Chọn một số dòng vi khuẩn khử đam mạnh có được từ kết quả của thí nghiệm
trên, tiến hành nhận diện bằng phương pháp PCR và giải trình tự.
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải đạm, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt để nhận diện bằng phương pháp PCR sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau:
Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Quy trình trích DNA:
Nuôi vi khuẩn trong 6ml môi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml.
Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa.
Hòa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định
trong môi trường, không bị biến tính).
Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hoàn toàn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn).
Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch.
Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phóng ADN). Ủ ở 65oCtrong 20 phút.
Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần không phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa có tạo màng protein ngăn cách).
Trộn đều và ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml
Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN không biến tính và
bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút.
Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hoá chất đã dùng trước đó hay tạp chất còn lẫn), ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng trong 1-2h hoặc sấy khô bằng máy ly tâm chân không.
Trữ ở 20oC.
Điện di sản phẩm trên agarose gel Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di Sau khi điện di, tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận diện các dòng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rõ nét chọn ra các dòng vi khuẩn giải trình tự. Mẫu được gởi giải trình tự tại Công ty TBR, Tp Hồ Chí Minh.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN