 1-5 µm, có khả năng chuyển động nhờ 1-2 chiên mao ở cực. Khuẩn lạc có sắc tố màu lục (Trần Thanh Thủy, 1998). Vi sinh vật học K3 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Pseudomonas stutzeri: vi khuẩn hình que, gram âm, di chuyển bằng chiên mao đỉnh, loài khử nitrate không sắc tố, khử nitrate thành khí nitơ, dương tính với các kiểm tra catalase và oxidase, có khả năng tạo enzyme amylase và có thể phát triển trong maltose và tinh bột và có phản ứng âm tính trong các kiểm tra arginine dihydrolase và sự thủy phân glycogen (Sikorsky et al., 1999). Pseudomonas aeruginosa: là trực khuẩn Gram âm, tồn tại ở nhiều dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một chiên mao đơn cực. Là vi khuẩn hiếu khí, có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC (Trần Linh Thước, 2005). 2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 2.6.1. Vấn đề môi trường Một vấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi trường sinh thái. Nguyên nhân chính là do các hoạt động sản xuất và sinh hoạt của con người gây ra. Ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng, đe dọa trực tiếp đến sự phát triển kinh tế - xã hội, sự tồn tại của các thế hệ hiện tại và tương lai. Đối tượng gây ô nhiễm môi trường chủ yếu là các hoạt động sản xuất của nhà máy trong các khu công nghiệp, hoạt động làng nghề và sinh hoạt tại các đô thị lớn. Ô nhiễm môi trường bao gồm 3 loại chính là: ô nhiễm đất, ô nhiễm nước và ô nhiễm không khí. Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong thời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa - hiện đại hóa hiện nay không chỉ đòi hỏi sự cấp thiết đối với các cấp quản lý, các doanh nghiệp mà đó còn là trách nhiệm của cả hệ thống chính trị và toàn xã hội. Để bảo vệ môi trường thoát khỏi các hiểm họa: thủng tầng ôzon, hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm nguồn nước sạch, không khí, đất đai,…con người cần phải nâng cao nhận thức gìn giữ và hiểu rõ vai trò, vị trí của mình và xã hội trong hệ thống tự nhiêncon người- xã hội. Xây dựng ý thức và phát triển mọi phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để xử lý rác thải, nước thải môi trường. Đồng thời kết hợp việc sử dụng, bảo vệ cùng với việc tái chế nguồn tài nguyên thiên nhiên. 2.6.2. Trong nước Phạm Thị Tuyết Ngân và Ngyễn Hữu Hiệp (2012) chín chủng vi khuẩn được phân lập từ ao nuôi tôm sú, trên môi trường chuyên biệt đã qua các bước thử nghiệm Vi sinh vật học K3 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ thành công trong phòng thí nghiệm trên qui mô bể nuôi. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa cho thấy 05 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus, 04 dòng Nitrosomonas dương tính với thuốc thử Griess- Ilosway và 05 dòng Nitrobacter cho kết quả âm tính với thuốc thử Griess- Ilosway. Kết quả giải trình tự và so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu gen chương trình BLAST cho thấy: B9 đồng hình với dòng Bacillus cereus BRL02-43 (97%), 02 dòng B37, B38 đồng hình giống với dòng Bacillus cereus G9842 (100% và 99%), Dòng B41 đồng hình giống với dòng Bacillus amyloliquefaciens SB3297 (100%) và dòng B67 có mức độ đồng hình với dòng Bacillus subtilis BL10 (99%). Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae 3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%). Cả 02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%). Trần Liên Hà et al.,(2007) bốn chủng vi khuẩn nitrate hóa được phân lập từ nước của 7 mẫu nước hồ và 2 mẫu đất. Cao Ngọc Điệp et al., (2010) Ba mươi dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ chất thải của hai trại chăn nuôi heo qui mô 400 con tại hai huyện Châu Thành và Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) Đã sưu tập được 67 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, 8 chủng thuộc nhóm Nitrosomonas và 8 chủng thuộc nhóm Nitrobacter. Bộ sưu tập vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm thâm canh hiện đang được lưu trữ trong tủ đông (- 80ºC) tại Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. Phạm Thị Tuyết Ngân et al., (2011) Đã thành công khi phát triển xác định mật số, tính đa dạng và loài chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn Nitrate trong môi trường ao nuôi tôm sú thâm canh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật Real Time PCR – Sybr Green cho kết quả chính xác, nhanh. Đã xác định được mật số vi khuẩn Nitrosomonas europaea dao động trong khoảng 102 đến 2,8×104 tế bào/g bùn. Mật số vi khuẩn Nitrobacter biến động trong khoảng 1,2×103 đến 9,1×107 tế bào/g bùn trong suốt quá trình nuôi. Đa dạng của quần thể các vi khuẩn đã được xác định bằng kỹ thuật DGGE. Thành phần vi khuẩn rất đa dạng với hơn 10 loài. Vi khuẩn chiếm ưu thế có chức năng oxi hóa amonium được phát hiện trong bùn có sự tương đồng cao với N. europaea. Lương Bích Dung (2008) phân lập phân lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus từ 2 mẫu bùn đáy ao nuôi tôm sú. Vi sinh vật học K3 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp et al., (2008) đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong ba vùng sinh thái khác nhau ở Đồng bằng Sông Cửu Long theo quy trình Sikorski et al., (2002), xác định 12 chủng vi khuẩn này bằng kỹ thuật PCR-16s rRNA với cặp mồi chung và cặp mồi đắc trưng (Bennasar et al., 1998) giải trình thự đoạn gen 16S rRNA của chủng P8 và định danh chính xác đến loài Pseudomonas stutzeri. Triệu Thị Ngọc Sang (2010) đã phân lập được 46 dòng vi khuẩn trong đó vi khuẩn Bacillus 21 dòng và 25 dòng vi khuẩn Pseudomonas từ ao nuôi cá tra ở 2 huyện Cầu Kè và Tiểu Cần tỉnh Trà Vinh. Ngô Mỹ Ngân (2010) đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long. 2.6.3. Thế giới Theo nghiên cứu của Camp et al., (2006) các vi khuẩn ammonium hóa được phát hiện trong nhiều hệ sinh thái biển và nước ngọt và ước tính đóng góp lên đến 50% mất đạm của đại dương. Hơn nữa, quy trình anammox hiện đang thực hiện xử lý nước để loại bỏ chi phí thấp của amoniac từ có độ bền cao dòng thải. Drysdale et al., (1999) cho biết, Pseudomonas spp. có sự tham gia đáng kể trong quá trình khử nitơ xảy ra trong quá trình Darvill BNR . Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn dị dưỡng khác nhau góp phần vào quá trình khử nitơ xảy ra trong quá trình này. Một số các vi khuẩn dị dưỡng khử nitơ có thể chứa nitrate và nitrite enzyme khử yếu , do đó chỉ cho phép nó giảm nitrate và nitrite chậm và yếu ớt. Nhiều vi khuẩn khử nitơ hoàn toàn có thể có khả năng hô hấp đồng thời oxy và nitrate vì vậy dẫn đến giảm nitrat trong vùng hiếu khí. Mặc dù chưa đầy đủ, một số vi khuẩn hình que gram dương cũng như cầu khuẩn gram âm cũng góp phần vào quá trình khử nitơ. Rõ ràng là giảm hoàn toàn của nitrate, nitrite, oxit nitơ và khí nitơ, trong quá trình Darvill BNR. Theo nghiên cứu của Schmidt et al., (2003) quá trình cơ bản của vi sinh vật kiểm soát loại bỏ nitơ trong lọc sinh học sẽ thúc đẩy đáng kể hiệu quả cải thiện các ứng dụng của lọc sinh học như các hệ thống xử lý vùng đất ngập nước. Năm 1983, Curtis đã so sánh khả năng khử nitrate của 3 loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, tốc độ tích lũy số lượng các chất trung gian của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, Pseudomonas aeruginosa và Vi sinh vật học K3 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ seudomonas paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là NO2. Vi khuẩn P. stutzeri và P. paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO3-, NO2-, NO2 và vi khuẩn này có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO 2 trong môi trường. Tổng cộng có 49 dòng Pseudomonas stutzeri được nghiên cứu, chúng được phân lập từ những mẫu bệnh lý, bùn biển và trong hệt thống nước thải (Holmes, 1986; Rossello et al., 1991). Su et al., (2001) so sánh sự khử nitrate ở điều kiện hiếu khí, dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 và Pseudomonas stutzeri SU2. Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan. Vi sinh vật học K3 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013. Địa điểm: Phòng Công Nghệ Sinh Học Vi Sinh Vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ. 3.1.2. Nguyên vật liệu Nước thải từ 2 cơ sở làm bánh Pía: - Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng - Mỹ Trân, Tp Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng. 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị - Đĩa Petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh. - Cân điện tử Sartorius, pH kế, micropipet, kim cấy, bi trải mẫu. - Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc, tủ lạnh giữ mẫu - Nồi khử trùng nhiệt ướt và một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật. - Chai hoặc hộp nhựa có nắp đậy, vải lược. Hình 3.1: Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm 3.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu và hóa chất Bảng 3.1: Môi trường Meat Extract – pepton (MP) Hóa chất Meat extract Pepton Nước cất pH Vi sinh vật học K3 Liều lượng (g/l) 0,5 1 100ml 6,8-7 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Khử trùng ở 121oC trong 21 phút. Bảng 3.2: Môi trường LB (Luria-Bertani) Hóa chất Liều lượng (g/l) Yeast extract 0,5 Pepton 1 NaCl 1 Nước cất 100ml Agar 2 Khử trùng ở 121oC trong 21 phút. Bảng 3.3: Môi Trường MSB + 2% Skim milk Hóa chất K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgCl2 Stock 0,45g/0,5l 0,34/0,5l 1g/10ml 0,5g/10ml MnCl2 0,1g Stock 1 FeSO4 0,6g CaCl2 2,6g Na2MoO4 0,02g ZnCl2 0,01g CaCl2 0,01g Stock vi lượng CuSO4 0,01g NiSO4 0,001g Na2SeO4 0,001g Khử trùng ở 121oC trong 21 phút. Thể Tích 100ml 11,25ml 17ml 2ml 320µl 10ml 10µl 100ml 10µ Bảng 3.4: Môi Trường Lewis (1958) Hóa chất Stock K2HPO4 7g/100ml MgSO4 2g/100ml NaHCO3 (NH4)2SO4 5g/100ml FeCl3.6H2O 230,4mg/40ml CaCl2.2H2O 0,8g/100ml pH Khử trùng ở 121oC trong 21 phút. Thể Tích 100ml 1ml 0,5ml 0,05g 0,5ml 250µl 320µl 7 Cycloheximide (Chất kháng nấm) Nước muối sinh lý 8,5‰. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp thu mẫu nước thải -Vật liệu: Chai nước 250 ml Vi sinh vật học K3 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ -Nguyên liệu: nước thải được lấy từ 2 cơ sở Tân Huê Viên và Mỹ Trân ở Sóc Trăng. 3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn khử đạm Mục đích: phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao. Đối tượng: Các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Phân lập: Lấy 20 ml dung dịch nước thải + 180 ml nước cất ( Pha loãng 10-1 ) cho vào bình tam giác thủy tinh. Lắc đều. Tiến hành pha loãng mẫu dung dịch trên theo trình tự độ pha loãng sau: 10-2, 10-3. Mỗi độ pha loãng lấy 1 ml trải lên đĩa petri có chứa môi trường Meat extractPepton có bổ sung 2% Agar (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24h. Tiếp tục cấy phân lập lần thứ 2 để chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau. Cấy chuyển: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa riêng có chứa môi trường Meat ExtractPepton-Agar, sau đó đem ủ ở 30oC. Cứ tiếp tục cấy chuyển đến khi khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, kích thước rồi kiểm tra độ ròng của vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lưu ý: Tất cả các thao tác đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển đều phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi tăng sinh: vi khuẩn đã phân lập ròng được nuôi tăng sinh trong môi trường Luria Bertani (LB). 3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn khử đạm khác nhau ta tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng: quan sát hình thể tế bào, nhuộm Gram, thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Protease, Thử nghiệm tính di động. 3.2.3.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học  Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc Hình dạng Màu sắc Kích thước Vi sinh vật học K3 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bề mặt  Đo kích thước tế bào vi khuẩn Đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).  Đặt thước trắc vi vật kính (được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10 m) vào bán kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ hình ảnh của thước.  Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính (là một miếng kính tròn trên đó có chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho hai thước song song và gần sát nhau  Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và vạch thứ hai nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.  Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.  Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thước sau: x = (N/n)* 10 m Trong đó: x: Trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính. N: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, N=6. n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n=35. Ta có: x=(6/35)*10 m  Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.  Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.  Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này. Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). - Ghi nhận kết quả: hình dạng tế bào Vi sinh vật học K3 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.3.2. Xác định Gram của vi khuẩn Nhuộm Gram: Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: Lấy 10μL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật. Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật. Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật. Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa. Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin. Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm. 3.2.3.3. Thử nghiệm catalase Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase. Cơ sở sinh hoá: Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Vi sinh vật học K3 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Catalase H2 O2 Trường Đại học Cần Thơ H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide) Cách tiến hành: - Nhỏ trực tiếp 1-2 giọt H2O2 30% tiếp lên khuẩn lạc ròng của vi khuẩn được nuôi trên môi trường đĩa thạch. - Quan sát sau 1-2 giây Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện 3.2.3.5. Khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. Cách tiến hành: - Cấy sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar). - Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. - Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. 3.2.3.6. Khảo sát hoạt tính enzyme protease - Môi trường: MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%) - Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5 µl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%) và ủ ở 30oC. Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn. 3.2.4. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn phân giải đạm  Phương pháp đường chuẩn: - Đặc điểm của phương pháp: + Phương pháp đường chuẩn áp dụng thuận tiện cho phép phân tích hàng loạt mẫu và cho phép tính kết quả nhanh. + Điều kiện áp dụng: Xác định nồng độ nằm trong khoảng tuân theo định luật Bia. - Nội dung của phương pháp: Vi sinh vật học K3 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ + Pha chế một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ NH4+ tăng dần, còn lượng thuốc thử và các điều kiện khác như nhau (pH, dung môi, lực ion, bước sóng…). Đo mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn và xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(C) xử lý bằng toán học thống kê, đường chuẩn thu được phải có dạng: A = (a ± εa) + (b ± εb).C (*) + Nếu đường chuẩn thu được có những điểm đầu hoặc điểm cuối (nồng độ) bị lệch khỏi đường thẳng của (*) trên đồ thị thì phải loại bỏ các giá trị đó. Tiến hành xây dựng lại phương trình đường chuẩn (nếu cần). + Pha chế dung dịch phân tích trong các điều kiện như trên rồi đem đo mật độ quang (Ax). Thay Ax vào (*) ta sẽ tính được Cx.  Hóa chất: Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl vào trong 100ml nước cất. Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2 µg/ml Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0.5 lít. Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5 lít. Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Lewis lỏng  Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) Phương pháp định lượng: Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5 lít. Pha buffer: cho 15ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất. Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm: Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5 ml H2O : 0 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4 ml H2O: 1 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3 ml H2O: 2 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2 ml H2O: 3 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1 ml H2O: 4 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0 ml H2O: 5 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử Vi sinh vật học K3 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ  Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn Hút 1ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf (3 lần lặp lại). Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút 0.5ml dịch vi khuẩn đã ly tâm vào 4ml H2O, 5ml buffer, sau đó cho 5ml thuốc thử. Cách tiến hành: Trước tiên nuôi các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường LB lỏng trong 12h, lấy 2ml dung dịch vi khuẩn cho vào tube enpendoft 2,5 đem ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trường ở trên rồi rửa lại với 1,5 ml nước muối sinh lý 8,5‰ tiếp tục đem ly tâm, sau đó đổ bỏ phần dung dịch làm như vậy với 2 lần nước cất khử trùng, sau đó chủng vi khuẩn vào môi trường Lewis lỏng nuôi trên máy lắc, tiến hành đo mỗi 4h trong 3 ngày liên tiếp (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012). 3.2.5. Định danh bằng kỹ thuật PCR Chọn một số dòng vi khuẩn khử đam mạnh có được từ kết quả của thí nghiệm trên, tiến hành nhận diện bằng phương pháp PCR và giải trình tự. Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải đạm, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt để nhận diện bằng phương pháp PCR sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau: Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Quy trình trích DNA: Nuôi vi khuẩn trong 6ml môi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml. Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa. Hòa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định trong môi trường, không bị biến tính). Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hoàn toàn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn). Vi sinh vật học K3 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch. Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phóng ADN). Ủ ở 65oC trong 20 phút. Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần không phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa có tạo màng protein ngăn cách). Trộn đều và ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN không biến tính và bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút. Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hoá chất đã dùng trước đó hay tạp chất còn lẫn), ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần). Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng trong 1-2h hoặc sấy khô bằng máy ly tâm chân không. Trữ ở 20oC. Điện di sản phẩm trên agarose gel Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di Sau khi điện di, tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận diện các dòng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rõ nét chọn ra các dòng vi khuẩn giải trình tự. Mẫu được gởi giải trình tự tại Công ty TBR, Tp Hồ Chí Minh. Vi sinh vật học K3 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn 4.1.1. Kết quả phân lập và địa điểm của các dòng vi khuẩn Từ 2 mẫu nước thải thu từ 2 cơ sở sản xuất Bánh Pía Tân Huê Viên và Mỹ Trân. Sau quá trình phân lập tách ròng trên môi trường Meat extract – Pepton – Agar (MPA) đã phân lập được tất cả 18 dòng vi khuẩn. (Bảng 4.1) Bảng 4.1: Nguồn gốc vi khuẩn đã phân lập STT Dòng vi khuẩn Địa điểm phân lập 1 M1.1 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 2 M1.2 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 3 M2 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 4 M2.1 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 5 M3 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 6 M4 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 7 M5 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 8 M6 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 9 M8 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 10 M9 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng 11 T1.1 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 12 T1.2 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 13 T2 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 14 T4 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 15 T5 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 16 T6 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 17 T8 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng 18 T9 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng Vi sinh vật học K3 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Từ mẫu cấy trải trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar(MPA) có bổ sung chất kháng nấm chọn ra những khuẩn lạc khác nhau cấy phân lập qua từng đĩa môi trường MPA. A C B D Hình 4.1: Mẫu cấy trải vi khuẩn trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar A : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-1 B : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-3 C : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-1 D : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-3 Vi sinh vật học K3 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Sau khi phân lập ròng tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này lên đĩa petri có chứa môi trường MPA để quan sát và mô tả các đặc điểm khuẩn lạc. Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 12 giờ. Mười tám dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều đặc điểm khác nhau được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa và kích thước khuẩn lạc. (Bảng 4.2 và Hình 4.2). Hình dạng khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc đều có dạng hình tròn, một số ít có dạng không đều. Trong tổng số 18 dòng phân lập được thì có 14 dòng có khuẩn lạc tròn (chiếm tỉ lệ 77,8%), 4 dòng có khuẩn lạc không đều (chiếm tỉ lệ 22,2%). Độ nổi khuẩn lạc: đa số những dòng vi khuẩn phân lập đều cho khuẩn lạc có độ nổi mô với 16 dòng (chiếm tỉ lệ 88,9%) và 2 dòng có độ nổi lài (chiếm tỉ lệ 11,1%). Bề mặt khuẩn lạc: Phần lớn những dòng vi khuẩn phân lập có bề mặt khuẩn lạc khô với 12 dòng (chiếm tỉ lệ 66,7%)và 6 dòng có bề mặt ướt (chiếm tỉ lệ 33,3%). Dạng bìa khuẩn lạc: trong 18 dòng vi khuẩn phân lập có 13 dòng có dạng bìa nguyên (chiếm tỉ lệ 72,2%) và 5 dòng có dạng bìa răng cưa (chiếm tỉ lệ 27,8%). Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn rất đa dạng trong đó có màu trắng đục, vàng nhạt, vàng và trắng. Trong tổng số 18 dòng phân lập có 10 dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục (tỉ lệ 55,6%), 3 dòng có khuẩn lạc màu vàng nhạt (tỉ lệ 16,7%), 3 dòng tạo khuẩn lạc màu vàng (tỉ lệ 16,6%) và 2 dòng tạo khuẩn lạc màu trắng (chiếm tỉ lệ 11,1%). Kích thước khuẩn lạc: dao động từ 0,4-2 mm của 18 dòng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường MPA sau 12 giờ. Vi sinh vật học K3 41 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ A C B D Hình 4.2: Đặc điểm một số khuẩn lạc ròng phân lập được A : M2 (Khuẩn lạc dạng tròn, mô, khô, bìa nguyên, trắng trong trên môi trường MPA) B : M1.1 (Khuẩn lạc tròn, mô, khô, bìa nguyên, màu vàng nhạt trên môi trường MPA) C : T2 (Khuẩn lạc tròn, mô, ướt, bìa nguyên, màu trắng đục trên môi trường MPA) D : T9 (Khuẩn lạc tròn, mô, khô, bìa nguyên, màu trắng đục trên môi trường MPA) Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar Hình dạng khuẩn lạc Kích thước STT Dòng Dạng Độ nổi Bề mặt Bìa Màu sắc (mm) 1 M1.1 Tròn Mô Khô Nguyên Vàng nhạt 0,9 2 M1.2 Tròn Mô Khô Nguyên Vàng 1,0 3 M2 Tròn Mô Ướt Răng cưa Trắng đục 1,2 4 M2.1 Không đều Mô Ướt Răng cưa Vàng 1,5 5 M3 Không đều Lài Khô Răng cưa Trắng đục 1,1 Vi sinh vật học K3 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ 6 M4 Tròn Mô Khô Nguyên Vàng nhạt 0,4 7 M5 Tròn Mô Khô Nguyên Trắng 0,9 8 M6 Tròn Mô Khô Nguyên Vàng nhạt 1,2 9 M8 Tròn Mô Ướt Nguyên Trắng đục 0,7 10 M9 Tròn Mô Khô Nguyên Vàng 0,5 11 T1.1 Tròn Mô Khô Nguyên Trắng đục 0,7 12 T1.2 Tròn Mô Khô Răng cưa Trắng đục 1,0 13 T2 Tròn Mô Ướt Nguyên Trắng đục 2,0 14 T4 Tròn Mô Khô Nguyên Trắng đục 1,7 15 T5 Tròn Mô Ướt Nguyên Trắng đục 1,3 16 T6 Không đều Lài Khô Răng cưa Xám 1,5 17 T8 Không đều Mô Ướt Nguyên Trắng 1,0 18 T9 Tròn Mô Khô Nguyên Trắng đục 0,5 4.2. Đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn đã phân lập Mười tám dòng vi khuẩn phân lập được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Trong đó, có 9 dòng có dạng que ngắn (chiếm tỉ lệ 50%), 5 dòng có dạng que dài (chiếm tỉ lệ 27,8%), 3 dòng có dạng cầu (chiếm tỉ lệ 16,7%), 1 dòng có dạng chuỗi (chiếm tỉ lệ 5,6%). Tất cả đều có khả năng chuyển động chiếm tỉ lệ 100%. (Hình 4.3 và Bảng 4.3) Nhuộm Gram: sau khi tiến hành các bước nhuộm Gram, kết quả có 16 dòng vi khuẩn Gram âm (chiếm tỉ lệ 88,9%) và 2 dòng vi khuẩn Gram dương (chiếm tỉ lệ 11,1%). Vi sinh vật học K3 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn di chuyển làm đục môi trường bán đặc Hình 4.3: Khả năng di động của các dòng vi khuẩn trên môi trường Meat extractPepton bán đặc T9 M4 T1.1 Hình 4.4: Hình nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập T9 : Vi khuẩn Gram dương, hình que M4 : Vi khuẩn Gram âm, hình que T1.1 : Vi khuẩn Gram âm, hình que Vi sinh vật học K3 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập Kích thước vi khuẩn (µm) Tên Hình dạng vi dòng khuẩn Chiều dài Chiều rộng 1 M1.1 Que ngắn 0,5 1 Âm + 2 M1.2 Que ngắn 0,8 1 Âm + 3 M2 Que ngắn 0,6 1,8 Âm + 4 M2.1 Que dài 1 3 Âm + 5 M3 Que dài 0,8 3,5 Dương + 6 M4 Que ngắn 0,7 2 Âm + 7 M5 Que dài 1 3 Âm + 8 M6 Que ngắn 0,5 1 Âm + 9 M8 Que dài 1 2,5 Âm + 10 M9 Cầu 1 1 Âm + 11 T1.1 Que ngắn 0,7 2 Âm + 12 T1.2 Cầu 1 1 Âm + 13 T2 Que dài 1 3,2 Âm + 14 T4 Chuỗi 1 4 Âm + 15 T5 Que ngắn 0,5 1 Âm + 16 T6 Que ngắn 1,1 2 Âm + 17 T8 Que ngắn 0,6 1,8 Âm + 18 T9 Que ngắn 1 2 Dương + STT Gram Chuyển động (*) (*) Chú thích : + : Di chuyển 4.3. Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập  Kiểm tra hoạt tính enzyme catalase Vi sinh vật học K3 45 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hiện tượng sủi bọt khí xuất hiện khi nhỏ giọt H2O2 lên khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập ta nhận thấy tất cả đều cho kết quả dương tính với enzyme catalase (chiếm tỉ lệ 100%). T 8 M6 Hình 4.5: Hiện tượng sủi bọt khí khi nhỏ H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn phân lập  Kiểm tra hoạt tính enzyme protease Chín dòng vi khuẩn phân lập tạo được vòng sáng khi cấy nhỏ giọt dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB + 2% sữa gầy (chiếm tỉ lệ 50%) đều này chứng tỏ những dòng vi khuẩn này có khả năng sinh enzyme protease, 9 dòng không có khả năng tạo vòng sáng (chiếm tỉ lệ 50%) chứng tỏ những dòng này ko có khả năng sinh enzyme protease trên môi trường MSB + 2% sữa gây. T1.2 M4 Hình 4.6: Vòng sáng phân giải protein của các dòng vi khuẩn trên môi trường MSB+2% sữa gầy Vi sinh vật học K3 46 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 4.4: Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập Protease(2) STT Dòng Catalase(1) Ngày 1(%) Ngày 2(%) Ngày 3(%) 1 M1.1 + - - - 2 M1.2 + - - - 3 M2 + - 211,1 267,9 4 M2.1 + 170,6 195,2 156,7 5 M3 + 180,0 226,3 260,0 6 M4 + - 178,6 136,8 7 M5 + - - - 8 M6 + - - - 9 M8 + 150,0 215,0 216,7 10 M9 + - - - 11 T1.1 + - 178,6 243,8 12 T1.2 + 156,0 160,0 192,3 13 T2 + - - - 14 T4 + - - - 15 T5 + - - - 16 T6 + - 226,7 164,5 17 T8 + - - - 18 T9 + - 194,7 257,1 Chú thích : (1) : + : Dương tính với enzyme catalase (2) : - : Không tạo vòng sáng trên môi trường MSB + 2% sữa gầy 4.4. Khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn Từ những thử nghiệm sinh hóa đã làm, chọn ra 9 dòng có khả năng sinh enzyme protease để test khả năng phân giải đạm, kết quả cho thấy cả 9 dòng vi khuẩn đã chọn đều có khả năng phân giải đạm. Tuy nhiên mức độ phân giải đạm ở mỗi dòng là khác Vi sinh vật học K3 47 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ nhau. Từ thí nghiệm chọn ra được 3 dòng có khả năng phân giải đạm tốt nhất (M4, T1.1, T9) để định danh. Bảng 4.5: Hiệu quả phân giải đạm trong môi trường Lewis của các dòng vi khuẩn phân lập theo thời gian (µg/ml) Thời gian Ngày 1 8h Mẫu 12h Ngày 2 16h 8h 12h Ngày 3 16h 8h 12h 16h ĐC 11,545A 10,851E 11,058BC 10,268BCD 10,340AB 10,056A 09,196B 09,098A 08,955EF M2 11,545A 11,918B 11,280B 11,518ABC 09,707BC 08,912D 07,773E 07,871BC 09,246DE M2.1 11,545A 11,200CD 11,235B 12,446A 09,910B 09,537BC 08,318CDE 08,413B 10,235B M3 11,545A 12,371A 10,753BCD 09,710D 09,684BC 09,315BCD 08,411CD 08,333B 10,963A M4 11,545A 10,294F 10,410D 11,613AB 09,678BCD 09,145CD 08,853BC 07,519CD 09,250DE M8 11,545A 11,308CD 11,844A 11,502ABC 08,866DE 09,525BC 08,029DE 07,676C 10,065BC T1.1 11,545A 11,918B 11,012BC 09,714D 08,988CDE 09,532BC 08,114DE 06,956DE 08,981EF T1.2 11,545A 11,016DE 12,179A 11,034BCD 10,773A 09,717AB 09,829A 07,558CD 09,185DE T6 11,545A 11,543C 10,935BCD 12,577A 09,791BC 09,728AB 10,105A 07,389CDE 09,601CD T9 11,545A 12,457A 10,550CD 10,173CD 08,206E 08,907D 08,211DE 06,799E 08,528F CV% 2,5 1,8 2,8 7,4 5,0 3,1 3,8 4,8 Chú thích: Các giá trị trung bình theo sau có các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa ở 5%. Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả 9 dòng vi khuẩn được chọn trong tổng số 18 dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng phân giải đạm trong môi trường Lewis đạt tỉ lệ 50%. Nhìn chung khả năng phân giải đạm giữa các khoảng thời gian trong mỗi dòng vi khuẩn phân lập và giữa các dòng vi khuẩn phân lập trong từng khoảng thời gian là giảm có ý nghĩa về mặt thống kê. Từ kết quả lượng đạm phân tích chọn ra 3 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt nhất là (M4, T1.1, T9). Sau khi chủng vi khuẩn vào nuôi trong môi trường Lewis lỏng vào lúc 8h ngày 1, kết quả đạm sau 12h ngày 1 nhìn chung là tăng chỉ có dòng M4 là giảm mạnh lượng đạm, sau đó 16h ngày 1 lượng đạm trong tất cả các dòng đều có chiều hướng giảm. Lượng đạm đo lúc 8h ngày 2 có chiều hướng giảm mạnh ở các dòng (M3, T1.1, T1.2, T9) những dòng còn lại thì tăng mạnh, lượng đạm đo được ở 12h và 16h ngày 2 phần Vi sinh vật học K3 48 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học 3,0 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ lớn các dòng đều giảm, chỉ có một số dòng tăng nhẹ nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê. Lượng đạm đo được tiếp tục giảm ở 8h và 12h ngày 3 ở phần lớn các dòng, ở 16h ngày 3 lượng đạm bắt đầu tăng mạnh ở tất cả các dòng. 4.5. Nhận diện vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử Điện di sản phẩm trên gel agarose cả ba dòng M4, T1.1, T9 đều có band ở vị trí 1500bp. 1500bp T1.1 T9 M4 Thang chuẩn Đối chứng âm Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR các dòng vi khuẩn phân lập Thang chuẩn 1kb Kích thước mẫu 1500bp  Kết quả giải trình tự dòng M4 GAATAGGGCAGCGACGCGAACAATGCGAGTCGAGCGGATGAAGGTAGCTT GCTACTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTA TTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGAGCGCTAATACCGCATACGTCCTA CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAG TCGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTA GCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTG ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTT TAAGCGAGGAGGAGGCTACCTAGATTAATACTTTAGGATAGTGGACGTTA Vi sinh vật học K3 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACA GAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCG GCCAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATT CGATACTGGTTGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCA TCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGG GCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGG GGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCAC AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT GGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAA CTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTT CGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGG Hình 4.8: Kết quả blast DNA của M4 tương đồng với Acinetobacter radioresistens Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trính tự tương đồng với các trình tự trên nguyên lý gene kết quả đã cho thấy trình tự của dòng M4 có mức đồng hình 99% với 16S rRNA của dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens. Kết quả nghiên cứu của Haleem (2003) cho thấy Acinetobacter ssp. phổ biến trong tự nhiên, được thu từ đất, nước và sinh vật. Giống Acinetobacter đã và đang thu hút được nhiều sự qua về khả năng ứng dụng trong Công nghệ Sinh học và xử lý môi trường. Giống Acinetobacter có thể sinh enzyme ngoại bào như : lipase, protease,… Kết quả giải trình tự dòng T1.1 AAGCGCCGAGGGGGGGGGCGGGCTGCTAGTTCGAGCGGGCGAGGTTGCTT CGGTAACTGAGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCT Vi sinh vật học K3 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ ATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCT ACGGGAGAAAGCAGGGGATCTCTTGTGACCTTGCCCTAATAAATGACCCT AAGTCGGATTACCTAGTTGGGGGGGTAAAGGCCTCCCAGGGCAACAATCT GTAGCGGGTCTGAAAGGATGACCCCCCACACGGGGACTGAAACACGGCCC AAACCCCTACGGGAGGCAGCAGGGGGAAATTTTGAACAAGGGGGGAAACC CTGATCCACCCATCCCGCGTGTGTGAAAAAGGCTTTTTGTTTGTAAAGCA TTTTAAGTGGGGAGGAGGCTTACCTGGTTAATACCTGGGCTAAGTGGACT TTACCCACAAAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCACCCGCGGTAAT ACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAG GTGGTTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGC TTTCGATACTGGTTAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGGTAAAATTCCAGG TGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCA GCCATCTGGCCTAATACTGACACTGAGGTGCAAAAGCATGGGGGAGCAAA CGGGATTAGATACCCTGGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCC GTTGGGGGGATTTGATCCTTTTAGTGGCCGCACCTAACGCGAATAAGTAG ACCGCCCTGGGGGAGTACGGTCCCAAAGACTAAAACCTCAAAATGAATTT GACGGGGGGCCCCCCACAAGCGGGTGGAACCATGGGGGTTTAATTCCGAT GCCACCGCAAAAAAACCTTTACCTGGCCCTTTGACAATAGTAAAAAACTT TTCCAAAAAATGGAATTGTTGCCTTTCGGGAAATCTACATACAGGGTGCT GCATGGCTTGTCTTCACCTCGTGTCGTGAAGATGTTGGGGTTAAGTCCCC CCAACGAACCCCAACCCTTTTTTCTTTACTTTGCCAACCATTTTCGGGAT GGGGAACTTTTAAGGGATCCTGCCCATTGAACAACCTGGAAGGAAGGGCG GGGGACGAACTTCAAGTTCATCAAGGGCCCTTTACGGGCAGGGGCTACCA CCCTTGCTTACAATGGTCCGGTTCCA Vi sinh vật học K3 51 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 4.9: Kết quả Blast DNA của T1.1 tương đồng với Acinetobacter towneri strain CCM7201 Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trính tự tương đồng với các trình tự trên nguyên lý gene kết quả đã cho thấy trình tự của dòng T1.1 có mức đồng hình 90% với 16S rRNA của dòng vi khuẩn Acinetobacter towneri. Kết quả nghiên cứu của Haleem (2003) cho thấy Acinetobacter ssp. phổ biến trong tự nhiên, được thu từ đất, nước và sinh vật. Giống Acinetobacter đã và đang thu hút được nhiều sự qua về khả năng ứng dụng trong Công nghệ Sinh học và xử lý môi trường. Giống Acinetobacter có thể sinh enzyme ngoại bào như : lipase, protease,… Vi sinh vật học K3 52 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Mười tám dòng vi khuẩn từ 2 mẫu nước thải thu từ 2 cơ sở sản xuất bánh Pía Tân Huê Viên, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng và Mỹ Trân, tp Sóc Trăng, tỉnh Sóc Trăng đã được phân lập. Trong đó có 9 dòng có khả năng phân giải đạm, 3 dòng có khả năng phân giải đạm tốt nhất là: M4, T1.1 và T9. Nhận diện bằng kỹ thuật sinh học phân tử 2 dòng M4, T1.1 lần lượt là: Acinetobacter radioresistens và Acinetobacter towneri. 5.2. Đề nghị Sử dụng các dòng vi khuẩn đã giải trình tự để khảo sát khả năng phân giải đạm ở những điều kiện khác nhau, thí nghiệm xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm đặc biệt là xử lý ở những làng nghề làm bánh Pía. Vi sinh vật học K3 53 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp, Phan Trường Khanh và Nguyễn Thị Xuân Mỵ. 2008. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất Đồng bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 191-195. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thành Nhân, Lê Quang Khôi. 2010. Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri trong chất thải trại chăn nuôi heo và ứng dụng xử lý nitrogen trong nước thải. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(4): 1877-1884. Lương Bích Dung. 2008. Phân lập một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ở ao nuôi tôm công nghiệp. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ. Lương Đức Phẩm. 1998. Công nghệ vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. Lý Kim Hữu. 2005. Khảo sát đặc điểm của vikhuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. Nguyễn Lân Dũng. 1997. Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 370-398. Nguyễn Đình Bảng, Hoàng Ngọc Hiển, Phạm Lê Hùng và Đàm Viết Cương. 1992. Vi sinh vật y học, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và Phạm Văn Ty. 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Ngô Mỹ Ngân. 2010. Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa. Luận văn đại học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp. 2012. Vi sinh vật học môi trường. Nxb. Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Thị Mai Khanh, Phạm Thị Hiếu Trinh. 2009. Phân lập và tuyển chọn các chủng Pseudomonas sp. ở ao nuôi cá tra. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. Vi sinh vật học K3 54 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Thành Nhân. 2008. Phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn Pseudomonas khử đạm từ chất thải trại chăn nuôi. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Phạm Thị Tuyết Ngân. 2012. Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Luận án tiến sĩ Thủy sản, ngành Nuôi trồng Thủy sảnh nước Măn, Lợ, Trường Đại học Cần Thơ. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Nhân Dũng, Dương Minh Viễn. 2011. Khảo sát mật độ và sự đa dạng của vi khuẩn nitrat hóa trong ao nuôi tôm. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 20b: 69-78. Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp. 2012. Định danh các vi khuẩn chuyển hóa đạm bằng phép thử sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử. Kỷ yếu hội nghị khoa học Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ lần 4:42-54. Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh và Nguyễn Thị Thanh. 2007. Phân lập và tuyển chọn các chủng nitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nước hồ ô nhiễm. Tạp chí Khoa học Công nghệ 45(3): 95-100. Trần Thanh Thủy. 1998. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật NXB Giáo Dục. Trần Linh Thước. 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục. Triệu Thị Ngọc Sang. 2010. Phân lập và khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas hiện diện trong ao nuôi cá tra. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. TIẾNG ANH Agerso Y. and Guardabassi L. 2005. Identification of Tet 39, a novel class of tetracycline resistance determinant in Acinetobacter spp. of environmental and clinical origin. J.Antimicrob.Chemother. 55:566-569. Barr AE, Barbe MF and Clark BD. 2004. Work-related musculoskeletal disorders of the hand and wrist: epidemiology, pathophysiology, and sensorimotor changes, J Orthop Sports Phys Ther. 34:610–627. Borneleit P, Blechschmidt B, Eschrich K and Kleber HP. 1991. β-Lactamase export across the outer membrane of Acinetobacter calcoaceticus : perturbation of the Vi sinh vật học K3 55 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ outer membrane lipopolysaccharide leaflet by enzyme overproduction, Arch Microbiol. 155:500–504. Bríou (J.) and Prévot (AR). 1954. Études de systématique bactérienne. X. Révision des espèces réunies dans le genre Achromobacter, Annales de l'Institut Pasteur (Paris), 86,722-728. Bergogne-Bérézin E and Towner KJ. 1996. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features, Clin Microbiol. 9:148-165. Cuenca, A. A., Schetter, A., Aceto, D., Kemphues, K. and Seydoux, G.. 2003. Polarization of the C. elegans zygote proceeds via distinct establishment and maintenance phases, Development. 130:1255-1265. Cornelis P (editor). 2008. Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology (1st ed.). Caister Academic Press. Curtis AC and Ingraham JL. 1983. Comparison of denitrification by Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa and Paracoccus denitrificans, Appl Environ Microbiol. 45:1247-1253. Dorsey. C. W, Tomaras, A. P. and Actis, L. A.. 2002. Genetic and phenotypic analysis of Acinetobacter baumannii insertion derivatives generated with a Transposome system, Appl Environ Microbiol. 68:6353–6360. E-Bergogne Berezin và KJ Towner. 1996. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features, Clin Microbiol. 9(2):148-165. Gerischer, U. (Ed.). 2008. Acinetobacter: Molecular Biology. Academic Press. G.D. Drysdale, H.D. Kasan and F. Bux. 1999. Denitrification by heterotrophic bacteria during activated sludge treatment. Centre for Water and Wastewater Research, Department of Biotechnology, Technikon Natal, PO Box 953, Durban 4000, South Africa. Water SA(25):357-362. Haleem. D. A. E. 2003. Acinetobacter: environmental and biotechnological applications. African Joumal of Biotechnology. 2(4):71-74. H.J.M. Op den Camp, B. Kartal, D. Guvent, L.A.M.P. van Niftrik, S.C.M. Haaijer, W.R.L. van der Star, K.T. van de Pas-Schoonen, A. Cabezas, Z. Ying, M.C. Vi sinh vật học K3 56 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Schmid, M.M.M. Kuypers, J. van de Vossenberg, H.R. Harhangi, C. Picioreanu, M.C.M. van Loosdrecht, J.G. Kuenen, M. Strous and M.S.M. Jetten. 2006. Global impact and application of the anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria. Department of Microbiology, IWWR, Faculty of Science, Radboud University Nijmegen, Toernooiveld 1(34):174-178. Ingo Schmidt, Olav Sliekers, Markus Schmid, Eberhard Bock, John Fuerst, J.Gijs Kuenen, Mike S.M. Jetten, Marc Strous. 2003. New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen removal in wastewater. EMS Microbiology Reviews 4(27):481-492. L Dijkshoorn , H Aucken , P Gerner-Smidt , P Janssen , ME Kaufmann , J Garaizar , J Ursing và TL Pitt. 1996. Comparison of outbreak and nonoutbreak Acinetobacter baumannii strains by genotypic and phenotypic methods, Clin Microbiol. 34(6):1519-1525. Lalucat, J., Bennasar, A., Bosch, R., García-Valdés, E. and Palleroni, N. J.. 2006. Biology of Pseudomonas stutzeri, Microbiol Mol Biol. 70:510–547. Madden, T. 2003. ”16. The BLAST sequence analysis tool”, NCBI Handbook: Querying and Linking the Data, 3:1-16. Marcus Benz, Andreas Brune and Bernhard Schink. 1997. Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria. Arch Microbiol. 169(2):159–165. Mulder, A. 1989. Anocxic ammonia oxidation. International application published under the patent coopperation treaty (PCT) PCT/NL89/00004. Parales R E and Haddock J D. 2004. Biocatalytic degradation of pollutants, Curr Opin Biotechnol. 15(4):374–379. Ortega-Calvo J.J., Marchenko A.I., Vorobyov A.V. and Borovick, R.V.. 2003. Chemotaxis in polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from coal-tar and oil-olluted rhizospheres, FEMS Microbiology Ecology. 44:373-381. Rossello-Mora R. and Amann R. 2001. The species concept for prokaryotes, FEMS Microbiol. 25:39–67. Smith, S. J., Andres, R., Conception, E., and Lurz, J.. 2004. Sulfur DioxideEmissions: 1850–2000(JGCRIReport.PNNL-14537). Vi sinh vật học K3 57 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Sikorski, J., Rossello-Mora, R. and Lorenz, M. G.. 1999. Analysis of genotypic diversity and relationships among Pseudomonas stutzeri strains by PCR-based genomic fingerprinting and multilocus enzyme electrophoresis, Syst Appl Microbiol. 22:393–402. Thomson JM and Bonomo RA. 2005. The threat of antibiotic resistance in Gramnegative pathogenic bacteria: beta-lactams in peril, Curr Opin Microbiol. 8(5):18-24. Ye J., S. MeGinnis and T. L. Madden. 2006. ”BLAST: improvements for better sequence analysis”, Nucleic research, Web server issue.34:6-9. Zumft, W. G. 1997. ”Cell biology and molecular basis of denitrification” microbiology and molecular biology. 61(4):533-616. TRANG WEB http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/moi-truong-nuoi-cay-culture - medium.html (Ngày 10/7/2013). http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/printthread.php?tid=412 (Ngày 10/7/2013). http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/953/Qui-trinh - nuoi-cay-phan-lap-vi-khuan-Neisseria-meningitidis.vhtm (Ngày 28/7/2013). http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/amon-hoa-protein-qua-trinh-thoi-rua-.887068.html (Ngày 30/7/2013). http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas (Ngày 2/8/2013). http://vi.wikipedia.org/wiki/Tr%E1%BB%B1c_khu%E1%BA%A9n (Ngày 2/8/2013). http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx, (Ngày 21/07/2013). http://www.psmicrographs.co.uk/bacteria-cells--bacillus-sp--/science-image/13961b bacillus (Ngày 18/11/2013). http://www.psmag.com/science-environment/slick-willy-24318/ (Ngày 18/11/2013). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (Ngày 16/11/2013). Vi sinh vật học K3 58 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả Số liệu test hoạt tính enzyme protease Protease STT Ngày 1 Dòng Ngày 2 Ngày 3 Khuẩn lạc(cm) Vòng sáng(cm) Khuẩn lạc(cm) Vòng sáng(cm) Khuẩn lạc(cm) Vòng sáng(cm) 1 M1.1 - - - - - - 2 M1.2 - - - - - - 3 M2 - - 0,9 1,9 1,4 3,75 4 M2.1 0,85 1,45 1,05 2,05 1,5 2,35 5 M3 0,75 1,35 0,95 2,15 1,0 2,6 6 M4 - - 0,7 1,25 0,95 1,3 7 M5 - - - - - - 8 M6 - - - - - - 9 M8 0,8 1,2 1,0 2,15 1,2 2,6 10 M9 - - - - - - 11 T1.1 - - 0,7 1,25 0,8 1,95 12 T1.2 0,8 1,25 1,0 1,6 1,3 2,5 13 T2 - - - - - - 14 T4 - - - - - - 15 T5 - - - - - - 16 T6 - - 0,75 1,7 1,55 2,55 17 T8 - - - - - - 18 T9 - - 0,95 1,85 1,4 3,6 Vi sinh vật học K3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Số liệu thí nghiệm xác định khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn phân lập: Đường chuẩn ngày 1 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ trong môi trường Lewis lúc 8h ngày 1 STT 1 Dòng vi khuẩn ĐC Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) 1 2 3 1 2 3 Trung bình 1,658 1,597 1,581 11,867 11,441 11,329 11,545 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày 1 STT Dòng vi khuẩn Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) 1 ĐC 1,541 1,482 1,515 11,049 10,636 10,867 Trung bình 10,851 2 M4 1,386 1,453 1,46 9,965 10,434 10,483 10,294 3 T6 1,581 1,626 1,628 11,329 11,643 11,657 11543 4 M2.1 1,575 1,541 1,572 11,287 11,049 11,266 11,2 5 T1.1 1,634 1,68 1,682 11,699 12,021 12,035 11,918 6 M2 1,689 1,621 1,686 12,084 11,608 12,063 11,918 7 T9 1,742 1,715 1,77 12,455 12,266 12,65 12,457 8 M3 1,715 1,76 1,715 12,266 12,58 12,266 12,371 9 M8 1,581 1,557 1,596 11,329 11,161 11,434 11,308 10 T1.2 1,516 1,523 1,57 10,874 10,923 11,252 11,016 Vi sinh vật học K3 1 2 3 1 2 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày 1 STT Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 ĐC 1,532 1,511 1,541 10,923 11,133 11,119 Trung bình 11,058 2 M4 1,584 1,644 1,49 10,497 10,021 10,713 10,41 3 T6 1,584 1,545 1,487 11,217 11,049 10,538 10,935 4 M2.1 1,508 1,496 1,733 11,287 11,196 11.224 11,235 5 T1.1 1,702 1,593 1,771 10,867 10,902 11,266 11,012 6 M2 1,591 1,605 1,632 10,825 11,231 11,783 11,28 7 T9 1,78 1,725 1,551 10,734 10,322 10,594 10,55 8 M3 1,596 1,382 1,547 10,448 10,455 11,357 10,753 9 M8 1,547 1,725 1,726 12,021 11,825 11,685 11,844 10 T1.2 1,537 1,581 1,611 11,972 12,042 12,524 12,179 1 2 3 1 2 3 Đường chuẩn ngày 2 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 8h ngày 2 STT 1 2 3 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 2 3 1 2 3 ĐC M4 T6 1,451 1,627 1,72 1,494 1,633 1,808 1,409 1,677 1,827 10,266 11,484 12,127 10,563 11,525 12,736 9,975 11,83 12,868 Vi sinh vật học K3 Trung bình 10,268 11,613 12,577 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 4 5 6 7 8 9 10 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 Trường Đại học Cần Thơ 1,739 1,394 1,645 1,435 1,414 1,554 1,166 1,719 1,334 1,672 1,47 1,325 1,656 1,76 1,84 1,386 1,579 1,408 1,373 1,679 1,76 12,259 9,871 11,608 10,155 10,01 10,979 8,293 12,12 9,456 11,795 10,397 9,394 11,684 12,404 12,958 9,816 11,152 9,968 9,726 11,844 12,404 12,446 9,714 11518 10,173 9,71 11,502 11,034 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày 2 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 2 3 1 2 3 ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 1,434 1,312 1,419 1,285 1,239 1,345 1,21 1,431 1,141 1,656 1,475 1,39 1,386 1,421 1,274 1,351 1,124 1,351 1,308 1,512 1,476 1,396 1,342 1,493 1,286 1,415 1,126 1,319 1,297 1,405 10,148 9,304 10,044 9,117 8,799 9,532 8,598 10,127 8,12 11,684 10,432 9,844 9,816 10,058 9,041 9,574 8,003 9,574 9,276 10,688 10,439 9,885 9,511 10,556 9,124 10,017 8,017 9,352 9,2 9,947 Trung bình 10,34 9,678 9,791 9,91 8,988 9,707 8,206 9,684 8,866 10,773 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày 2 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 2 3 1 2 3 1 ĐC 1,453 1,387 1,422 10,28 9,823 10,065 Trung bình 10,056 2 M4 1,276 1,324 1,267 9,055 9,387 8,992 9,145 3 T6 1,313 1,377 1,43 9,311 9,754 10,12 9,728 4 M2.1 1,385 1,362 1,29 9,809 9,65 9,152 9,537 5 T1.1 1,318 1,389 1,328 9,345 9,837 9,415 9,532 6 M2 1,261 1,277 1,228 8,951 9,062 8,722 8,912 7 T9 1,255 1,279 1,23 8,909 9,075 8,736 8,907 8 M3 1,284 1,342 1,315 9,11 9,511 9,325 9,315 9 M8 1,378 1,34 1,314 9,761 9,498 9,318 9,525 10 T1.2 1,453 1,355 1,307 10,28 9,601 9,269 9,717 STT Vi sinh vật học K3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ Đường chuẩn ngày 3 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 8h ngày 3 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 2 3 1 2 3 1 ĐC 1,357 1,433 1,383 8,975 9,469 9,144 Trung bình 9,196 2 M4 1,354 1,358 1,303 8,955 8,981 8,623 8,853 3 T6 1,489 1,509 1,594 9,833 9,964 10,517 10,105 4 M2.1 1,238 1,354 1,176 8,2 8,955 7,797 8,318 5 T1.1 1,2 1,218 1,256 7,953 8,07 8,318 8,114 6 M2 1,225 1,09 1,202 8,116 7,237 7,966 7,773 7 T9 1,241 1,276 1,202 8,22 8,448 7,966 8,211 8 M3 1,28 1,294 1,237 8,474 8,565 8,194 8,411 9 M8 1,178 1,247 1,21 7,81 8,259 8,018 8,029 10 T1.2 1,54 1,468 1,457 10,165 9,697 9,625 9,829 STT Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày 3 Dòng vi STT khuẩn 1 2 3 4 5 ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 Vi sinh vật học K3 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) 1 2 3 1 2 3 1,404 1,19 1,082 1,187 1,062 1,378 1,068 1,03 1,331 1,068 1,346 1,142 1,228 1,294 1,01 9,28 7,888 7,185 7,869 7,055 9,111 7,094 6,847 8,805 7,094 8,903 7,576 8,135 8,565 6,717 Trung bình 9,098 7,519 7,389 8,413 6,956 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 6 7 8 9 10 M2 T9 M3 M8 T1.2 1,2 0,978 1,176 1,152 1,126 Trường Đại học Cần Thơ 1,162 1,072 1,258 1,133 1,152 1,2 1,018 1,341 1,187 1,14 7,953 6,509 7,797 7,641 7,472 7,706 7,12 8,331 7,517 7,641 7,953 6,769 8,871 7,869 7,563 7,871 6,799 8,333 7,676 7,558 Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày 3 Lượng NH4+ (µg/ml/) OD (636nm) Dòng vi khuẩn 1 2 3 1 2 3 1 ĐC 1,346 1,377 1,339 8,903 9,105 8,858 Trung bình 8,955 2 M4 1,4 1,401 1,397 9,254 9,261 9,235 9,25 3 T6 1,43 1,448 1,482 9,45 9,567 9,788 9,601 4 M2.1 1,654 1,541 1,457 10,907 10,172 9,625 10,235 5 T1.1 1,396 1,367 1,311 9,228 9,04 8,675 8,981 6 M2 1,371 1,428 1,397 9,066 9,437 9,235 9,246 7 T9 1,257 1,306 1,302 8,324 8,643 8,617 8,528 8 M3 1,624 1,667 1,697 10,712 10,992 11,187 10,963 9 M8 1,474 1,582 1,518 9,736 10,439 10,022 10,065 10 T1.2 1,39 1,37 1,408 9,189 9,059 9,306 9,185 STT Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê Kết quả phân tích khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn One-way ANOVA: 8h ngày 1 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 0,0000 0,0000 0,00 1,000 Error 20 1,6147 0,0807 Total 29 1,6147 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 Vi sinh vật học K3 N 3 3 3 3 3 3 Mean 11,545 11,545 11,545 11,545 11,545 11,545 Grouping A A A A A A Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 T9 M3 M8 T1.2 Trường Đại học Cần Thơ 3 3 3 3 11,545 11,545 11,545 11,545 A A A A One-way ANOVA: 12h ngày 1 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 12,7840 1,4204 34,18 0,000 Error 20 0,8312 0,0416 Total 29 13,6151 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 10,851 10,294 11,543 11,2 11,918 11,918 12,457 12,371 11,308 11,016 Grouping E F C CD B B A A CD DE One-way ANOVA: 16h ngày 1 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 8,0942 0,8994 9,15 0,000 Error 20 1,9649 0,0982 Total 29 10,0591 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 Vi sinh vật học K3 N 3 3 3 3 3 3 Mean 11,058 10,41 10,935 11,235 11,012 11,28 Grouping BC D BCD B BC B Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 T9 M3 M8 T1.2 Trường Đại học Cần Thơ 3 3 3 3 10,55 10,753 11,844 12,179 CD BCD A A One-way ANOVA: 8h ngày 2 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 29,941 3,327 5,02 0,001 Error 20 13,252 0,663 Total 29 43,194 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 10,268 11,613 12,577 12,446 9,714 11,518 10,173 9,71 11,502 11,034 Grouping BCD AB A A D ABC CD D ABC BCD One-way ANOVA: 12h ngày 2 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 14,816 1,646 7,18 0,000 Error 20 4,583 0,229 Total 29 19,399 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 Vi sinh vật học K3 N 3 3 3 3 3 3 Mean 10,34 9,678 9,791 9,91 8,988 9,707 Grouping AB BCD BC B CDE BC Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 T9 M3 M8 T1.2 Trường Đại học Cần Thơ 3 3 3 3 8,206 9,684 8,866 10,773 E BC DE A One-way ANOVA: 16h ngày 2 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 3,6899 0,4100 4,75 0,002 Error 20 1,7275 0,0864 Total 29 5,4174 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu N Mean ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 10,056 9,145 9,728 9,537 9,532 8,912 8,907 9,315 9,525 9,717 Grouping A CD AB BC BC D D BCD BC AB One-way ANOVA: 8h ngày 3 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 16,908 1,879 17,60 0,000 Error 20 2,135 0,107 Total 29 19,043 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu N Mean ĐC 3 9,196 B M4 3 8,853 BC T6 3 10,105 M2.1 3 8,318 Vi sinh vật học K3 Grouping A CDE Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ T1.1 3 8,114 DE M2 3 7,773 E T9 3 8,211 DE M3 3 8,411 M8 3 8,029 T1.2 3 9,829 CD DE A One-way ANOVA: 12h ngày 3 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 13,111 1,457 10,69 0,000 Error 20 2,726 0,136 Total 29 15,837 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 9,098 7,519 7,389 8,413 6,956 7,871 6,799 8,333 7,676 7,558 Grouping A CD CDE B DE BC E B C CD One-way ANOVA: 16h ngày 3 versus mẫu Source DF SS MS F P mẫu 9 14,2461 1,5829 19,72 0,000 Error 20 1,6053 0,0803 Total 29 15,8514 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD mẫu ĐC M4 Vi sinh vật học K3 N 3 3 Mean 8,955 9,25 Grouping EF DE Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 T6 M2.1 T1.1 M2 T9 M3 M8 T1.2 Vi sinh vật học K3 3 3 3 3 3 3 3 3 Trường Đại học Cần Thơ 9,601 10,235 8,981 9,246 8,528 10,963 10,065 9,185 CD B EF DE F A BC DE Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... sinh Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm mạnh sẽ giúp ích cho vi c xử lý nước thải trong công nghiệp, sinh hoạt và các làng nghề truyền thống 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn triển vọng có khả năng phân giải đạm trong nước thải từ các làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng nhằm hướng tới vi c ứng dụng những dòng vi khuẩn này vào một số quy... đây, vi c làm bánh Pía hoàn toàn mang tính thủ công và phục vụ cho nhu cầu của từng gia đình Đến đầu thế kỷ 19, người đầu tiên làm bánh Pía để kinh doanh và truyền nghề cho con cháu sau này là ông Đặng Thuận sinh sống ở làng Vũng Thơm (nay là xã Phú Tâm, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng) Hình 2.1: Tân Huê Vi n - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng (Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp /vi- vn/13/117/117/35293/default.aspx,... quy trình xử lý nước thải và sản xuất chế phẩm Sinh học Vi sinh vật học K3 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về nghề làm bánh Pía Bánh pía có nguồn gốc từ bánh Trung Thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ) Bánh do một số người Minh Hương di cư sang Vi t Nam từ thế kỷ 17 mang... của quá trình xử lý nước thải trên tỷ lệ kháng kháng sinh ở Acinetobacter spp trong nước thải và nguồn nước sử dụng của nó Trong hai sự kiện khác nhau (nhiệt độ cao, dòng chảy cao, 31oC và nhiệt độ thấp, dòng thấp, 8oC), 366 chủng Acinetobacter spp được phân lập từ năm địa điểm khác nhau, ba nguồn trong một nhà máy xử lý nước thải (nguyên liệu vào, nước thải, nước thải cuối cùng) và hai nguồn trong... đồng hình với dòng Bacillus subtilis BL10 (99%) Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae 3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%) Cả 02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%) Trần Liên Hà et al.,(2007) bốn chủng vi khuẩn nitrate hóa được phân lập từ nước của 7 mẫu nước hồ và 2 mẫu đất... của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất) Nước thải công nghiệp là loại nước thải từ các nhà máy đang hoạt động sản xuất, phụ thuộc loại hình công nghiệp Nước thải công nghiệp nói chung khác nhau ở mỗi ngành nghề, ở mỗi cơ sở sản xuất Phụ thuộc vào quá trình sản xuất của mỗi làng nghề (nước rửa nguyên liệu, sản phẩm, thiết bị, nước thải trong quá trình chế biến) Đặc tính ô nhiễm và nồng độ của nước. .. của vi khuẩn Bacillus là một loại vi khuẩn không gây bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng đối kháng với các loại vi sinh vật khác để phục hồi thế cân bằng sinh thái của hệ vi khuẩn đường ruột Đặc biệt là khả năng hình thành bào tử rất cao Môi trường sống chủ yếu của vi khuẩn Bacillus là đất, nước và bùn có rất nhiều tế bào và bào tử (Greem et al., 1999) Hoàng Thùy Long (1991), Bacillus làm. .. kiểm tra catalase và oxidase Pseudomonas cũng cho kết quả âm tính với indol, methylred và Voges Proskauer Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi nhưng được tìm thấy chính ở trong đất và nước, ngoài ra còn tìm thấy trên động vật, thực vật, và nhiều dòng cũng được phân lập từ các mẫu bệnh lý Một số dòng Pseudomonas có khả năng khử nitrate: Pseudomonas fluoresens: trực khuẩn nhỏ, có... hoặc phân giải ra NH3, NH4(+) Khi phân giải các acid amin chứa S (như methionine, cystine, cysteine) vi sinh vật giải phóng ra H2S và nếu tích lũy nhiều trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng Khi phân giải tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon và scaton Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các acid amin có thể độc với người và gia súc, đáng chú ý là histamin,... được quan sát rất sớm trong lịch sử của ngành vi sinh vật học Tên Pseudomonas được đặt cho những loại sinh vật này, được xác định bằng những thuật ngữ khá mơ hồ vào năm 1984 như một giống vi khuẩn Gram âm, hình que và có chiên mao ở cực Pseudomonas được phân lập nhiều từ tự nhiên và một số lượng lớn các dòng giống nhau được cho là cùng Vi sinh vật học K3 23 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt