Phương pháp đường chuẩn:
- Đặc điểm của phương pháp:
+ Phương pháp đường chuẩn áp dụng thuận tiện cho phép phân tích hàng loạt mẫu và cho phép tính kết quả nhanh.
+ Điều kiện áp dụng: Xác định nồng độ nằm trong khoảng tuân theo định luật Bia.
+ Pha chế một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ NH4+ tăng dần, còn lượng thuốc thử và các điều kiện khác như nhau (pH, dung môi, lực ion, bước sóng…). Đo mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn và xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(C) xử lý bằng toán học thống kê, đường chuẩn thu được phải có dạng:
A = (a ± εa) + (b ± εb).C (*)
+ Nếu đường chuẩn thu được có những điểm đầu hoặc điểm cuối (nồng độ) bị lệch khỏi đường thẳng của (*) trên đồ thị thì phải loại bỏ các giá trị đó. Tiến hành xây dựng lại phương trình đường chuẩn (nếu cần).
+ Pha chế dung dịch phân tích trong các điều kiện như trên rồi đem đo mật độ quang (Ax). Thay Ax vào (*) ta sẽ tính được Cx.
Hóa chất:
Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl vào trong 100ml nước cất.
Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ
lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được
dung dịch 2 µg/ml
Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong
nước được 0.5 lít.
Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5 lít.
Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Lewis lỏng
Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5 lít.
Pha buffer: cho 15ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5 ml H2O : 0 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4 ml H2O: 1 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3 ml H2O: 2 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2 ml H2O: 3 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1 ml H2O: 4 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
Hút 1ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf (3 lần lặp lại). Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 0.5ml dịch vi khuẩn đã ly tâm vào 4ml H2O, 5ml buffer, sau đó cho 5ml thuốc thử.
Cách tiến hành:
Trước tiên nuôi các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường LB lỏng trong 12h, lấy 2ml dung dịch vi khuẩn cho vào tube enpendoft 2,5 đem ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trường ở trên rồi rửa lại với 1,5 ml nước muối sinh lý 8,5‰ tiếp tục đem ly tâm, sau đó đổ bỏ phần dung dịch làm như vậy với 2 lần nước cất khử trùng, sau đó chủng vi khuẩn vào môi trường Lewis lỏng nuôi trên máy lắc, tiến hành đo mỗi 4h trong 3 ngày liên tiếp (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012).