Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 78 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
78
Dung lượng
1,94 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
- - - - - -
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN PHÂN GIẢI ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI
LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP
HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN:
NGUYỄN HOÀI PHONG
MSSV: 3108498
LỚP: VSVH K36
Cần Thơ, tháng 12/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
- - - - - -
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN PHÂN GIẢI ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI
LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP
Cần Thơ, tháng 12/2013
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN HOÀI PHONG
MSSV: 3108498
LỚP: VSVH K36
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NUYỄN HỮU HIỆP
NGUYỄN HOÀI PHONG
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày..... tháng..... năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
LỜI CẢM TẠ
Trước tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành nhất đến cha mẹ và mọi người trong
gia đình đã có công nuôi dạy và luôn cổ vũ con đến ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học đã truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình theo học
tại Viện.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS-TS Nguyễn Hữu Hiệp đã
tận tình hướng dẫn, gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên
cứu và hoàn thành luận văn này.
Cảm ơn các anh chị tại phòng Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt là hai chị Nguyễn Thị Thúy Duy và
Trần Trà My và các bạn đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thí
nghiệm.
Xin cảm ơn tất cả những anh chị, những người bạn và những người em đã luôn
giúp đỡ, cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.
Xinh kính chúc cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị dồi dào sức khỏe! Chúc các bạn
của tôi báo cáo luận văn tốt đẹp! Chúc các em đạt kết quả tốt trong kỳ thi sắp tới!
Tp. Cần Thơ, ngày 6 tháng 12 năm 2013
Nguyễn Hoài Phong
TÓM LƯỢC
Ô nhiễm đạm là vấn đề đã và đang được quan tâm trong sử lý môi trường hiện
nay. Hàm lượng đạm cao trong nước thải ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thủy sinh
động-thực vật và đặc biệt là sức khỏe con người. Việc xử lý ô nhiễm đạm bằng vi
khuẩn phân giải đạm đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước.
Đề tài nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng
phân giải đạm cao từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Xác định khả
năng tạo enzyme protease trên môi trường MSB có bổ sung sữa gầy (2%) cho thấy
chín trong số mười tám dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng sinh enzyme protease,
khảo sát khả năng phân giải đạm bằng phương pháp đường chuẩn trên môi trường
Lewis đã tìm ra được ba dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng phân giải đạm cao
nhất là: M4, T1.1, T9. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S
ribosomal RNA kết hợp sử dụng phần mềm Blast trên ngân hàng gene NCBI cho thấy
hai dòng vi khuẩn này lần lược thuộc loài Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter
towneri.
Từ khóa: Bánh Pía, đạm amôn, vi khuẩn phân giải đạm, vi khuẩn Pseudomonas,
vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn Acinetobacter.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................
LỜI CẢM TẠ .............................................................................................................
TÓM LƯỢC
.............................................................................................................
MỤC LỤC
............................................................................................................ i
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv
CHƯƠNG 1:
GIỚI THIỆU .................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2.
Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2
CHƯƠNG 2:
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................. 3
2.1. Sơ lược về nghề làm bánh Pía ........................................................................... 3
2.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất) ................................ 4
2.3.
Khái quát quá trình amôn hóa ........................................................................ 4
2.3.1.
Quá trình amôn hóa protein..................................................................... 5
2.3.2.
Quá trình amôn hóa ure ........................................................................... 6
2.3.3.
Quá trình amôn hóa kitin......................................................................... 7
2.3.4.
Quá trình amôn hóa mùn ......................................................................... 8
2.4.
Đại cương về enzyme protease ...................................................................... 9
2.4.1.
Định nghĩa ............................................................................................... 9
2.4.2.
Nguồn thu nhận ..................................................................................... 10
2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme .... 11
2.4.4.
Ứng dụng ............................................................................................... 13
Một số giống vi khuẩn phân giải đạm tiêu biểu ........................................ 15
2.5.
2.5.1. Giống Acinetobacter ................................................................................. 15
2.5.2. Giống Bacillus ........................................................................................... 18
2.5.3. Giống vi khuẩn Pseudomonas ................................................................... 22
2.6.
Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới ....................................... 26
2.6.1.
Vấn đề môi trường ................................................................................ 26
Vi sinh vật học K36
i
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.6.2.
Trong nước ............................................................................................ 26
2.6.3.
Thế giới ................................................................................................. 28
CHƯƠNG 3:
3.1.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 30
Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 30
3.1.1.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 30
3.1.2.
Nguyên vật liệu ..................................................................................... 30
3.1.3.
Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 30
3.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu và hóa chất ......................... 30
3.2.
Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 31
3.2.1.
Phương pháp thu mẫu nước thải ........................................................... 31
3.2.2.
Phương pháp phân lập vi khuẩn khử đạm ............................................. 32
3.2.3.
Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn
phân lập ............................................................................................................... 32
3.2.4.
Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn phân giải đạm ................................ 35
3.2.5.
Định danh bằng kỹ thuật PCR ............................................................... 37
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 39
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................................... 39
4.1.1. Kết quả phân lập và địa điểm của các dòng vi khuẩn ............................... 39
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập .......................... 40
4.2. Đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn đã phân lập ..................................... 43
4.3. Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...................... 45
4.4. Khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn ............................................. 47
4.5. Nhận diện vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................ 49
CHƯƠNG 5:
5.1.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 53
Kết luận ........................................................................................................ 53
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 54
Vi sinh vật học K36
ii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Tân Huê Viên - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng ........ 3
Hình 2.2: Bánh Pía thành phẩm.................................................................................... 4
Hình 2.3: Tế bào vi khuẩn Bacillus sp. ...................................................................... 19
Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn Pseudomonas sp. ............................................................. 23
Hình 3.1: Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm............................................. 30
Hình 4.1: Mẫu cấy trải vi khuẩn trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar............ 40
Hình 4.2: Đặc điểm một số khuẩn lạc ròng phân lập được ........................................ 42
Hình 4.3: Khả năng di động của các dòng vi khuẩn trên môi trường Meat extractPepton bán đặc ......................................................................................................... 44
Hình 4.4: Hình nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập ......................................... 44
Hình 4.5: Hiện tượng sủi bọt khí khi nhỏ H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn phân lập ..... 46
Hình 4.6: Vòng sáng phân giải protein của các dòng vi khuẩn trên môi trường
MSB+2% sữa gầy ....................................................................................................... 46
Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR các dòng vi khuẩn phân lập ............................ 49
Hình 4.8: Kết quả blast DNA của M4 tương đồng với Acinetobacter radioresistens 50
Hình 4.9: Kết quả Blast DNA của T1.1 tương đồng với Acinetobacter towneri strain
CCM7201
Vi sinh vật học K36
......................................................................................................... 52
iii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Môi trường Meat Extract – pepton (MP) ................................................... 30
Bảng 3.2: Môi trường LB (Luria-Bertani) ................................................................. 31
Bảng 3.3: Môi Trường MSB + 2% Skim milk ........................................................... 31
Bảng 3.4: Môi Trường Lewis (1958) ......................................................................... 31
Bảng 4.1: Nguồn gốc vi khuẩn đã phân lập ............................................................... 39
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Meat
extract-Pepton-Agar ................................................................................................... 42
Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập............................. 45
Bảng 4.4: Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................ 47
Bảng 4.5: Hiệu quả phân giải đạm trong môi trường Lewis của các dòng vi khuẩn
phân lập theo thời gian (µg/ml) .................................................................................. 48
Vi sinh vật học K36
iv
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nước ta đang tiến hành Công Nghiệp Hóa – Hiện Đại Hóa đồng thời kéo theo đô
thị hóa đã và đang làm môi trường sống bị ô nhiễm nghiêm trọng. Theo ước tính của
Tổng cục Môi trường - Bộ Tài nguyên và Môi trường (2012) tổng thiệt hại kinh tế của
nước ta do ô nhiễm môi trường gây ra trong thời gian qua chiếm từ 1,5-3% GDP. Hầu
hết môi trường từ đất, nước, không khí, các khu dân cư, khu công nghiệp từ thành thị
đến nông thôn đã và đang bị xuống cấp, trở thành vấn đề bức xúc của toàn xã hội. Tại
thành phố Hồ Chí Minh có 25 khu công nghiệp tập trung hoạt động với tổng số 611
nhà máy trên diện tích 2298 ha đất. Theo kết quả tính toán, hoạt động của các khu
công nghiệp này cùng với 195 cơ sở trọng điểm bên ngoài khu công nghiệp, thì mỗi
ngày thải vào hệ thống sông Sài Gòn - Đồng Nai tổng cộng 1.740.000 m3 nước thải
công nghiệp, trong đó có khoảng 671 tấn cặn lơ lửng, 1.130 tấn BOD5 (làm giảm nhu
cầu oxy sinh hoá), 1789 tấn COD (làm giảm nhu cầu oxy hoá học), 104 tấn Nitơ, 15
tấn photpho và kim loại nặng. Lượng chất thải này gây ô nhiễm cho môi trường nước
của các con sông vốn là nguồn cung cấp nước sinh hoạt cho một địa bàn dân cư rộng
lớn, làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật và hệ sinh thái vốn là tác nhân thực hiện quá
trình phân huỷ và làm sạch các dòng sông.
Ở Sóc Trăng, số doanh nghiệp vừa và nhỏ là 2.290 doanh nghiệp và đóng một vai
trò quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế - xã hội. Sự phát triển doanh nghiệp
vừa và nhỏ ở các ngành nghề sản xuất (đặc biệt là việc phát triển các làng nghề truyền
thống như: làng cá xã Trung Bình (Long Phú), làng nghề hầm than củi xã Xuân Hòa
(Kế Sách), làng nghề bánh Pía, lạp xưởng xã Phú Tâm (Châu Thành)...), dịch vụ theo
thế mạnh của địa phương trong những năm gần đây tạo được thêm nhiều việc làm cho
người lao động, do đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho người lao động. Bên cạnh
đó việc ô nhiễm môi trường phát sinh từ phần lớn các cơ sở chế biến sản xuất phát
triển tự phát, có từ lâu đời, với qui mô sản xuất thủ công nhỏ lẻ, công nghệ lạc hậu,
không có thiết bị xử lý chất thải, khí thải. Chế biến thực phẩm là một trong những loại
hình sử dụng nước tương đối lớn, mức độ nước thải ô nhiễm hữu cơ cao và phụ thuộc
vào công nghệ và nguyên liệu sản xuất. Nhưng phần lớn lượng nước thải được đưa
trực tiếp ra nguồn nước mà không qua hệ thống xử lý nước thải, làm ảnh hưởng đến
sức khỏe của người dân xung quanh, làm giảm số lượng sinh vật thủy sinh,...
Vi sinh vật học K3
1
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Từ đó việc đưa ra các biện pháp xử lý nước thải từ các làng nghề ngày càng trở
nên cấp thiết đối với các cấp quản lý và các nhà khoa học. Các nhà nghiên cứu khoa
học và bảo vệ môi trường đã và đang không ngừng tìm hiểu, đề xuất, áp dụng mọi
phương pháp vật lý, hóa học và sinh học nhằm mục đích tăng cường việc làm giảm
mức độ ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao nhận thức về việc sử dụng, bảo vệ đi
đôi với việc tái sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên. Việc xử lý nước thải bằng các
biện pháp sinh học, sử dụng những vi sinh vật có khả năng phân hủy hoặc kết tụ các
chất hữu cơ và vô cơ có trong nước thải thành những chất ít gây hại, dễ dàng thu gom
và xử lý hoặc có thể thu được khí sinh học để sử dụng, nước thải sau khi qua xử lý có
thể cho trực tiếp vào môi trường tự nhiên mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của
người dân cũng như các sinh vật thủy sinh. Phân lập và định danh một số dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải đạm mạnh sẽ giúp ích cho việc xử lý nước thải trong
công nghiệp, sinh hoạt và các làng nghề truyền thống.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn triển vọng có khả năng phân
giải đạm trong nước thải từ các làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng nhằm hướng tới
việc ứng dụng những dòng vi khuẩn này vào một số quy trình xử lý nước thải và sản
xuất chế phẩm Sinh học.
Vi sinh vật học K3
2
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về nghề làm bánh Pía
Bánh pía có nguồn gốc từ bánh Trung Thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều
lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ). Bánh do một số người Minh Hương di cư sang
Việt Nam từ thế kỷ 17 mang theo. Trước đây, việc làm bánh Pía hoàn toàn mang tính
thủ công và phục vụ cho nhu cầu của từng gia đình. Đến đầu thế kỷ 19, người đầu tiên
làm bánh Pía để kinh doanh và truyền nghề cho con cháu sau này là ông Đặng Thuận
sinh sống ở làng Vũng Thơm (nay là xã Phú Tâm, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng).
Hình 2.1: Tân Huê Viên - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng
(Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx, ngày
21/07/2013)
Bánh Pía Sóc Trăng có hương vị rất đặc trưng, đó là mùi thơm của sầu riêng, vị
béo của hột vịt muối (trứng vịt muối), vị bùi của đậu xanh, khoai môn, và thơm mùi
bột mì của vỏ bánh nướng vàng.
Vi sinh vật học K3
3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Hình 2.2: Bánh Pía thành phẩm
(Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx, ngày
21/07/2013)
2.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất)
Nước thải công nghiệp là loại nước thải từ các nhà máy đang hoạt động sản xuất,
phụ thuộc loại hình công nghiệp.
Nước thải công nghiệp nói chung khác nhau ở mỗi ngành nghề, ở mỗi cơ sở sản
xuất. Phụ thuộc vào quá trình sản xuất của mỗi làng nghề (nước rửa nguyên liệu, sản
phẩm, thiết bị, nước thải trong quá trình chế biến)
Đặc tính ô nhiễm và nồng độ của nước thải công nghiệp rất khác nhau phụ thuộc
vào loại hình công nghiệp và chế độ công nghệ lựa chọn.
Nước thải chế biến có chứa hàm lượng cặn lơ lửng và chất hữu cơ rất cao,
thường có lượng oxy hòa tan tương đối thấp. Thành phần nước thải chế biền gồm tinh
bột, đường, protein, cellulose, các khoáng chất và độc tố công nghiệp,…
* Đặc điểm nước thải của cơ sở sản xuất bánh Pía:
Màu sắc: Trắng
Mùi: Thối
Độ đục: Rất đục
2.3. Khái quát quá trình amôn hóa
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có
chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều
loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất
Vi sinh vật học K3
4
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh
vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng
tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó,
chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đồng hóa. Các sản phẩm
đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S.
Bao gồm: quá trình amôn hóa bùn, amôn hóa Protein, quá trình amôn hóa Urê, acid
Uric, Xianamit Canxi, Kitin.
2.3.1. Quá trình amôn hóa protein
2.3.1.1. Khái niệm
Protein là thành phần cơ bản của nguyên sinh chất tế bào, chứa khoảng 15-17,6%
N (tính theo chất khô). Protein thường xuyên được đưa vào đất với một số lượng lớn
cùng với xác động, thực vật, phân chuồng, rác,...
Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (protein) để tạo ra NH 3
cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng dưới tác dụng của các loài sinh vật được gọi là quá
trình amôn hóa protein.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí.
Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài
trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các
xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống
Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá
trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được
thực hiện bởi các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.
2.3.1.2. Các loại vi sinh vật phân giải protein
Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải protein, chẳng hạn:
Nấm mốc: Aspergillus candidus, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae,
Fusarium solani, Mucor pusillus,...
Nấm men: Candida albicans, Endomycopsis fibuligera, Saccharomyces
carlsbergensis,...
Vi khuẩn: Bacillus cereus, Bacillus pasteurianus, Bacillus subtilis, Aeromonas
hydrophyla, Pseudomonas aeruginosa,...
Vi sinh vật học K3
5
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Xạ khuẩn: Streptomyces erythreus, Streptomyces griseus, Thermonospora fusca,
Thermonospora vulgaris,...
Trong điều kiện: nhiệt độ: 25 – 35oC; pH: 4.5 - 9; độ ẩm: 30 - 60%; với sự xúc tác của
enzyme protease sẽ diễn ra quá trình phân giải protein.
2.3.1.3. Cơ chế phân giải protein
Để phân giải protein các vi sinh vật này phải có enzyme protease ngoại bào. Các
enzyme này xúc tác cho quá trình thủy phân protein thành các hợp chất phân tử nhỏ
hơn (các polipeptide và oligopeptide). Các chất này tiếp tục phân giải thành các acid
amin hoặc hấp thụ ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành acid amin.
Một phần trong số các acid amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng
hợp protein của chúng, một phần khác tiếp tục phân giải để tạo ra NH3, CO2, H2S và
nhiều sản phẩm trung gian khác. Các vi sinh vật không có khả năng sinh enzyme phân
giải protein ngoại bào, không có khả năng đồng hóa các protein thiên nhiên mà chỉ có
thể sử dụng các sản phẩm thủy phân của protein (polipeptide, oligopeptide, acid amin).
Protein
Protease
Peptidase
Oligopeptit và polipeptit
acid amin
hấp thụ hoặc
phân giải ra NH3, NH4(+)
Khi phân giải các acid amin chứa S (như methionine, cystine, cysteine) vi sinh
vật giải phóng ra H2S và nếu tích lũy nhiều trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng.
Khi phân giải tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là
indon và scaton.
Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các acid amin có thể độc
với người và gia súc, đáng chú ý là histamin, acmatin, putrexin, cadavein.
2.3.2. Quá trình amôn hóa ure
2.3.2.1. Khái niệm
Urê là một loại hợp chất hữu cơ đơn giản chứa 46,6% N, được sản xuất trong các
nhà máy phân bón bằng cách tổng hợp:
Lượng hữu cơ được vùi vào đất rất lớn, hàm lượng dinh dưỡng các chất này nằm
trong đất khá nhiều nhưng cây trồng không thể hấp thụ được trực tiếp từ các chất hữu
cơ đó, mà phải thông qua quá trình phân hủy và chuyển hóa của các loài vi sinh vật để
thành các chất dinh dưỡng dễ tiêu cây trồng mới hấp thụ được. Nếu không có quá trình
Vi sinh vật học K3
6
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
amôn hóa thì dù có giàu hữu cơ đến đâu cũng đều vô hiệu với cây trồng và càng gây
độc hại cho môi trường sinh thái.
Đơn giản nhất đó là lượng ure chứa trong nước tiểu. Người ta đã tính rằng, trong
nước tiểu có khoảng 2% ure. Mỗi ngày một người lớn thải ra khoảng 1,2 lít nước tiểu,
chứa khoảng 30g ure. Vậy nhân loại mỗi ngày thải ra hàng vạn tấn ure, đó là chưa kể
lượng ure do các loại động vật thải ra.
2.3.2.2. Cơ chế của quá trình amôn hóa ure
Dưới tác dụng của men urease do các loài vi sinh vật tiết ra làm xúc tác cho quá
trình chuyển hóa ure.
CO(NH2)2+ 2H2O
(NH4)2CO3
VSV
Urease
(NH4)2CO3
2NH3+ CO2+ H2O
Vi khuẩn ure có khả năng phân giải acid uric và xianamit canxi. Sau đó các sản
phẩm ure lại được phân giải như phương trình trên để giải phóng ra NH3.
2.3.2.3. Các loại vi sinh vật phân giải ure
Paster (1862) là người đầu tiên đã phát hiện ra vi khuẩn phân giải ure. Cho đến
nay người ta đã phát hiện và phân lập được rất nhiều chủng vi khuẩn: Planosarcina
ureae, Micrococcus eurae, Sarcina hansenii, Bacillus pasteurii, B. hesmogenes, B.
psichrocatericus, B. amylovorum, Pseudobacterium eruolyticum, Chromobacterium,
Proteus vulgaris.
Nhiều loại nấm mốc và xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải ure.
Vi khuẩn phân giải ure thường thuộc loại háo khí hoặc kỵ khí không bắt buộc,
chúng phát triển tốt ở pH = 6,5 –8,5.
2.3.3. Quá trình amôn hóa kitin
2.3.3.1. Khái niệm chung
Kitin là hợp chất cao phân tử bền vững. Cấu trúc của kitin gần với cấu trúc của
cellulose, nhưng trong phân tử các gốc glucose, người ta thấy gốc hydroxin ở nguyên
tử C thứ hai được thay thế bằng những gốc amin đã được acetin hóa.
Kitin có mặt trong thành tế bào của nhiều loại nấm (nhất là Acomycetes và
Basidimomycetes), trong vỏ của nhiều loại côn trùng.
Vi sinh vật học K3
7
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Hàng năm có tới hàng triệu tấn kitin của giáp xác hình thành trong các đại
dương. Kitin cũng có số lượng không nhỏ trong đất.
Với khối lượng lớn như vậy, nhờ có các loài vi sinh vật, kitin được phân giải và
chuyển hóa để thành các chất hữu cơ đơn giản, sau đó lại tiếp tục phân giải để cho ra
các dinh dưỡng cung cấp cho cây trồng.
2.3.3.2. Những vi sinh vật phân giải kitin
Có rất nhiều loài vi sinh vật phân giải kitin như:
Vi khuẩn gồm:
Achromobacter, Flavobacterium,
Bacillus,
Cytophaga,
Pseudomonas, Nocardia, Micromonospora.
Nấm gồm: Aspergillus, Mortierella.
Xạ khuẩn: Streptomyces gricecus.
2.3.4. Quá trình amôn hóa mùn
2.3.4.1. Khái niệm
Mùn là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ phì của đất, là chất vô định hình,
màu tối, khi bị vi sinh vật phân giải nó cho các chất hữu cơ như: lipit, sáp, glucide,
protein,...
Cứ 1 ha đất canh tác ở tầng 0 –20 cm có khoảng 30 –300 tấn mùn, tương ứng với
mùn chứa khoảng 1,5 –15 tấn nitơ. Loại đất hữu cơ có tới 20% mùn, loại đất bạc màu,
đất đồi feralit chỉ có 0,3 –0,5% mùn. Đất ở vùng thung lũng, rừng núi thường chứa
hàm lượng mùn cao hơn ở vùng đồng bằng, trung du.
Song hàm lượng mùn nhiều hay ít mà không được các loài vi sinh vật phân giải,
chuyển hóa thì không có ý nghĩa dinh dưỡng đối với cây trồng.
2.3.4.2. Thành phần mùn
Theo Nikitin (1960) thì trong chất mùn tự nhiên của đất Secnozem (đất
xám) có chứa các thành phần sau:
Carbohydrat:
1,3%
Hemicellulose:
3,0%
Cellulose:
0,4%
Lignin:
4,2%
Acid humic:
29,6%
Vi sinh vật học K3
8
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Acid fulvic:
22,0%
Humin:
36,5%
Vi sinh vật
Chất mùn + O2
NH3 + CO2 + Q
2.3.4.3. Các vi sinh vật phân giải mùn
Phân giải chất mùn có rất nhiều các loài sinh vật đất tham gia, kể cả háo khí và
yếm khí: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nguyên sinh động vật (các loại trùng).
2.4. Đại cương về enzyme protease
2.4.1. Định nghĩa
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên
kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít
peptide ngắn, pepton.
Phản ứng thủy phân bởi enzyme có thể biểu diễn theo sơ đồ:
A – B + H2 O
(Cơ chất + H2O
Enzyme
Protease
AH + BOH
Sản phẩm)
Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân. Nhưng do
trong phản ứng thủy phân lượng nước rất lớn và coi như không đổi trong suốt quá
trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân
bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. Trong quá trình phản ứng, các phân tử
cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các
phân tử khác.
Cần lưu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản ứng
chính nhưng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ như: trong phản
ứng thủy phân protein thành acid amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng phân huỷ
acid amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các hợp chất
màu…
Vi sinh vật học K3
9
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.4.2. Nguồn thu nhận
2.4.2.1. Từ thực vật
Có ba loại protease thực vật như: Bromelain, Papin và Ficin. Papin thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa
trắng của bia khi làm lạnh (chilling prooring) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác
của protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm
mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus caria).
Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên.
2.4.2.2. Từ động vật
Protease động vật thường có ở tuỵ tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày,…
Gồm:
- Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số enzyme khác có ở tuỵ tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ.
- Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.
- Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.4.2.3. Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có
thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dược.
Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, Harley (1960) đã phân loại
các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau:
- Protease serine
- Protease kim loại
- Protease acid
- Protease thiol.
Vi sinh vật học K3
10
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme
- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ
enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm.
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ
chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ
chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng.
Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng
độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng. Vì vậy, với
từng Enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể,
cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme.
- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa
Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và
hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (chất
kìm hãm) hoạt độ enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu
và thay đổi tùy từng chất, tùy từng enzyme.
Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm
cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các chất này
có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein.
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho
enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thường
có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu
cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực
tiếp hoặc gián tiếp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme
không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng
đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và
dẫn đến mức triệt tiêu.
Vi sinh vật học K3
11
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ
lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp.
Ở nhiệt độ thấp (0-41oC), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng
vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.
Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 45oC), vận tốc phản
ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80-100oC.
Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH,
lực ion của môi trường.
- Ảnh hưởng của pH môi trường pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến
quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và
đến độ bền của protein enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 5-9, độ bền của
enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như: cơ chất, coenzyme, Ca2+…
Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều
yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…
Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một
số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật,…) hoặc khá
cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10.
- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay
ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian
thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản
phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết,
quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất
cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt.
Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh
nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể.
- Ảnh hưởng của lượng nước
Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán
enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước có ảnh hưởng đến tốc độ
Vi sinh vật học K3
12
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Vì thế, nước là một yếu tố điều
chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế các phản ứng
do enzyme xúc tác.
2.4.4. Ứng dụng
2.4.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm
- Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm
quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng
động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các
dạng dịch thuỷ phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá.
- Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease
sử dụng để làm trong dịch quả, dịch bia tạo điều kiện cho quá trình lọc.
- Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat.
- Sản xuất nước chấm: nước mắm, tương, chao,…
- Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản phẩm
có giá trị thấp, như: dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công nghiệp
thực phẩm (xương, collagen,…) thành các dạng hoà tan thu dịch đạm thủy phân cho
người hoặc thức ăn chăn nuôi.
- Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá hoặc để tinh chế
guanine.
2.4.4.2. Trong công nghiệp dệt
Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không
ảnh hưởng đến độ bền của tơ.
2.4.4.3. Trong công nghiệp phim ảnh
Protease được dùng để sản xuất gellatin phủ trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái
sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X-quang.
2.4.4.4. Trong công nghiệp da
Protease được dùng để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông
thu hồi và tỷ lệ thu hồi tăng 25-30% so với khi dùng phương pháp hoá học, da có chất
lượng cao.
Vi sinh vật học K3
13
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.4.4.5. Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ
phẩm
Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, thuốc đánh răng, để tẩy sạch các
vết máu mủ hoặc bổ sung protease vào kem bôi mặt, có tác dụng loại được các lớp
biểu bì chết, làm mịn da.
2.4.4.6. Trong công nghiệp dược phẩm
Protease được dùng để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hoá,
thuốc tiêu mủ ở các vết thương và giảm đau cho người bệnh.
2.4.4.7. Trong xử lý ô nhiễm môi trường
Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung
dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease
thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ
lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptide tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau
đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự
khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất
trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để
những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử
lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi
không còn mùi hôi thối. Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được
coi như là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ hoàn
toàn. Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng
các enzyme thuỷ phân, như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có
dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làm thức ăn.
Protease ngoại bào được tiết ra từ Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium,
Pseudomonas marinoglutinosa và Acromonas hydrophila có thể cố định trong canxi
alginate để thực hiện các phản ứng liên tục thu được sản lượng cao trong các phản ứng
thủy phân thịt cá.
Vi sinh vật học K3
14
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.5. Một số giống vi khuẩn phân giải đạm tiêu biểu
2.5.1. Giống Acinetobacter
Phân loài: (Brisou và prévot, 1954)
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Moraxellaceae
Giống: Acinetobacter
Giống Acinetobacter đã được biết đến trong nhiều năm, thường dưới tên chung
khác. Chi tiết lịch sử và danh pháp của chúng được tìm thấy (Dijkshoorn, 1996;
Towner, 1996), hay theo các chương trong cuốn sách xuất hiện chứng tỏ sự quan tâm
ngày càng tăng và tầm quan trọng của nhóm vi khuẩn này (Bergogne - Bérézin et al,
1996).
Về sinh lý, giống Acinetobacter có dạng hiếu khí, không di động, catalase dương
tính và oxidase âm tính. Chúng phát triển tốt trên môi trường phức tạp và có thể phát
triển trên môi trường khoáng đơn giản với một nguồn carbon duy nhất, bao gồm:
acetate, các axit béo, và đôi khi hydrocarbon. Ngoài ra, hầu hết các thành viên của
Acinetobacter điều tăng trưởng tốt trên môi trường thạch MacConkey chỉ ngoại lệ với
một số chủng A. lwoffii (Bergogne - Bérézin và Towner, 1996). Giống Acinetobacter
đã và đang thu hút sự quan tâm trong các ứng dụng về môi trường và công nghệ sinh
học. Một số chủng của chi này được biết là có liên quan đến việc phân hủy sinh học
của một số chất gây ô nhiễm khác nhau như: biphenyl clo và biphenyl, axit amin
(analine), phenol, benzoat, dầu thô, acetonitrile, và trong việc loại bỏ phosphate hoặc
các kim loại nặng. Chủng Acinetobacter cũng hiện diện ở giữa các vi khuẩn lên men
để sản xuất một số sản phẩm enzyme bên ngoài ngoài và bên trong tế bào như: lipase,
protease, cyanophycine, bioemulsifiers và một số loại biopolymers. Trọng tâm của
đánh giá này, do đó, liên quan đến việc sử dụng của một số chủng Acinetobacter như
một biocatalyst để khắc phục ô nhiễm môi trường khác nhau và các ứng dụng công
nghệ sinh học khác. Một số có thể dễ dàng biến dạng bởi chiết xuất DNA, là đối tượng
hấp dẫn cho các thao tác di truyền và các nghiên cứu về tổ chức và gen quy định.
Vi sinh vật học K3
15
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Acinetobacter spp. được coi là phổ biến, đã được tìm thấy trong nhiều môi
trường như đất, khí và nước muối, một số môi trường khắc nghiệt (đặc biệt là dòng
chất thải và môi trường ô nhiễm), kết hợp với thực vật và động vật (kể cả con người),
trên rau và các thực phẩm khác. Chúng có thể hình thành màng sinh học và tồn tại trên
bề mặt khô trong thời gian dài. Chúng trao đổi chất rất linh hoạt (ví dụ như: khả năng
phân huỷ một loạt các hợp chất hữu cơ hoặc giải độc kim loại nặng), khả năng tổng
hợp các sản phẩm sinh học khác nhau với mục đích thương mại tiềm năng (ví dụ
như: bioemulsans, biodispersants, men, kháng sinh chống nấm), và khả năng để thúc
đẩy tăng trưởng thực vật và đối kháng tác nhân gây bệnh, đã dẫn đến việc sử dụng
chúng hoặc đề nghị sử dụng chúng cho một số ứng dụng môi trường (ví dụ như: xử lý
sinh học của các nơi bị nhiễm hydrocarbon và các kim loại nặng) và các ứng dụng
nông nghiệp (ví dụ như: thực vật tăng trưởng thúc đẩy vi khuẩn hoặc các tác nhân
kiểm soát sinh học đối với tác nhân gây bệnh nấm và vi khuẩn của thực vật).
Đánh giá tác động của quá trình xử lý nước thải trên tỷ lệ kháng kháng sinh ở
Acinetobacter spp. trong nước thải và nguồn nước sử dụng của nó. Trong hai sự kiện
khác nhau (nhiệt độ cao, dòng chảy cao, 31oC và nhiệt độ thấp, dòng thấp, 8oC), 366
chủng Acinetobacter spp. được phân lập từ năm địa điểm khác nhau, ba nguồn trong
một nhà máy xử lý nước thải (nguyên liệu vào, nước thải, nước thải cuối cùng) và hai
nguồn trong cơ quan tiếp nhận (phía thượng lưu và hạ lưu của các điểm xả nước thải
xử lý). Các kiểu hình nhạy cảm với kháng sinh được xác định theo phương pháp discdiffusion cho 8 loại thuốc kháng sinh, amoxicillin/clavulanic acid (AMC),
chloramphenicol (CHL), ciprofloxacin (CIP), colistin (CL), gentamycin (GM),
rifampin (RA), sulfisoxazole (SU), và trimethoprim (TMP). Tỷ lệ kháng kháng sinh
trong Acinetobacter cho ra AMC, CHL, RA, và nhiều loại thuốc (kháng sinh ba hoặc
hơn) tăng lên đáng kể (pb0.01) từ các mẫu nguyên liệu vào (AMC, 8,7%; CHL, tăng
25,2%; RA, 63,1%; nhiều loại thuốc, 33,0%) với mẫu nước thải cuối cùng (AMC,
37,9%; CHL, 69,0%; RA, 84,5%; nhiều loại thuốc, 72,4%), và cao hơn đáng kể (pb
0,05) trong mẫu hạ nguồn (AMC, bằng 25,8%; CHL, 48,4%; RA, 85,5%; nhiều loại
thuốc, 56,5%) so với mẫu thượng nguồn (AMC, 9,5%; CHL, 27,0%; RA, 65,1%;
nhiều loại thuốc, 28,6 %). Những kết quả này cho thấy quá trình xử lý nước thải góp
phần gia tăng có chọn lọc các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh và sự xuất hiện của vi
khuẩn kháng nhiều loại thuốc trong môi trường nước.
Vi sinh vật học K3
16
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Điều kiện phát triển:
Hầu hết các chủng Acinetobacter có thể phát triển trên môi trường khoáng đơn
giản có chứa carbon và nguồn năng lượng. Phần lớn các giống Pseudomonads phân lập
hoại sinh trong đó chúng có thể sử dụng bất kỳ một trong phạm vi rộng lớn của các
hợp chất hữu cơ. Một số chủng Acinetobacter, đặc trưng bởi sự phổ dinh dưỡng tương
đối hẹp, đã được tìm thấy trong nhiễm trùng bệnh viện, trong khi những người khác
với một số lượng gene giàu được tìm thấy trong môi trường khác nhau. Các hợp chất
chuyển hóa bởi các thành viên của chi Acinetobacter bao gồm rượu có hợp chất béo,
một số axit amin, axit béo và decarboxylic, hydrocarbon không phân nhánh, một số
chất đường, và nhiều hợp chất tương đối bền như 2,3 butanediol, benzoat, mandelate,
n-hexadecan, cyclohexanol, cresol, và khử trùng bằng clo hợp chất phenol (Towner,
1996). Những đặc điểm linh hoạt dựa trên một số con đường sinh hóa bất thường.
Mặc dù hầu hết các chủng không thể sử dụng glucose như một nguồn carbon,
nhiều loài có thể bị oxy hóa một phần nhiều monosaccharides (glucose, galactose,
mannose, xylose và arabinose ribose). Ví dụ, Acinetobacter sp. ADP1 có thể phát triển
trên đường như nguồn carbon duy nhất mặc dù thiếu các gen quan trọng cho sự đồng
hóa glucose (glucokinase, hexokinase và hệ thống phosphotransferase). Cách duy nhất
rõ ràng sinh vật này có thể sử dụng glucose là bởi một quá trình oxy hóa periplasmic,
thông qua một giới hạn màng glucose (Barbe et al., 2004). Theo nghiên cứu của Smith
et al.,(2004) đưa ra giả thuyết rằng Acinetobacter sp. có thể đã phát triển một mối quan
hệ hiệp đồng với nấm men để tạo điều kiện sử dụng glucose.
Hầu hết các chủng Acinetobacter không thể giảm bớt nitrate thành nitrite, nhưng
cả hai nitrate và nitrite có thể được sử dụng như là nguồn nitơ bằng cách đồng hoá
nitrate bằng men khử. Khả năng amoni hoá nitơ hữu cơ đã được báo cáo. Phân tích bộ
gen hoàn chỉnh của Acinetobacter ADP1 tiết lộ rằng các gen mã hóa cho protein tham
gia vào sự đồng hoá nitrate hình thành từ một cluster (Barbe et al., 2004).
Các thuộc tính sinh lý:
Acinetobacter spp. là vi khuẩn Gram âm, do đó có một lớp màng bên ngoài để
bảo vệ các tế bào và điều hòa tất cả các tương tác vi khuẩn trong môi trường. Thành
phần chủ yếu của màng tế bào bên ngoài là lipopolysaccharide (LPS), một phân tử
phức tạp bao gồm ba phần: một lipid được gắn vào trong màng bên ngoài, một
polysaccharide trung tâm và một chuỗi O bên, O- kháng nguyên. Các phân tử
Vi sinh vật học K3
17
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài của các loài Acinetobacter khác nhau rất
khó thấy nhưng quan trọng từ Enterobacteria. Thành phần của chúng làm cho chúng
kháng được thủy phân acid, có thể phù hợp với các sinh vật hình thành các acid hữu cơ
từ glucose. Hơn nữa, LPS của chúng được tự do giải phóng vào môi trường bên ngoài,
đặc biệt là khi các tế bào được phát triển trên nền kỵ nước (Borneleit và Kleber, 1991).
LPS là yếu tố quyết định lớn của độc trong loài gây bệnh, chủ yếu một phần từ chất
béo của chúng. Trong một chủ bị nhiễm, LPS được gọi là nội độc tố, nó hoạt động như
một chất kích thích mạnh của phản ứng viêm. Cấu trúc của một số polysaccharides Okháng nguyên và đặc tính kháng nguyên của chúng đã được công bố làm cho chúng có
sẵn như chemotaxonomic hữu ích và đánh dấu kháng nguyên cho việc xác định và
phân biệt chủng Acinetobacter. Đáng chú ý, Acinetobacter sp. ADP1 không có Okháng nguyên (Barbe et al., 2004).
Màng ngoài có chứa các protein điều hoà vận chuyển xuyên màng của các phân
tử. Các phân tử nhỏ như monosaccharides có thể nhập vào các tế bào vi khuẩn thông
qua Porins. Tuy nhiên, lượng phân tử lớn hơn đòi hỏi phải vận chuyển cụ thể. Có tầm
quan trọng lâm sàng đáng kể, một biểu hiện thay đổi của protein màng tế bào bên
ngoài và bơm bên ngoài này góp phần multiresistance kháng sinh của trực khuẩn
Gram âm (Thomson và Bonomo, 2005). Protein khác của màng ngoài có liên quan đến
độc tính. Các protein màng ngoài 38 (Omp38) có thể hoạt động như một yếu tố độc
lực tiềm năng để tạo ra quá trình apoptosis của các tế bào biểu mô trong giai đoạn đầu
của nhiễm trùng A. baumannii. Protein màng ngoài khác liên quan đến tính độc hại là
các protein màng ngoài sắt có quy định. Protein OM73-like và Fata-like đã được tìm
thấy trong chủng A. baumannii. Chúng đóng góp vào hiệu quả của các vi khuẩn sử
dụng sắt, và do đó góp phần vào độc lực của một chủng đặc biệt (Dorsey et al., 2003).
Hệ thống gel SDS-polyacrylamide đã được sử dụng cho việc nghiên cứu bên ngoài
màng hồ sơ protein của chủng lâm sàng của A. baumannii (Cuenca et al., 2003).
2.5.2. Giống Bacillus
Phân loài:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Vi sinh vật học K3
18
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus truy cập ngày 10/10/2013)
Hình 2.3: Tế bào vi khuẩn Bacillus sp.
(Nguồn: http://www.psmicrographs.co.uk/bacteria-cells--bacillus-sp--/scienceimage/13961b-bacillus, ngày 18/11/2013)
Vi khuẩn Bacillus đã được nhiều nhà khoa học quan tâm chú ý bởi tính năng về
ứng dụng của chúng. Người Nhật hơn 400 năm nay đã biết sử dụng Bacillus subtilis để
lên men một món ăn truyền thống ”Itohiki-Natto”. Ở phương Tây đã sản xuất protease
kiếm từ Bacillus licheniformis dùng trong bột giặt, sản xuất α-amylase biến tinh bột
thành siro bắp giàu fructose. Các vi khuẩn Bacillus còn là nguồn cung cấp nhiều loại
kháng sinh, các chất làm tăng hương vị như purine nucleoside, surfactan... Các phẩm
chất về công nghệ sinh học này, cùng với khả năng tạo bào tử và nảy mầm đã làm
Bacillus trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn Gram dương (Lê Thị
Lan, 1997).
Hầu hết các vi khuẩn Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu khí, chúng
được phân lập dễ dàng từ đất hoặc từ không khí. Khi xử lý mẫu bằng nhiệt độ, các tế
bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ phá hủy, trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn
sống (Nguyễn Đình Bảng et al., 1992).
Vi sinh vật học K3
19
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Các vi khuẩn thuộc giống Bacillus thường mọc tốt trên môi trường có nguồn
carbon duy nhất là đường, acid hữu cơ, rượu,… Với nguồn nitơ duy nhất là
ammonium, ngoài ra có một số dạng phân lập cần bổ sung vitamin để tăng trưởng.
Chúng có thể sử dụng các sản phẩm enzyme thủy giải ngoại bào do quá trình phân giải
polysaccharide, acid nucleic và lipid làm nguồn carbon và chất cho điện tử. Nhiều trực
khuẩn thuộc loại này còn có khả năng sản xuất kháng sinh như: gramicidin, bacitracin,
circulin, polymycin, tyrocidin. Hầu hết việc tạo kháng sinh đều có liên quan đến quá
trình bão hòa và kháng sinh được giải phóng ở giai đoạn tế bào bước vào pha tăng
trưởng ổn định sau khi chuyển sang bào tử hóa (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978).
Bacillus có ít cho sự sinh trưởng của thực vật bằng cách giúp đỡ thực vật ngăn
ngừa bệnh tật, kiểm soát một vài loại bệnh do nấm thường gặp ở ngũ cốc, trái cây và
rau củ, do nó tiết ra các kháng sinh chống nấm của vi khuẩn. Bacillus là một loại vi
khuẩn không gây bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng đối kháng với các
loại vi sinh vật khác để phục hồi thế cân bằng sinh thái của hệ vi khuẩn đường ruột.
Đặc biệt là khả năng hình thành bào tử rất cao. Môi trường sống chủ yếu của vi khuẩn
Bacillus là đất, nước và bùn có rất nhiều tế bào và bào tử (Greem et al., 1999).
Hoàng Thùy Long (1991), Bacillus làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh
enzyme: protease, amylase, cellulose, catalase,… phân hủy chất hữu cơ và kiểm soát
sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.
Nguyễn Lân Dũng (1997), Bacillus là trực khuẩn gram dương, di động, kích
thước 0,7-0,8 x 2-3µm và chịu nhiệt độ cao.
2.5.1.1. Bacillus subtilis
Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi
Henrry tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có
nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy
trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng
rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005).
Đặc điểm
Vi sinh vật học K3
20
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
- Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5-0,8
µm x 1,5-3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có
8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích
thước từ 0,8-1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,
không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô
Minh Châu, 2000).
- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Sinh lý:
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37oC
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát
triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0-7,4
Sinh hóa:
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose,
xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3(+), catalase (+), amylase (+), casein
(+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá
Kết quả
Hoạt tính catalase
+
Sinh indol
-
MR
+
VP
+
Sử dụng citrate
+
Khử nitrate
+
Hóa lỏng gelatin
+
Di động
+
Phân giải tinh bột
+
Arabinose
+
Xylose
+
Vi sinh vật học K3
21
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Saccharose
+
Mannitol
+
Glucose
+
Lactose -Maltose
+
Đặc điểm bào tử và khả năng tạo bào tử
- Đặc điểm bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều
lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà
tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế
bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể
giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh
lý.
- Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo
chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong
môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc
đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại
một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử
(Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát
triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và
bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước
và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế
bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.5.3. Giống vi khuẩn Pseudomonas
Giống Pseudomonas là một nhóm vi khuẩn đa dạng và có ý nghĩa về mặt sinh
thái nhất trên hành tinh đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong các chu trình carbon và
đạm (Spier et al., 2000).
Phân loại:
Vi sinh vật học K3
22
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Pseudomonadaceae
Giống: Pseudomonas
(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas truy cập ngày 10/10/2013)
Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn Pseudomonas sp.
(Nguồn: http://www.psmag.com/science-environment/slick-willy-24318/ truy cập ngày
18/11/2013)
Pseudomonas hiểu theo nghĩa đen là một “đơn vị giả” được bắt nguồn từ tiếng
Hy Lạp, “pseudo” có nghĩa là giả và “monas” có nghĩa là một đơn vị nhỏ lẻ. Thuật
ngữ “monas” được sử dụng rất sớm trong ngành vi sinh học và có nghĩa là những vi
sinh vật đơn bào.
Bởi vì Pseudomonas phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên chúng được quan sát rất
sớm trong lịch sử của ngành vi sinh vật học. Tên Pseudomonas được đặt cho những
loại sinh vật này, được xác định bằng những thuật ngữ khá mơ hồ vào năm 1984 như
một giống vi khuẩn Gram âm, hình que và có chiên mao ở cực. Pseudomonas được
phân lập nhiều từ tự nhiên và một số lượng lớn các dòng giống nhau được cho là cùng
Vi sinh vật học K3
23
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
một giống ban đầu. Nhiều phương pháp mới và gồm cả việc dựa trên nghiên cứu về
sinh học phân tử đã phân loại lại nhiều dòng vi khuẩn (Cornelis, 2008).
Pseudomonas (viết tắt là Ps.): trực khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử,
có một chiên mao (hoặc một chùm chiên mao) mọc ở đỉnh, thường sinh sắc tố. Kích
thước khoảng 0,5-1x1-4µm (Nguyễn Lân Dũng et al., 1979).
Theo Parales et al., (2004) tất cả các dòng Pseudomonas chuyển động bằng một
hoặc hơn một chiên mao phân cực và có đặc tính kích thích hóa học cao. Cấu tạo hóa
học không được nghiên cứu chi tiết cho bất kỳ loài Pseudomonas. Chúng có khả năng
sử dụng các hợp chất hữu cơ như cơ chất tăng trưởng. Tuy nhiên, chúng cũng có thể sử
dụng các hợp chất hữu cơ khác mà chúng không thể trao đổi được.
Ortega – Calvo et al., (2003) đã nghiên cứu sự phản ứng kích thích hóa học của
nhiều dòng Pseudomonas liên quan đến vi khuẩn phân giải hydrocarbon thơm
polycyclic như là dòng 9A của Pseudomonas stutzeri. Dòng này phân hủy
naphthalene, phenanthren và anthracen. Kết luận là dương tính với naphthalene và
dịch trong rễ của nhiều loại cây. Đặc tính hóa học có thể tăng cường phân hủy sinh học
ô nhiễm theo quan sát ở phòng thí nghiệm. Dòng KC khoáng hóa carbon tetracloric và
vận động tăng cường xử lý sinh học trong mẫu nước hóa thạch (apuifer) đã được
chứng minh.
Pseudomonas phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-370C, tuy nhiên một số chủng
Pseudomonas lại có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao khoảng 420C. Nhiệt độ tối hảo
khoảng 350C. Một số dòng Pseudomonas có khả năng chịu lạnh và có thể tăng trưởng
ở 40C (Rosselló – Mora et al., 2001).
Pseudomonas có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy đơn giản, nhu cầu dinh
dưỡng đơn giản. Phát triển tốt ở pH trung tính. Một vài chủng có khả năng tạo màu
huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm. Chúng có khả năng hô
hấp hiếu khí hay kỵ khí trong điều kiện không có oxy.
Một dòng Pseudomonas tăng trưởng hiếu khí trong môi trường khoáng với bất kỳ
hợp chất carbon đơn giản, đáng chú ý là acid hữu cơ và alcohol nhưng không phải với
các carbohydrate. Tăng trưởng tốt trên môi trường như pepton hoặc dịch trích nấm
men, gelatin, có thể phát triển yếm khí khi có sự hiện diện của nitrat, nitrit, nitramid,
hoặc N2O tạo ra nitơ, trong môi trường nồng độ nitrit cao, N2O thành dạng N2, pH tối
hảo khoảng 7, nhưng có thể tăng trưởng ở pH = 9.
Vi sinh vật học K3
24
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Một số Pseudomonas có khả năng khử nitrate trong nước, biến nitrate thành nitơ
tự do. Quá trình khử nitrate diễn ra ở diều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng đặc biệt diễn
ra mạnh mẽ khi không có mặt oxy không khí.
Nhiều dòng của giống Pseudomonas có hoạt tính amylase và protease, có khả
năng lên men nhiều loại đường và tạo vỏ nhầy. Trong môi trường có pH dưới 5.5 các
vi khuẩn này bị kìm hãm phát triển và sinh tổng hợp protease; nồng độ NaCl tới 5-6%
thì sinh trưởng bị ngừng trệ. Nhiều dòng Pseudomonas được dùng trong công nghiệp
sản xuất enzyme và acid amin. Một số loài gây bệnh bacterioz cho cây trồng và cũng
tham gia vào làm hư hỏng thực phẩm (Lương Đức Phẩm, 1998).
Pseudomonas cho kết quả dương tính với các kiểm tra catalase và oxidase.
Pseudomonas cũng cho kết quả âm tính với indol, methylred và Voges
Proskauer.
Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi nhưng được tìm
thấy chính ở trong đất và nước, ngoài ra còn tìm thấy trên động vật, thực vật, và nhiều
dòng cũng được phân lập từ các mẫu bệnh lý.
Một số dòng Pseudomonas có khả năng khử nitrate:
Pseudomonas fluoresens: trực khuẩn nhỏ, có khả năng chuyển động nhờ 3-4
chiên mao ở cực. Khuẩn lạc có sắc tố màu huỳnh quang vàng lục. Pseudomonas
fluoresens là một dòng tự dưỡng, có nhiều trong đất và nước. Pseudomonas fluoresens
là một loài kỵ khí bắt buộc có khả năng khử nitrate (Trần Thanh Thủy, 1998).
Khuẩn lạc trơn tăng trưởng trên đĩa ở 30oC và bảo quản 4oC trong 24h thường
phát triển đặc tính nhầy (Lalucat et al., 2006).
Pseudomonas stutzeri có môi trường phân bố rất rộng, nó có thể sống được trong
những điều kiện sinh thái khác nhau (Lalucat et al., 2006), chúng được tìm thấy trong
đất, nước và các mẫu bệnh lý. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có giới hạn nhiệt độ rất
rộng, từ 4oC đến 45oC, tùy thuộc vào đặc tính riêng của từng dòng (Lalucat et al.,
2006).
Pseudomonas pyocyanae: trực khuẩn nhỏ, kích thước 1-5 µm, có khả năng
chuyển động nhờ 1-2 chiên mao ở cực. Khuẩn lạc có sắc tố màu lục (Trần Thanh
Thủy, 1998).
Vi sinh vật học K3
25
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Pseudomonas stutzeri: vi khuẩn hình que, gram âm, di chuyển bằng chiên mao
đỉnh, loài khử nitrate không sắc tố, khử nitrate thành khí nitơ, dương tính với các kiểm
tra catalase và oxidase, có khả năng tạo enzyme amylase và có thể phát triển trong
maltose và tinh bột và có phản ứng âm tính trong các kiểm tra arginine dihydrolase và
sự thủy phân glycogen (Sikorsky et al., 1999).
Pseudomonas aeruginosa: là trực khuẩn Gram âm, tồn tại ở nhiều dạng đơn, bắt
cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một chiên mao đơn cực. Là vi khuẩn
hiếu khí, có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử,
nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC (Trần Linh Thước, 2005).
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
2.6.1. Vấn đề môi trường
Một vấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi
trường sinh thái. Nguyên nhân chính là do các hoạt động sản xuất và sinh hoạt của con
người gây ra. Ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng, đe dọa trực tiếp đến sự phát
triển kinh tế - xã hội, sự tồn tại của các thế hệ hiện tại và tương lai. Đối tượng gây ô
nhiễm môi trường chủ yếu là các hoạt động sản xuất của nhà máy trong các khu công
nghiệp, hoạt động làng nghề và sinh hoạt tại các đô thị lớn.
Ô nhiễm môi trường bao gồm 3 loại chính là: ô nhiễm đất, ô nhiễm nước và ô
nhiễm không khí. Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong thời kỳ đẩy mạnh công
nghiệp hóa - hiện đại hóa hiện nay không chỉ đòi hỏi sự cấp thiết đối với các cấp quản
lý, các doanh nghiệp mà đó còn là trách nhiệm của cả hệ thống chính trị và toàn xã
hội.
Để bảo vệ môi trường thoát khỏi các hiểm họa: thủng tầng ôzon, hiệu ứng nhà
kính, ô nhiễm nguồn nước sạch, không khí, đất đai,…con người cần phải nâng cao
nhận thức gìn giữ và hiểu rõ vai trò, vị trí của mình và xã hội trong hệ thống tự nhiêncon người- xã hội. Xây dựng ý thức và phát triển mọi phương pháp vật lý, hóa học,
sinh học để xử lý rác thải, nước thải môi trường. Đồng thời kết hợp việc sử dụng, bảo
vệ cùng với việc tái chế nguồn tài nguyên thiên nhiên.
2.6.2. Trong nước
Phạm Thị Tuyết Ngân và Ngyễn Hữu Hiệp (2012) chín chủng vi khuẩn được
phân lập từ ao nuôi tôm sú, trên môi trường chuyên biệt đã qua các bước thử nghiệm
Vi sinh vật học K3
26
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
thành công trong phòng thí nghiệm trên qui mô bể nuôi. Kết quả kiểm tra đặc điểm
sinh hóa cho thấy 05 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus, 04 dòng
Nitrosomonas dương tính với thuốc thử Griess- Ilosway và 05 dòng Nitrobacter cho
kết quả âm tính với thuốc thử Griess- Ilosway. Kết quả giải trình tự và so sánh với các
trình tự trên ngân hàng dữ liệu gen chương trình BLAST cho thấy: B9 đồng hình với
dòng Bacillus cereus BRL02-43 (97%), 02 dòng B37, B38 đồng hình giống với dòng
Bacillus cereus G9842 (100% và 99%), Dòng B41 đồng hình giống với dòng Bacillus
amyloliquefaciens SB3297 (100%) và dòng B67 có mức độ đồng hình với dòng
Bacillus subtilis BL10 (99%). Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae
3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và
91%). Cả 02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn
Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%). Trần Liên Hà et al.,(2007)
bốn chủng vi khuẩn nitrate hóa được phân lập từ nước của 7 mẫu nước hồ và 2 mẫu
đất.
Cao Ngọc Điệp et al., (2010) Ba mươi dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ
chất thải của hai trại chăn nuôi heo qui mô 400 con tại hai huyện Châu Thành và Chợ
Gạo, tỉnh Tiền Giang. Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) Đã sưu tập được 67 chủng vi
khuẩn thuộc nhóm Bacillus, 8 chủng thuộc nhóm Nitrosomonas và 8 chủng thuộc
nhóm Nitrobacter. Bộ sưu tập vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm
thâm canh hiện đang được lưu trữ trong tủ đông (- 80ºC) tại Khoa Thủy sản, Đại học
Cần Thơ.
Phạm Thị Tuyết Ngân et al., (2011) Đã thành công khi phát triển xác định mật
số, tính đa dạng và loài chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn Nitrate trong môi trường ao
nuôi tôm sú thâm canh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật Real Time PCR –
Sybr Green cho kết quả chính xác, nhanh. Đã xác định được mật số vi khuẩn
Nitrosomonas europaea dao động trong khoảng 102 đến 2,8×104 tế bào/g bùn. Mật số
vi khuẩn Nitrobacter biến động trong khoảng 1,2×103 đến 9,1×107 tế bào/g bùn trong
suốt quá trình nuôi. Đa dạng của quần thể các vi khuẩn đã được xác định bằng kỹ thuật
DGGE. Thành phần vi khuẩn rất đa dạng với hơn 10 loài. Vi khuẩn chiếm ưu thế có
chức năng oxi hóa amonium được phát hiện trong bùn có sự tương đồng cao với N.
europaea. Lương Bích Dung (2008) phân lập phân lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc
giống Bacillus từ 2 mẫu bùn đáy ao nuôi tôm sú.
Vi sinh vật học K3
27
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Cao Ngọc Điệp et al., (2008) đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri trong ba vùng sinh thái khác nhau ở Đồng bằng Sông Cửu Long theo quy trình
Sikorski et al., (2002), xác định 12 chủng vi khuẩn này bằng kỹ thuật PCR-16s rRNA
với cặp mồi chung và cặp mồi đắc trưng (Bennasar et al., 1998) giải trình thự đoạn gen
16S rRNA của chủng P8 và định danh chính xác đến loài Pseudomonas stutzeri. Triệu
Thị Ngọc Sang (2010) đã phân lập được 46 dòng vi khuẩn trong đó vi khuẩn Bacillus
21 dòng và 25 dòng vi khuẩn Pseudomonas từ ao nuôi cá tra ở 2 huyện Cầu Kè và
Tiểu Cần tỉnh Trà Vinh. Ngô Mỹ Ngân (2010) đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn khử
đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng
Sông Cửu Long.
2.6.3. Thế giới
Theo nghiên cứu của Camp et al., (2006) các vi khuẩn ammonium hóa được phát
hiện trong nhiều hệ sinh thái biển và nước ngọt và ước tính đóng góp lên đến 50% mất
đạm của đại dương. Hơn nữa, quy trình anammox hiện đang thực hiện xử lý nước để
loại bỏ chi phí thấp của amoniac từ có độ bền cao dòng thải. Drysdale et al., (1999)
cho biết, Pseudomonas spp. có sự tham gia đáng kể trong quá trình khử nitơ xảy ra
trong quá trình Darvill BNR . Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn dị dưỡng khác nhau góp phần
vào quá trình khử nitơ xảy ra trong quá trình này. Một số các vi khuẩn dị dưỡng khử
nitơ có thể chứa nitrate và nitrite enzyme khử yếu , do đó chỉ cho phép nó giảm nitrate
và nitrite chậm và yếu ớt. Nhiều vi khuẩn khử nitơ hoàn toàn có thể có khả năng hô
hấp đồng thời oxy và nitrate vì vậy dẫn đến giảm nitrat trong vùng hiếu khí. Mặc dù
chưa đầy đủ, một số vi khuẩn hình que gram dương cũng như cầu khuẩn gram âm
cũng góp phần vào quá trình khử nitơ. Rõ ràng là giảm hoàn toàn của nitrate, nitrite,
oxit nitơ và khí nitơ, trong quá trình Darvill BNR. Theo nghiên cứu của Schmidt et al.,
(2003) quá trình cơ bản của vi sinh vật kiểm soát loại bỏ nitơ trong lọc sinh học sẽ
thúc đẩy đáng kể hiệu quả cải thiện các ứng dụng của lọc sinh học như các hệ thống xử
lý vùng đất ngập nước.
Năm 1983, Curtis đã so sánh khả năng khử nitrate của 3 loài vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas paracoccus, mặc dù
3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, tốc độ tích lũy số lượng các chất
trung gian của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, Pseudomonas aeruginosa và
Vi sinh vật học K3
28
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
seudomonas paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là NO2. Vi khuẩn P. stutzeri và
P. paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO3-, NO2-, NO2 và vi khuẩn này
có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO 2 trong môi
trường. Tổng cộng có 49 dòng Pseudomonas stutzeri được nghiên cứu, chúng được
phân lập từ những mẫu bệnh lý, bùn biển và trong hệt thống nước thải (Holmes, 1986;
Rossello et al., 1991). Su et al., (2001) so sánh sự khử nitrate ở điều kiện hiếu khí,
dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 và
Pseudomonas stutzeri SU2. Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống
xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan.
Vi sinh vật học K3
29
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
Địa điểm: Phòng Công Nghệ Sinh Học Vi Sinh Vật, Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Nước thải từ 2 cơ sở làm bánh Pía:
- Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
- Mỹ Trân, Tp Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng.
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Đĩa Petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh.
- Cân điện tử Sartorius, pH kế, micropipet, kim cấy, bi trải mẫu.
- Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc, tủ lạnh giữ mẫu
- Nồi khử trùng nhiệt ướt và một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm
Vi sinh vật.
- Chai hoặc hộp nhựa có nắp đậy, vải lược.
Hình 3.1: Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm
3.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu và hóa chất
Bảng 3.1: Môi trường Meat Extract – pepton (MP)
Hóa chất
Meat extract
Pepton
Nước cất
pH
Vi sinh vật học K3
Liều lượng (g/l)
0,5
1
100ml
6,8-7
30
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Bảng 3.2: Môi trường LB (Luria-Bertani)
Hóa chất
Liều lượng (g/l)
Yeast extract
0,5
Pepton
1
NaCl
1
Nước cất
100ml
Agar
2
Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Bảng 3.3: Môi Trường MSB + 2% Skim milk
Hóa chất
K2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgCl2
Stock
0,45g/0,5l
0,34/0,5l
1g/10ml
0,5g/10ml
MnCl2
0,1g
Stock 1
FeSO4
0,6g
CaCl2
2,6g
Na2MoO4
0,02g
ZnCl2
0,01g
CaCl2
0,01g
Stock vi lượng
CuSO4
0,01g
NiSO4
0,001g
Na2SeO4
0,001g
Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Thể Tích 100ml
11,25ml
17ml
2ml
320µl
10ml
10µl
100ml
10µ
Bảng 3.4: Môi Trường Lewis (1958)
Hóa chất
Stock
K2HPO4
7g/100ml
MgSO4
2g/100ml
NaHCO3
(NH4)2SO4
5g/100ml
FeCl3.6H2O
230,4mg/40ml
CaCl2.2H2O
0,8g/100ml
pH
Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Thể Tích 100ml
1ml
0,5ml
0,05g
0,5ml
250µl
320µl
7
Cycloheximide (Chất kháng nấm)
Nước muối sinh lý 8,5‰.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp thu mẫu nước thải
-Vật liệu: Chai nước 250 ml
Vi sinh vật học K3
31
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
-Nguyên liệu: nước thải được lấy từ 2 cơ sở Tân Huê Viên và Mỹ Trân ở Sóc
Trăng.
3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn khử đạm
Mục đích: phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao.
Đối tượng: Các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm từ nước thải làng nghề làm
bánh Pía Sóc Trăng.
Phân lập: Lấy 20 ml dung dịch nước thải + 180 ml nước cất ( Pha loãng 10-1 )
cho vào bình tam giác thủy tinh. Lắc đều.
Tiến hành pha loãng mẫu dung dịch trên theo trình tự độ pha loãng sau: 10-2,
10-3. Mỗi độ pha loãng lấy 1 ml trải lên đĩa petri có chứa môi trường Meat extractPepton có bổ sung 2% Agar (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24h.
Tiếp tục cấy phân lập lần thứ 2 để chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau.
Cấy chuyển: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục chọn các
dạng khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa riêng có chứa môi trường Meat ExtractPepton-Agar, sau đó đem ủ ở 30oC. Cứ tiếp tục cấy chuyển đến khi khuẩn lạc đồng
nhất về hình dạng, kích thước rồi kiểm tra độ ròng của vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Lưu ý: Tất cả các thao tác đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển đều phải được
thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Nuôi tăng sinh: vi khuẩn đã phân lập ròng được nuôi tăng sinh trong môi trường
Luria Bertani (LB).
3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn
phân lập
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn khử đạm khác nhau ta tiến hành nghiên
cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng: quan sát hình thể tế bào, nhuộm
Gram, thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Protease, Thử nghiệm tính di động.
3.2.3.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học
Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc
Hình dạng
Màu sắc
Kích thước
Vi sinh vật học K3
32
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Bề mặt
Đo kích thước tế bào vi khuẩn
Đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).
Đặt thước trắc vi vật kính (được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng
2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10 m) vào bán kính,
điều chỉnh sao cho thấy rõ hình ảnh của thước.
Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính (là một miếng
kính tròn trên đó có chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị
kính) sao cho hai thước song song và gần sát nhau
Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật
kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và vạch thứ hai nào đó của
thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật
kính.
Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thước sau:
x = (N/n)* 10 m
Trong đó:
x: Trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính.
N: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, N=6.
n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n=35.
Ta có:
x=(6/35)*10 m
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi
mẫu.
Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước
trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của thước nhân với trị số
một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Ghi nhận kết quả: hình dạng tế bào
Vi sinh vật học K3
33
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
3.2.3.2. Xác định Gram của vi khuẩn
Nhuộm Gram:
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm
Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
Lấy 10μL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng
vi sinh vật trên kính mang vật.
Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính
mang vật.
Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật
đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1
phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau
cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của
fushin.
Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận
Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu
Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
3.2.3.3. Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
Cơ sở sinh hoá: Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý.
Vi sinh vật học K3
34
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Catalase
H2 O2
Trường Đại học Cần Thơ
H2O + O2 (bọt khí)
(hydrogen peroxide)
Cách tiến hành:
- Nhỏ trực tiếp 1-2 giọt H2O2 30% tiếp lên khuẩn lạc ròng của vi khuẩn được
nuôi trên môi trường đĩa thạch.
- Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
3.2.3.5. Khả năng di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Cách tiến hành:
- Cấy sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).
- Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.
- Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị
đục.
3.2.3.6. Khảo sát hoạt tính enzyme protease
- Môi trường: MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ
5 µl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%) và ủ ở
30oC. Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả
năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn.
3.2.4. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn phân giải đạm
Phương pháp đường chuẩn:
- Đặc điểm của phương pháp:
+ Phương pháp đường chuẩn áp dụng thuận tiện cho phép phân tích hàng loạt
mẫu và cho phép tính kết quả nhanh.
+ Điều kiện áp dụng: Xác định nồng độ nằm trong khoảng tuân theo định luật
Bia.
- Nội dung của phương pháp:
Vi sinh vật học K3
35
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
+ Pha chế một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ NH4+ tăng dần, còn lượng thuốc
thử và các điều kiện khác như nhau (pH, dung môi, lực ion, bước sóng…). Đo mật độ
quang của dãy dung dịch chuẩn và xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(C) xử lý
bằng toán học thống kê, đường chuẩn thu được phải có dạng:
A = (a ± εa) + (b ± εb).C
(*)
+ Nếu đường chuẩn thu được có những điểm đầu hoặc điểm cuối (nồng độ) bị
lệch khỏi đường thẳng của (*) trên đồ thị thì phải loại bỏ các giá trị đó. Tiến hành xây
dựng lại phương trình đường chuẩn (nếu cần).
+ Pha chế dung dịch phân tích trong các điều kiện như trên rồi đem đo mật độ
quang (Ax). Thay Ax vào (*) ta sẽ tính được Cx.
Hóa chất:
Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl vào trong 100ml nước cất.
Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ
lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được
dung dịch 2 µg/ml
Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong
nước được 0.5 lít.
Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5 lít.
Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Lewis lỏng
Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g
nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5 lít.
Pha buffer: cho 15ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5 lit
nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5 ml H2O : 0 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4 ml H2O: 1 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3 ml H2O: 2 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2 ml H2O: 3 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1 ml H2O: 4 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0 ml H2O: 5 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Vi sinh vật học K3
36
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
Hút 1ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf (3 lần lặp lại).
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 0.5ml dịch vi khuẩn đã ly tâm vào 4ml H2O, 5ml buffer, sau đó cho 5ml
thuốc thử.
Cách tiến hành:
Trước tiên nuôi các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường LB lỏng trong 12h,
lấy 2ml dung dịch vi khuẩn cho vào tube enpendoft 2,5 đem ly tâm thu sinh khối vi
khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trường ở trên rồi rửa lại với 1,5 ml nước muối sinh lý
8,5‰ tiếp tục đem ly tâm, sau đó đổ bỏ phần dung dịch làm như vậy với 2 lần nước
cất khử trùng, sau đó chủng vi khuẩn vào môi trường Lewis lỏng nuôi trên máy lắc,
tiến hành đo mỗi 4h trong 3 ngày liên tiếp (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp,
2012).
3.2.5. Định danh bằng kỹ thuật PCR
Chọn một số dòng vi khuẩn khử đam mạnh có được từ kết quả của thí nghiệm
trên, tiến hành nhận diện bằng phương pháp PCR và giải trình tự.
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải đạm, chọn một số dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt để nhận diện bằng phương pháp PCR sử dụng
các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau:
Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
Quy trình trích DNA:
Nuôi vi khuẩn trong 6ml môi trường LB khoảng 14-16h.
Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml.
Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn).
Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa.
Hòa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định
trong môi trường, không bị biến tính).
Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hoàn toàn màng tế bào, loại bỏ
polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein
giúp mẫu sạch hơn).
Vi sinh vật học K3
37
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một
lần để trộn đều dung dịch.
Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phóng ADN). Ủ ở
65oC trong 20 phút.
Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần không
phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa có tạo màng protein ngăn cách).
Trộn đều và ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml
Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN không biến tính và
bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng
xảy ra hoàn toàn.
Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút.
Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hoá chất đã dùng trước đó hay
tạp chất còn lẫn), ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng trong 1-2h hoặc sấy khô bằng máy ly tâm chân
không.
Trữ ở 20oC.
Điện di sản phẩm trên agarose gel Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng
phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di Sau khi điện di,
tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận
diện các dòng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài
band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản
phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rõ nét chọn
ra các dòng vi khuẩn giải trình tự. Mẫu được gởi giải trình tự tại Công ty TBR, Tp Hồ
Chí Minh.
Vi sinh vật học K3
38
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
4.1.1. Kết quả phân lập và địa điểm của các dòng vi khuẩn
Từ 2 mẫu nước thải thu từ 2 cơ sở sản xuất Bánh Pía Tân Huê Viên và Mỹ Trân.
Sau quá trình phân lập tách ròng trên môi trường Meat extract – Pepton – Agar (MPA)
đã phân lập được tất cả 18 dòng vi khuẩn. (Bảng 4.1)
Bảng 4.1: Nguồn gốc vi khuẩn đã phân lập
STT
Dòng vi khuẩn
Địa điểm phân lập
1
M1.1
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
2
M1.2
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
3
M2
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
4
M2.1
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
5
M3
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
6
M4
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
7
M5
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
8
M6
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
9
M8
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
10
M9
Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
11
T1.1
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
12
T1.2
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
13
T2
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
14
T4
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
15
T5
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
16
T6
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
17
T8
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
18
T9
Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
Vi sinh vật học K3
39
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Từ mẫu cấy trải trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar(MPA) có bổ sung
chất kháng nấm chọn ra những khuẩn lạc khác nhau cấy phân lập qua từng đĩa môi
trường MPA.
A
C
B
D
Hình 4.1: Mẫu cấy trải vi khuẩn trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar
A : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-1
B : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-3
C : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-1
D : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-3
Vi sinh vật học K3
40
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Sau khi phân lập ròng tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này lên đĩa petri có chứa
môi trường MPA để quan sát và mô tả các đặc điểm khuẩn lạc. Thời gian trung bình
để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 12 giờ.
Mười tám dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều đặc điểm khác nhau
được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa và kích thước khuẩn lạc.
(Bảng 4.2 và Hình 4.2).
Hình dạng khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc đều có dạng hình tròn, một số ít có dạng
không đều. Trong tổng số 18 dòng phân lập được thì có 14 dòng có khuẩn lạc tròn
(chiếm tỉ lệ 77,8%), 4 dòng có khuẩn lạc không đều (chiếm tỉ lệ 22,2%).
Độ nổi khuẩn lạc: đa số những dòng vi khuẩn phân lập đều cho khuẩn lạc có độ
nổi mô với 16 dòng (chiếm tỉ lệ 88,9%) và 2 dòng có độ nổi lài (chiếm tỉ lệ 11,1%).
Bề mặt khuẩn lạc: Phần lớn những dòng vi khuẩn phân lập có bề mặt khuẩn lạc
khô với 12 dòng (chiếm tỉ lệ 66,7%)và 6 dòng có bề mặt ướt (chiếm tỉ lệ 33,3%).
Dạng bìa khuẩn lạc: trong 18 dòng vi khuẩn phân lập có 13 dòng có dạng bìa
nguyên (chiếm tỉ lệ 72,2%) và 5 dòng có dạng bìa răng cưa (chiếm tỉ lệ 27,8%).
Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn rất đa dạng trong
đó có màu trắng đục, vàng nhạt, vàng và trắng. Trong tổng số 18 dòng phân lập có 10
dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục (tỉ lệ 55,6%), 3 dòng có khuẩn lạc màu vàng nhạt (tỉ
lệ 16,7%), 3 dòng tạo khuẩn lạc màu vàng (tỉ lệ 16,6%) và 2 dòng tạo khuẩn lạc màu
trắng (chiếm tỉ lệ 11,1%).
Kích thước khuẩn lạc: dao động từ 0,4-2 mm của 18 dòng vi khuẩn đã phân lập
trên môi trường MPA sau 12 giờ.
Vi sinh vật học K3
41
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
A
C
B
D
Hình 4.2: Đặc điểm một số khuẩn lạc ròng phân lập được
A : M2 (Khuẩn lạc dạng tròn, mô, khô, bìa nguyên, trắng trong trên môi trường MPA)
B : M1.1 (Khuẩn lạc tròn, mô, khô, bìa nguyên, màu vàng nhạt trên môi trường MPA)
C : T2 (Khuẩn lạc tròn, mô, ướt, bìa nguyên, màu trắng đục trên môi trường MPA)
D : T9 (Khuẩn lạc tròn, mô, khô, bìa nguyên, màu trắng đục trên môi trường MPA)
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường
Meat extract-Pepton-Agar
Hình dạng khuẩn lạc
Kích thước
STT Dòng
Dạng
Độ nổi
Bề mặt
Bìa
Màu sắc
(mm)
1
M1.1
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Vàng nhạt
0,9
2
M1.2
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Vàng
1,0
3
M2
Tròn
Mô
Ướt
Răng cưa
Trắng đục
1,2
4
M2.1
Không đều
Mô
Ướt
Răng cưa
Vàng
1,5
5
M3
Không đều
Lài
Khô
Răng cưa
Trắng đục
1,1
Vi sinh vật học K3
42
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
6
M4
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Vàng nhạt
0,4
7
M5
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Trắng
0,9
8
M6
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Vàng nhạt
1,2
9
M8
Tròn
Mô
Ướt
Nguyên
Trắng đục
0,7
10
M9
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Vàng
0,5
11
T1.1
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Trắng đục
0,7
12
T1.2
Tròn
Mô
Khô
Răng cưa
Trắng đục
1,0
13
T2
Tròn
Mô
Ướt
Nguyên
Trắng đục
2,0
14
T4
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Trắng đục
1,7
15
T5
Tròn
Mô
Ướt
Nguyên
Trắng đục
1,3
16
T6
Không đều
Lài
Khô
Răng cưa
Xám
1,5
17
T8
Không đều
Mô
Ướt
Nguyên
Trắng
1,0
18
T9
Tròn
Mô
Khô
Nguyên
Trắng đục
0,5
4.2. Đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Mười tám dòng vi khuẩn phân lập được quan sát dưới kính hiển vi quang học với
độ phóng đại 400 lần. Trong đó, có 9 dòng có dạng que ngắn (chiếm tỉ lệ 50%), 5 dòng
có dạng que dài (chiếm tỉ lệ 27,8%), 3 dòng có dạng cầu (chiếm tỉ lệ 16,7%), 1 dòng
có dạng chuỗi (chiếm tỉ lệ 5,6%). Tất cả đều có khả năng chuyển động chiếm tỉ lệ
100%. (Hình 4.3 và Bảng 4.3)
Nhuộm Gram: sau khi tiến hành các bước nhuộm Gram, kết quả có 16 dòng vi
khuẩn Gram âm (chiếm tỉ lệ 88,9%) và 2 dòng vi khuẩn Gram dương (chiếm tỉ lệ
11,1%).
Vi sinh vật học K3
43
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Vi khuẩn
di chuyển
làm
đục
môi trường
bán đặc
Hình 4.3: Khả năng di động của các dòng vi khuẩn trên môi trường Meat extractPepton bán đặc
T9
M4
T1.1
Hình 4.4: Hình nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập
T9 : Vi khuẩn Gram dương, hình que
M4 : Vi khuẩn Gram âm, hình que
T1.1 : Vi khuẩn Gram âm, hình que
Vi sinh vật học K3
44
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Kích thước vi khuẩn (µm)
Tên
Hình dạng vi
dòng
khuẩn
Chiều dài
Chiều rộng
1
M1.1
Que ngắn
0,5
1
Âm
+
2
M1.2
Que ngắn
0,8
1
Âm
+
3
M2
Que ngắn
0,6
1,8
Âm
+
4
M2.1
Que dài
1
3
Âm
+
5
M3
Que dài
0,8
3,5
Dương
+
6
M4
Que ngắn
0,7
2
Âm
+
7
M5
Que dài
1
3
Âm
+
8
M6
Que ngắn
0,5
1
Âm
+
9
M8
Que dài
1
2,5
Âm
+
10
M9
Cầu
1
1
Âm
+
11
T1.1
Que ngắn
0,7
2
Âm
+
12
T1.2
Cầu
1
1
Âm
+
13
T2
Que dài
1
3,2
Âm
+
14
T4
Chuỗi
1
4
Âm
+
15
T5
Que ngắn
0,5
1
Âm
+
16
T6
Que ngắn
1,1
2
Âm
+
17
T8
Que ngắn
0,6
1,8
Âm
+
18
T9
Que ngắn
1
2
Dương
+
STT
Gram
Chuyển
động (*)
(*) Chú thích : + : Di chuyển
4.3. Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Kiểm tra hoạt tính enzyme catalase
Vi sinh vật học K3
45
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Hiện tượng sủi bọt khí xuất hiện khi nhỏ giọt H2O2 lên khuẩn lạc của các dòng
vi khuẩn đã phân lập ta nhận thấy tất cả đều cho kết quả dương tính với enzyme
catalase (chiếm tỉ lệ 100%).
T
8
M6
Hình 4.5: Hiện tượng sủi bọt khí khi nhỏ H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn phân lập
Kiểm tra hoạt tính enzyme protease
Chín dòng vi khuẩn phân lập tạo được vòng sáng khi cấy nhỏ giọt dung dịch vi
khuẩn lên môi trường MSB + 2% sữa gầy (chiếm tỉ lệ 50%) đều này chứng tỏ những
dòng vi khuẩn này có khả năng sinh enzyme protease, 9 dòng không có khả năng tạo
vòng sáng (chiếm tỉ lệ 50%) chứng tỏ những dòng này ko có khả năng sinh enzyme
protease trên môi trường MSB + 2% sữa gây.
T1.2
M4
Hình 4.6: Vòng sáng phân giải protein của các dòng vi khuẩn trên môi trường
MSB+2% sữa gầy
Vi sinh vật học K3
46
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 4.4: Kiểm tra hoạt tính enzyme của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Protease(2)
STT
Dòng
Catalase(1)
Ngày 1(%)
Ngày 2(%)
Ngày 3(%)
1
M1.1
+
-
-
-
2
M1.2
+
-
-
-
3
M2
+
-
211,1
267,9
4
M2.1
+
170,6
195,2
156,7
5
M3
+
180,0
226,3
260,0
6
M4
+
-
178,6
136,8
7
M5
+
-
-
-
8
M6
+
-
-
-
9
M8
+
150,0
215,0
216,7
10
M9
+
-
-
-
11
T1.1
+
-
178,6
243,8
12
T1.2
+
156,0
160,0
192,3
13
T2
+
-
-
-
14
T4
+
-
-
-
15
T5
+
-
-
-
16
T6
+
-
226,7
164,5
17
T8
+
-
-
-
18
T9
+
-
194,7
257,1
Chú thích : (1) : + : Dương tính với enzyme catalase
(2) : - : Không tạo vòng sáng trên môi trường MSB + 2% sữa gầy
4.4. Khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn
Từ những thử nghiệm sinh hóa đã làm, chọn ra 9 dòng có khả năng sinh enzyme
protease để test khả năng phân giải đạm, kết quả cho thấy cả 9 dòng vi khuẩn đã chọn
đều có khả năng phân giải đạm. Tuy nhiên mức độ phân giải đạm ở mỗi dòng là khác
Vi sinh vật học K3
47
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
nhau. Từ thí nghiệm chọn ra được 3 dòng có khả năng phân giải đạm tốt nhất (M4,
T1.1, T9) để định danh.
Bảng 4.5: Hiệu quả phân giải đạm trong môi trường Lewis của các dòng vi khuẩn
phân lập theo thời gian (µg/ml)
Thời gian
Ngày 1
8h
Mẫu
12h
Ngày 2
16h
8h
12h
Ngày 3
16h
8h
12h
16h
ĐC
11,545A
10,851E
11,058BC
10,268BCD
10,340AB
10,056A
09,196B
09,098A
08,955EF
M2
11,545A
11,918B
11,280B
11,518ABC
09,707BC
08,912D
07,773E
07,871BC
09,246DE
M2.1
11,545A
11,200CD
11,235B
12,446A
09,910B
09,537BC
08,318CDE
08,413B
10,235B
M3
11,545A
12,371A
10,753BCD
09,710D
09,684BC
09,315BCD
08,411CD
08,333B
10,963A
M4
11,545A
10,294F
10,410D
11,613AB
09,678BCD
09,145CD
08,853BC
07,519CD
09,250DE
M8
11,545A
11,308CD
11,844A
11,502ABC
08,866DE
09,525BC
08,029DE
07,676C
10,065BC
T1.1
11,545A
11,918B
11,012BC
09,714D
08,988CDE
09,532BC
08,114DE
06,956DE
08,981EF
T1.2
11,545A
11,016DE
12,179A
11,034BCD
10,773A
09,717AB
09,829A
07,558CD
09,185DE
T6
11,545A
11,543C
10,935BCD
12,577A
09,791BC
09,728AB
10,105A
07,389CDE
09,601CD
T9
11,545A
12,457A
10,550CD
10,173CD
08,206E
08,907D
08,211DE
06,799E
08,528F
CV%
2,5
1,8
2,8
7,4
5,0
3,1
3,8
4,8
Chú thích: Các giá trị trung bình theo sau có các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thì
khác biệt không có ý nghĩa ở 5%.
Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả 9 dòng vi khuẩn được chọn trong tổng số 18
dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng phân giải đạm trong môi trường Lewis đạt tỉ
lệ 50%. Nhìn chung khả năng phân giải đạm giữa các khoảng thời gian trong mỗi dòng
vi khuẩn phân lập và giữa các dòng vi khuẩn phân lập trong từng khoảng thời gian là
giảm có ý nghĩa về mặt thống kê. Từ kết quả lượng đạm phân tích chọn ra 3 dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt nhất là (M4, T1.1, T9).
Sau khi chủng vi khuẩn vào nuôi trong môi trường Lewis lỏng vào lúc 8h ngày 1,
kết quả đạm sau 12h ngày 1 nhìn chung là tăng chỉ có dòng M4 là giảm mạnh lượng
đạm, sau đó 16h ngày 1 lượng đạm trong tất cả các dòng đều có chiều hướng giảm.
Lượng đạm đo lúc 8h ngày 2 có chiều hướng giảm mạnh ở các dòng (M3, T1.1, T1.2,
T9) những dòng còn lại thì tăng mạnh, lượng đạm đo được ở 12h và 16h ngày 2 phần
Vi sinh vật học K3
48
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3,0
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
lớn các dòng đều giảm, chỉ có một số dòng tăng nhẹ nhưng không có ý nghĩa về mặt
thống kê. Lượng đạm đo được tiếp tục giảm ở 8h và 12h ngày 3 ở phần lớn các dòng,
ở 16h ngày 3 lượng đạm bắt đầu tăng mạnh ở tất cả các dòng.
4.5. Nhận diện vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Điện di sản phẩm trên gel agarose cả ba dòng M4, T1.1, T9 đều có band ở vị trí
1500bp.
1500bp
T1.1
T9
M4 Thang chuẩn
Đối chứng âm
Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR các dòng vi khuẩn phân lập
Thang chuẩn 1kb
Kích thước mẫu 1500bp
Kết quả giải trình tự dòng M4
GAATAGGGCAGCGACGCGAACAATGCGAGTCGAGCGGATGAAGGTAGCTT
GCTACTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTA
TTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGAGCGCTAATACCGCATACGTCCTA
CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAG
TCGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTA
GCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTG
ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTT
TAAGCGAGGAGGAGGCTACCTAGATTAATACTTTAGGATAGTGGACGTTA
Vi sinh vật học K3
49
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACA
GAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCG
GCCAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATT
CGATACTGGTTGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTA
GCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCA
TCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGA
TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGG
GCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGG
GGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCAC
AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT
GGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAA
CTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTT
CGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGG
Hình 4.8: Kết quả blast DNA của M4 tương đồng với Acinetobacter radioresistens
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trính tự tương đồng với các trình tự
trên nguyên lý gene kết quả đã cho thấy trình tự của dòng M4 có mức đồng hình 99%
với 16S rRNA của dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens.
Kết quả nghiên cứu của Haleem (2003) cho thấy Acinetobacter ssp. phổ biến
trong tự nhiên, được thu từ đất, nước và sinh vật. Giống Acinetobacter đã và đang thu
hút được nhiều sự qua về khả năng ứng dụng trong Công nghệ Sinh học và xử lý môi
trường. Giống Acinetobacter có thể sinh enzyme ngoại bào như : lipase, protease,…
Kết quả giải trình tự dòng T1.1
AAGCGCCGAGGGGGGGGGCGGGCTGCTAGTTCGAGCGGGCGAGGTTGCTT
CGGTAACTGAGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCT
Vi sinh vật học K3
50
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
ATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCT
ACGGGAGAAAGCAGGGGATCTCTTGTGACCTTGCCCTAATAAATGACCCT
AAGTCGGATTACCTAGTTGGGGGGGTAAAGGCCTCCCAGGGCAACAATCT
GTAGCGGGTCTGAAAGGATGACCCCCCACACGGGGACTGAAACACGGCCC
AAACCCCTACGGGAGGCAGCAGGGGGAAATTTTGAACAAGGGGGGAAACC
CTGATCCACCCATCCCGCGTGTGTGAAAAAGGCTTTTTGTTTGTAAAGCA
TTTTAAGTGGGGAGGAGGCTTACCTGGTTAATACCTGGGCTAAGTGGACT
TTACCCACAAAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCACCCGCGGTAAT
ACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAG
GTGGTTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGC
TTTCGATACTGGTTAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGGTAAAATTCCAGG
TGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCA
GCCATCTGGCCTAATACTGACACTGAGGTGCAAAAGCATGGGGGAGCAAA
CGGGATTAGATACCCTGGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCC
GTTGGGGGGATTTGATCCTTTTAGTGGCCGCACCTAACGCGAATAAGTAG
ACCGCCCTGGGGGAGTACGGTCCCAAAGACTAAAACCTCAAAATGAATTT
GACGGGGGGCCCCCCACAAGCGGGTGGAACCATGGGGGTTTAATTCCGAT
GCCACCGCAAAAAAACCTTTACCTGGCCCTTTGACAATAGTAAAAAACTT
TTCCAAAAAATGGAATTGTTGCCTTTCGGGAAATCTACATACAGGGTGCT
GCATGGCTTGTCTTCACCTCGTGTCGTGAAGATGTTGGGGTTAAGTCCCC
CCAACGAACCCCAACCCTTTTTTCTTTACTTTGCCAACCATTTTCGGGAT
GGGGAACTTTTAAGGGATCCTGCCCATTGAACAACCTGGAAGGAAGGGCG
GGGGACGAACTTCAAGTTCATCAAGGGCCCTTTACGGGCAGGGGCTACCA
CCCTTGCTTACAATGGTCCGGTTCCA
Vi sinh vật học K3
51
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Hình 4.9: Kết quả Blast DNA của T1.1 tương đồng với Acinetobacter towneri
strain CCM7201
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trính tự tương đồng với các trình tự
trên nguyên lý gene kết quả đã cho thấy trình tự của dòng T1.1 có mức đồng hình 90%
với 16S rRNA của dòng vi khuẩn Acinetobacter towneri.
Kết quả nghiên cứu của Haleem (2003) cho thấy Acinetobacter ssp. phổ biến
trong tự nhiên, được thu từ đất, nước và sinh vật. Giống Acinetobacter đã và đang thu
hút được nhiều sự qua về khả năng ứng dụng trong Công nghệ Sinh học và xử lý môi
trường. Giống Acinetobacter có thể sinh enzyme ngoại bào như : lipase, protease,…
Vi sinh vật học K3
52
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Mười tám dòng vi khuẩn từ 2 mẫu nước thải thu từ 2 cơ sở sản xuất bánh Pía Tân
Huê Viên, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng và Mỹ Trân, tp Sóc Trăng, tỉnh Sóc
Trăng đã được phân lập. Trong đó có 9 dòng có khả năng phân giải đạm, 3 dòng có
khả năng phân giải đạm tốt nhất là: M4, T1.1 và T9.
Nhận diện bằng kỹ thuật sinh học phân tử 2 dòng M4, T1.1 lần lượt là:
Acinetobacter radioresistens và Acinetobacter towneri.
5.2. Đề nghị
Sử dụng các dòng vi khuẩn đã giải trình tự để khảo sát khả năng phân giải đạm ở
những điều kiện khác nhau, thí nghiệm xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm
đặc biệt là xử lý ở những làng nghề làm bánh Pía.
Vi sinh vật học K3
53
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương,
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Cao Ngọc Điệp, Phan Trường Khanh và Nguyễn Thị Xuân Mỵ. 2008. Phân lập vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất Đồng bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Công
nghệ Sinh học 6(2): 191-195.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thành Nhân, Lê Quang Khôi. 2010. Phân lập vi khuẩn khử
đạm Pseudomonas stutzeri trong chất thải trại chăn nuôi heo và ứng dụng xử lý
nitrogen trong nước thải. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(4): 1877-1884.
Lương Bích Dung. 2008. Phân lập một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ở ao nuôi
tôm công nghiệp. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ Sinh học, Trường
Đại học Cần thơ.
Lương Đức Phẩm. 1998. Công nghệ vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lý Kim Hữu. 2005. Khảo sát đặc điểm của vikhuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều
kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, Khoa
Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Nguyễn Lân Dũng. 1997. Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 370-398.
Nguyễn Đình Bảng, Hoàng Ngọc Hiển, Phạm Lê Hùng và Đàm Viết Cương. 1992. Vi
sinh vật y học, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và Phạm Văn Ty. 1978. Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Ngô Mỹ Ngân. 2010. Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại
chăn nuôi bò sữa. Luận văn đại học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp. 2012. Vi sinh vật học môi trường. Nxb. Đại học
Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Thị Mai Khanh, Phạm Thị Hiếu Trinh. 2009. Phân lập và
tuyển chọn các chủng Pseudomonas sp. ở ao nuôi cá tra. Hội nghị Công nghệ
Sinh học toàn quốc.
Vi sinh vật học K3
54
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Nguyễn Thành Nhân. 2008. Phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn
Pseudomonas khử đạm từ chất thải trại chăn nuôi. Luận văn thạc sĩ khoa học
ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Phạm Thị Tuyết Ngân. 2012. Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong
bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Luận án tiến sĩ Thủy sản, ngành
Nuôi trồng Thủy sảnh nước Măn, Lợ, Trường Đại học Cần Thơ.
Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Nhân Dũng, Dương Minh Viễn. 2011. Khảo sát mật độ và
sự đa dạng của vi khuẩn nitrat hóa trong ao nuôi tôm. Tạp chí Khoa học, Trường
Đại học Cần Thơ 20b: 69-78.
Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp. 2012. Định danh các vi khuẩn chuyển
hóa đạm bằng phép thử sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử. Kỷ yếu hội nghị
khoa học Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ lần 4:42-54.
Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh và Nguyễn Thị Thanh. 2007. Phân lập và tuyển chọn
các chủng nitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nước hồ ô nhiễm. Tạp chí Khoa học
Công nghệ 45(3): 95-100.
Trần Thanh Thủy. 1998. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật NXB Giáo Dục.
Trần Linh Thước. 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, NXB Giáo Dục.
Triệu Thị Ngọc Sang. 2010. Phân lập và khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn
Bacillus và Pseudomonas hiện diện trong ao nuôi cá tra. Luận văn thạc sĩ khoa
học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
TIẾNG ANH
Agerso Y. and Guardabassi L. 2005. Identification of Tet 39, a novel class of
tetracycline resistance determinant in Acinetobacter spp. of environmental and
clinical origin. J.Antimicrob.Chemother. 55:566-569.
Barr AE, Barbe MF and Clark BD. 2004. Work-related musculoskeletal disorders of
the hand and wrist: epidemiology, pathophysiology, and sensorimotor changes, J
Orthop Sports Phys Ther. 34:610–627.
Borneleit P, Blechschmidt B, Eschrich K and Kleber HP. 1991. β-Lactamase export
across the outer membrane of Acinetobacter calcoaceticus : perturbation of the
Vi sinh vật học K3
55
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
outer membrane lipopolysaccharide leaflet by enzyme overproduction, Arch
Microbiol. 155:500–504.
Bríou (J.) and Prévot (AR). 1954. Études de systématique bactérienne. X. Révision des
espèces réunies dans le genre Achromobacter, Annales de l'Institut Pasteur
(Paris), 86,722-728.
Bergogne-Bérézin E and Towner KJ. 1996. Acinetobacter spp. as nosocomial
pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features, Clin
Microbiol. 9:148-165.
Cuenca, A. A., Schetter, A., Aceto, D., Kemphues, K. and Seydoux, G.. 2003.
Polarization of the C. elegans zygote proceeds via distinct establishment and
maintenance phases, Development. 130:1255-1265.
Cornelis P (editor). 2008. Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology (1st ed.).
Caister Academic Press.
Curtis AC and Ingraham JL. 1983. Comparison of denitrification by Pseudomonas
stutzeri, Pseudomonas aeruginosa and Paracoccus denitrificans, Appl Environ
Microbiol. 45:1247-1253.
Dorsey. C. W, Tomaras, A. P. and Actis, L. A.. 2002. Genetic and phenotypic analysis
of Acinetobacter baumannii insertion derivatives generated with a Transposome
system, Appl Environ Microbiol. 68:6353–6360.
E-Bergogne Berezin và KJ Towner. 1996. Acinetobacter spp. as nosocomial
pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features, Clin
Microbiol. 9(2):148-165.
Gerischer, U. (Ed.). 2008. Acinetobacter: Molecular Biology. Academic Press.
G.D. Drysdale, H.D. Kasan and F. Bux. 1999. Denitrification by heterotrophic
bacteria during activated sludge treatment. Centre for Water and Wastewater
Research, Department of Biotechnology, Technikon Natal, PO Box 953, Durban
4000, South Africa. Water SA(25):357-362.
Haleem. D. A. E. 2003. Acinetobacter: environmental and biotechnological
applications. African Joumal of Biotechnology. 2(4):71-74.
H.J.M. Op den Camp, B. Kartal, D. Guvent, L.A.M.P. van Niftrik, S.C.M. Haaijer,
W.R.L. van der Star, K.T. van de Pas-Schoonen, A. Cabezas, Z. Ying, M.C.
Vi sinh vật học K3
56
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Schmid, M.M.M. Kuypers, J. van de Vossenberg, H.R. Harhangi, C. Picioreanu,
M.C.M. van Loosdrecht, J.G. Kuenen, M. Strous and M.S.M. Jetten. 2006.
Global impact and application of the anaerobic ammonium-oxidizing (anammox)
bacteria. Department of Microbiology, IWWR, Faculty of Science, Radboud
University Nijmegen, Toernooiveld 1(34):174-178.
Ingo Schmidt, Olav Sliekers, Markus Schmid, Eberhard Bock, John Fuerst, J.Gijs
Kuenen, Mike S.M. Jetten, Marc Strous. 2003. New concepts of microbial
treatment processes for the nitrogen removal in wastewater. EMS Microbiology
Reviews 4(27):481-492.
L Dijkshoorn , H Aucken , P Gerner-Smidt , P Janssen , ME Kaufmann , J Garaizar , J
Ursing và TL Pitt. 1996. Comparison of outbreak and nonoutbreak Acinetobacter
baumannii strains by genotypic and phenotypic methods, Clin Microbiol.
34(6):1519-1525.
Lalucat, J., Bennasar, A., Bosch, R., García-Valdés, E. and Palleroni, N. J.. 2006.
Biology of Pseudomonas stutzeri, Microbiol Mol Biol. 70:510–547.
Madden, T. 2003. ”16. The BLAST sequence analysis tool”, NCBI Handbook:
Querying and Linking the Data, 3:1-16.
Marcus Benz, Andreas Brune and Bernhard Schink. 1997. Anaerobic and aerobic
oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing
bacteria. Arch Microbiol. 169(2):159–165.
Mulder, A. 1989. Anocxic ammonia oxidation. International application published
under the patent coopperation treaty (PCT) PCT/NL89/00004.
Parales R E and Haddock J D. 2004. Biocatalytic degradation of pollutants, Curr Opin
Biotechnol. 15(4):374–379.
Ortega-Calvo J.J., Marchenko A.I., Vorobyov A.V. and Borovick, R.V.. 2003.
Chemotaxis in polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from
coal-tar and oil-olluted rhizospheres, FEMS Microbiology Ecology. 44:373-381.
Rossello-Mora R. and Amann R. 2001. The species concept for prokaryotes, FEMS
Microbiol. 25:39–67.
Smith, S. J., Andres, R., Conception, E., and Lurz, J.. 2004. Sulfur DioxideEmissions:
1850–2000(JGCRIReport.PNNL-14537).
Vi sinh vật học K3
57
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Sikorski, J., Rossello-Mora, R. and Lorenz, M. G.. 1999. Analysis of genotypic
diversity and relationships among Pseudomonas stutzeri strains by PCR-based
genomic fingerprinting and multilocus enzyme electrophoresis, Syst Appl
Microbiol. 22:393–402.
Thomson JM and Bonomo RA. 2005. The threat of antibiotic resistance in Gramnegative pathogenic bacteria: beta-lactams in peril, Curr Opin Microbiol.
8(5):18-24.
Ye J., S. MeGinnis and T. L. Madden. 2006. ”BLAST: improvements for better
sequence analysis”, Nucleic research, Web server issue.34:6-9.
Zumft, W. G. 1997. ”Cell biology and molecular basis of denitrification” microbiology
and molecular biology. 61(4):533-616.
TRANG WEB
http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/moi-truong-nuoi-cay-culture
-
medium.html (Ngày 10/7/2013).
http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/printthread.php?tid=412 (Ngày 10/7/2013).
http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/953/Qui-trinh
-
nuoi-cay-phan-lap-vi-khuan-Neisseria-meningitidis.vhtm (Ngày 28/7/2013).
http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/amon-hoa-protein-qua-trinh-thoi-rua-.887068.html (Ngày
30/7/2013).
http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas (Ngày 2/8/2013).
http://vi.wikipedia.org/wiki/Tr%E1%BB%B1c_khu%E1%BA%A9n (Ngày 2/8/2013).
http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx,
(Ngày
21/07/2013).
http://www.psmicrographs.co.uk/bacteria-cells--bacillus-sp--/science-image/13961b bacillus (Ngày 18/11/2013).
http://www.psmag.com/science-environment/slick-willy-24318/ (Ngày 18/11/2013).
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (Ngày 16/11/2013).
Vi sinh vật học K3
58
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả
Số liệu test hoạt tính enzyme protease
Protease
STT
Ngày 1
Dòng
Ngày 2
Ngày 3
Khuẩn
lạc(cm)
Vòng
sáng(cm)
Khuẩn
lạc(cm)
Vòng
sáng(cm)
Khuẩn
lạc(cm)
Vòng
sáng(cm)
1
M1.1
-
-
-
-
-
-
2
M1.2
-
-
-
-
-
-
3
M2
-
-
0,9
1,9
1,4
3,75
4
M2.1
0,85
1,45
1,05
2,05
1,5
2,35
5
M3
0,75
1,35
0,95
2,15
1,0
2,6
6
M4
-
-
0,7
1,25
0,95
1,3
7
M5
-
-
-
-
-
-
8
M6
-
-
-
-
-
-
9
M8
0,8
1,2
1,0
2,15
1,2
2,6
10
M9
-
-
-
-
-
-
11
T1.1
-
-
0,7
1,25
0,8
1,95
12
T1.2
0,8
1,25
1,0
1,6
1,3
2,5
13
T2
-
-
-
-
-
-
14
T4
-
-
-
-
-
-
15
T5
-
-
-
-
-
-
16
T6
-
-
0,75
1,7
1,55
2,55
17
T8
-
-
-
-
-
-
18
T9
-
-
0,95
1,85
1,4
3,6
Vi sinh vật học K3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Số liệu thí nghiệm xác định khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn phân
lập:
Đường chuẩn ngày 1
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ trong môi trường Lewis lúc 8h ngày 1
STT
1
Dòng vi
khuẩn
ĐC
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
1
2
3
1
2
3
Trung bình
1,658
1,597
1,581
11,867
11,441
11,329
11,545
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày
1
STT
Dòng vi
khuẩn
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
1
ĐC
1,541
1,482
1,515
11,049
10,636
10,867
Trung
bình
10,851
2
M4
1,386
1,453
1,46
9,965
10,434
10,483
10,294
3
T6
1,581
1,626
1,628
11,329
11,643
11,657
11543
4
M2.1
1,575
1,541
1,572
11,287
11,049
11,266
11,2
5
T1.1
1,634
1,68
1,682
11,699
12,021
12,035
11,918
6
M2
1,689
1,621
1,686
12,084
11,608
12,063
11,918
7
T9
1,742
1,715
1,77
12,455
12,266
12,65
12,457
8
M3
1,715
1,76
1,715
12,266
12,58
12,266
12,371
9
M8
1,581
1,557
1,596
11,329
11,161
11,434
11,308
10
T1.2
1,516
1,523
1,57
10,874
10,923
11,252
11,016
Vi sinh vật học K3
1
2
3
1
2
3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày
1
STT
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng vi
khuẩn
1
ĐC
1,532
1,511
1,541
10,923
11,133
11,119
Trung
bình
11,058
2
M4
1,584
1,644
1,49
10,497
10,021
10,713
10,41
3
T6
1,584
1,545
1,487
11,217
11,049
10,538
10,935
4
M2.1
1,508
1,496
1,733
11,287
11,196
11.224
11,235
5
T1.1
1,702
1,593
1,771
10,867
10,902
11,266
11,012
6
M2
1,591
1,605
1,632
10,825
11,231
11,783
11,28
7
T9
1,78
1,725
1,551
10,734
10,322
10,594
10,55
8
M3
1,596
1,382
1,547
10,448
10,455
11,357
10,753
9
M8
1,547
1,725
1,726
12,021
11,825
11,685
11,844
10
T1.2
1,537
1,581
1,611
11,972
12,042
12,524
12,179
1
2
3
1
2
3
Đường chuẩn ngày 2
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 8h ngày
2
STT
1
2
3
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng
vi
khuẩn
1
2
3
1
2
3
ĐC
M4
T6
1,451
1,627
1,72
1,494
1,633
1,808
1,409
1,677
1,827
10,266
11,484
12,127
10,563
11,525
12,736
9,975
11,83
12,868
Vi sinh vật học K3
Trung
bình
10,268
11,613
12,577
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
4
5
6
7
8
9
10
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
Trường Đại học Cần Thơ
1,739
1,394
1,645
1,435
1,414
1,554
1,166
1,719
1,334
1,672
1,47
1,325
1,656
1,76
1,84
1,386
1,579
1,408
1,373
1,679
1,76
12,259
9,871
11,608
10,155
10,01
10,979
8,293
12,12
9,456
11,795
10,397
9,394
11,684
12,404
12,958
9,816
11,152
9,968
9,726
11,844
12,404
12,446
9,714
11518
10,173
9,71
11,502
11,034
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày
2
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng vi
khuẩn
1
2
3
1
2
3
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
1,434
1,312
1,419
1,285
1,239
1,345
1,21
1,431
1,141
1,656
1,475
1,39
1,386
1,421
1,274
1,351
1,124
1,351
1,308
1,512
1,476
1,396
1,342
1,493
1,286
1,415
1,126
1,319
1,297
1,405
10,148
9,304
10,044
9,117
8,799
9,532
8,598
10,127
8,12
11,684
10,432
9,844
9,816
10,058
9,041
9,574
8,003
9,574
9,276
10,688
10,439
9,885
9,511
10,556
9,124
10,017
8,017
9,352
9,2
9,947
Trung
bình
10,34
9,678
9,791
9,91
8,988
9,707
8,206
9,684
8,866
10,773
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày
2
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng vi
khuẩn
1
2
3
1
2
3
1
ĐC
1,453
1,387
1,422
10,28
9,823
10,065
Trung
bình
10,056
2
M4
1,276
1,324
1,267
9,055
9,387
8,992
9,145
3
T6
1,313
1,377
1,43
9,311
9,754
10,12
9,728
4
M2.1
1,385
1,362
1,29
9,809
9,65
9,152
9,537
5
T1.1
1,318
1,389
1,328
9,345
9,837
9,415
9,532
6
M2
1,261
1,277
1,228
8,951
9,062
8,722
8,912
7
T9
1,255
1,279
1,23
8,909
9,075
8,736
8,907
8
M3
1,284
1,342
1,315
9,11
9,511
9,325
9,315
9
M8
1,378
1,34
1,314
9,761
9,498
9,318
9,525
10
T1.2
1,453
1,355
1,307
10,28
9,601
9,269
9,717
STT
Vi sinh vật học K3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Đường chuẩn ngày 3
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 8h ngày
3
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng vi
khuẩn
1
2
3
1
2
3
1
ĐC
1,357
1,433
1,383
8,975
9,469
9,144
Trung
bình
9,196
2
M4
1,354
1,358
1,303
8,955
8,981
8,623
8,853
3
T6
1,489
1,509
1,594
9,833
9,964
10,517
10,105
4
M2.1
1,238
1,354
1,176
8,2
8,955
7,797
8,318
5
T1.1
1,2
1,218
1,256
7,953
8,07
8,318
8,114
6
M2
1,225
1,09
1,202
8,116
7,237
7,966
7,773
7
T9
1,241
1,276
1,202
8,22
8,448
7,966
8,211
8
M3
1,28
1,294
1,237
8,474
8,565
8,194
8,411
9
M8
1,178
1,247
1,21
7,81
8,259
8,018
8,029
10
T1.2
1,54
1,468
1,457
10,165
9,697
9,625
9,829
STT
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 12h ngày
3
Dòng vi
STT
khuẩn
1
2
3
4
5
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
Vi sinh vật học K3
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
1
2
3
1
2
3
1,404
1,19
1,082
1,187
1,062
1,378
1,068
1,03
1,331
1,068
1,346
1,142
1,228
1,294
1,01
9,28
7,888
7,185
7,869
7,055
9,111
7,094
6,847
8,805
7,094
8,903
7,576
8,135
8,565
6,717
Trung
bình
9,098
7,519
7,389
8,413
6,956
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
6
7
8
9
10
M2
T9
M3
M8
T1.2
1,2
0,978
1,176
1,152
1,126
Trường Đại học Cần Thơ
1,162
1,072
1,258
1,133
1,152
1,2
1,018
1,341
1,187
1,14
7,953
6,509
7,797
7,641
7,472
7,706
7,12
8,331
7,517
7,641
7,953
6,769
8,871
7,869
7,563
7,871
6,799
8,333
7,676
7,558
Số liệu OD và hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn phân giải lúc 16h ngày
3
Lượng NH4+ (µg/ml/)
OD (636nm)
Dòng
vi
khuẩn
1
2
3
1
2
3
1
ĐC
1,346
1,377
1,339
8,903
9,105
8,858
Trung
bình
8,955
2
M4
1,4
1,401
1,397
9,254
9,261
9,235
9,25
3
T6
1,43
1,448
1,482
9,45
9,567
9,788
9,601
4
M2.1
1,654
1,541
1,457
10,907
10,172
9,625
10,235
5
T1.1
1,396
1,367
1,311
9,228
9,04
8,675
8,981
6
M2
1,371
1,428
1,397
9,066
9,437
9,235
9,246
7
T9
1,257
1,306
1,302
8,324
8,643
8,617
8,528
8
M3
1,624
1,667
1,697
10,712
10,992
11,187
10,963
9
M8
1,474
1,582
1,518
9,736
10,439
10,022
10,065
10
T1.2
1,39
1,37
1,408
9,189
9,059
9,306
9,185
STT
Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê
Kết quả phân tích khả năng phân giải đạm của các dòng vi khuẩn
One-way ANOVA: 8h ngày 1 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
0,0000
0,0000
0,00
1,000
Error
20
1,6147
0,0807
Total
29
1,6147
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
Vi sinh vật học K3
N
3
3
3
3
3
3
Mean
11,545
11,545
11,545
11,545
11,545
11,545
Grouping
A
A
A
A
A
A
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
T9
M3
M8
T1.2
Trường Đại học Cần Thơ
3
3
3
3
11,545
11,545
11,545
11,545
A
A
A
A
One-way ANOVA: 12h ngày 1 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
12,7840
1,4204
34,18
0,000
Error
20
0,8312
0,0416
Total
29
13,6151
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
N
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
10,851
10,294
11,543
11,2
11,918
11,918
12,457
12,371
11,308
11,016
Grouping
E
F
C
CD
B
B
A
A
CD
DE
One-way ANOVA: 16h ngày 1 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
8,0942
0,8994
9,15
0,000
Error
20
1,9649
0,0982
Total
29
10,0591
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
Vi sinh vật học K3
N
3
3
3
3
3
3
Mean
11,058
10,41
10,935
11,235
11,012
11,28
Grouping
BC
D
BCD
B
BC
B
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
T9
M3
M8
T1.2
Trường Đại học Cần Thơ
3
3
3
3
10,55
10,753
11,844
12,179
CD
BCD
A
A
One-way ANOVA: 8h ngày 2 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
29,941
3,327
5,02
0,001
Error
20
13,252
0,663
Total
29
43,194
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
N
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
10,268
11,613
12,577
12,446
9,714
11,518
10,173
9,71
11,502
11,034
Grouping
BCD
AB
A
A
D
ABC
CD
D
ABC
BCD
One-way ANOVA: 12h ngày 2 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
14,816
1,646
7,18
0,000
Error
20
4,583
0,229
Total
29
19,399
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
Vi sinh vật học K3
N
3
3
3
3
3
3
Mean
10,34
9,678
9,791
9,91
8,988
9,707
Grouping
AB
BCD
BC
B
CDE
BC
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
T9
M3
M8
T1.2
Trường Đại học Cần Thơ
3
3
3
3
8,206
9,684
8,866
10,773
E
BC
DE
A
One-way ANOVA: 16h ngày 2 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
3,6899
0,4100
4,75
0,002
Error
20
1,7275
0,0864
Total
29
5,4174
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
N
Mean
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10,056
9,145
9,728
9,537
9,532
8,912
8,907
9,315
9,525
9,717
Grouping
A
CD
AB
BC
BC
D
D
BCD
BC
AB
One-way ANOVA: 8h ngày 3 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
16,908
1,879
17,60
0,000
Error
20
2,135
0,107
Total
29
19,043
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
N
Mean
ĐC
3
9,196
B
M4
3
8,853
BC
T6
3
10,105
M2.1
3
8,318
Vi sinh vật học K3
Grouping
A
CDE
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
Trường Đại học Cần Thơ
T1.1
3
8,114
DE
M2
3
7,773
E
T9
3
8,211
DE
M3
3
8,411
M8
3
8,029
T1.2
3
9,829
CD
DE
A
One-way ANOVA: 12h ngày 3 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
13,111
1,457
10,69
0,000
Error
20
2,726
0,136
Total
29
15,837
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
N
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
9,098
7,519
7,389
8,413
6,956
7,871
6,799
8,333
7,676
7,558
Grouping
A
CD
CDE
B
DE
BC
E
B
C
CD
One-way ANOVA: 16h ngày 3 versus mẫu
Source
DF
SS
MS
F
P
mẫu
9
14,2461
1,5829
19,72
0,000
Error
20
1,6053
0,0803
Total
29
15,8514
Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD
mẫu
ĐC
M4
Vi sinh vật học K3
N
3
3
Mean
8,955
9,25
Grouping
EF
DE
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013
T6
M2.1
T1.1
M2
T9
M3
M8
T1.2
Vi sinh vật học K3
3
3
3
3
3
3
3
3
Trường Đại học Cần Thơ
9,601
10,235
8,981
9,246
8,528
10,963
10,065
9,185
CD
B
EF
DE
F
A
BC
DE
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
[...]... sinh Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm mạnh sẽ giúp ích cho vi c xử lý nước thải trong công nghiệp, sinh hoạt và các làng nghề truyền thống 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn triển vọng có khả năng phân giải đạm trong nước thải từ các làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng nhằm hướng tới vi c ứng dụng những dòng vi khuẩn này vào một số quy... đây, vi c làm bánh Pía hoàn toàn mang tính thủ công và phục vụ cho nhu cầu của từng gia đình Đến đầu thế kỷ 19, người đầu tiên làm bánh Pía để kinh doanh và truyền nghề cho con cháu sau này là ông Đặng Thuận sinh sống ở làng Vũng Thơm (nay là xã Phú Tâm, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng) Hình 2.1: Tân Huê Vi n - cơ sở sản xuất bánh pía nổi tiếng của tỉnh Sóc Trăng (Nguồn: http://vietnam.vnanet.vn/vnp /vi- vn/13/117/117/35293/default.aspx,... quy trình xử lý nước thải và sản xuất chế phẩm Sinh học Vi sinh vật học K3 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về nghề làm bánh Pía Bánh pía có nguồn gốc từ bánh Trung Thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ) Bánh do một số người Minh Hương di cư sang Vi t Nam từ thế kỷ 17 mang... của quá trình xử lý nước thải trên tỷ lệ kháng kháng sinh ở Acinetobacter spp trong nước thải và nguồn nước sử dụng của nó Trong hai sự kiện khác nhau (nhiệt độ cao, dòng chảy cao, 31oC và nhiệt độ thấp, dòng thấp, 8oC), 366 chủng Acinetobacter spp được phân lập từ năm địa điểm khác nhau, ba nguồn trong một nhà máy xử lý nước thải (nguyên liệu vào, nước thải, nước thải cuối cùng) và hai nguồn trong... đồng hình với dòng Bacillus subtilis BL10 (99%) Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae 3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%) Cả 02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%) Trần Liên Hà et al.,(2007) bốn chủng vi khuẩn nitrate hóa được phân lập từ nước của 7 mẫu nước hồ và 2 mẫu đất... của nước thải công nghiệp (nước thải sản xuất) Nước thải công nghiệp là loại nước thải từ các nhà máy đang hoạt động sản xuất, phụ thuộc loại hình công nghiệp Nước thải công nghiệp nói chung khác nhau ở mỗi ngành nghề, ở mỗi cơ sở sản xuất Phụ thuộc vào quá trình sản xuất của mỗi làng nghề (nước rửa nguyên liệu, sản phẩm, thiết bị, nước thải trong quá trình chế biến) Đặc tính ô nhiễm và nồng độ của nước. .. của vi khuẩn Bacillus là một loại vi khuẩn không gây bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng đối kháng với các loại vi sinh vật khác để phục hồi thế cân bằng sinh thái của hệ vi khuẩn đường ruột Đặc biệt là khả năng hình thành bào tử rất cao Môi trường sống chủ yếu của vi khuẩn Bacillus là đất, nước và bùn có rất nhiều tế bào và bào tử (Greem et al., 1999) Hoàng Thùy Long (1991), Bacillus làm. .. kiểm tra catalase và oxidase Pseudomonas cũng cho kết quả âm tính với indol, methylred và Voges Proskauer Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi nhưng được tìm thấy chính ở trong đất và nước, ngoài ra còn tìm thấy trên động vật, thực vật, và nhiều dòng cũng được phân lập từ các mẫu bệnh lý Một số dòng Pseudomonas có khả năng khử nitrate: Pseudomonas fluoresens: trực khuẩn nhỏ, có... hoặc phân giải ra NH3, NH4(+) Khi phân giải các acid amin chứa S (như methionine, cystine, cysteine) vi sinh vật giải phóng ra H2S và nếu tích lũy nhiều trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng Khi phân giải tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon và scaton Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các acid amin có thể độc với người và gia súc, đáng chú ý là histamin,... được quan sát rất sớm trong lịch sử của ngành vi sinh vật học Tên Pseudomonas được đặt cho những loại sinh vật này, được xác định bằng những thuật ngữ khá mơ hồ vào năm 1984 như một giống vi khuẩn Gram âm, hình que và có chiên mao ở cực Pseudomonas được phân lập nhiều từ tự nhiên và một số lượng lớn các dòng giống nhau được cho là cùng Vi sinh vật học K3 23 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt