- Đĩa Petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh.
- Cân điện tử Sartorius, pH kế, micropipet, kim cấy, bi trải mẫu. - Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc, tủ lạnh giữ mẫu
- Nồi khử trùng nhiệt ướt và một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật.
- Chai hoặc hộp nhựa có nắp đậy, vải lược.
Hình 3.1: Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm 3.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu và hóa chất
Bảng 3.1: Môi trường Meat Extract – pepton (MP)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Meat extract 0,5
Pepton 1
Nước cất 100ml
Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Bảng 3.2: Môi trường LB (Luria-Bertani)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Yeast extract 0,5 Pepton 1 NaCl 1 Nước cất 100ml Agar 2 Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Bảng 3.3: Môi Trường MSB + 2% Skim milk
Hóa chất Stock Thể Tích 100ml K2HPO4 0,45g/0,5l 11,25ml KH2PO4 0,34/0,5l 17ml (NH4)2SO4 1g/10ml 2ml MgCl2 0,5g/10ml 320µl Stock 1 MnCl2 0,1g 10ml 10µl FeSO4 0,6g CaCl2 2,6g Stock vi lượng Na2MoO4 0,02g 100ml 10µ ZnCl2 0,01g CaCl2 0,01g CuSO4 0,01g NiSO4 0,001g Na2SeO4 0,001g Khử trùng ở 121oC trong 21 phút.
Bảng 3.4: Môi Trường Lewis (1958)
Hóa chất Stock Thể Tích 100ml K2HPO4 7g/100ml 1ml MgSO4 2g/100ml 0,5ml NaHCO3 0,05g (NH4)2SO4 5g/100ml 0,5ml FeCl3.6H2O 230,4mg/40ml 250µl CaCl2.2H2O 0,8g/100ml 320µl pH 7 Khử trùng ở 121oC trong 21 phút. Cycloheximide (Chất kháng nấm) Nước muối sinh lý 8,5‰.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
-Nguyên liệu: nước thải được lấy từ 2 cơ sở Tân Huê Viên và Mỹ Trân ở Sóc Trăng.
3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn khử đạm
Mục đích: phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao.
Đối tượng: Các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng.
Phân lập: Lấy 20 ml dung dịch nước thải + 180 ml nước cất ( Pha loãng 10-1 )
cho vào bình tam giác thủy tinh. Lắc đều.
Tiến hành pha loãng mẫu dung dịch trên theo trình tự độ pha loãng sau: 10-2, 10-3. Mỗi độ pha loãng lấy 1 ml trải lên đĩa petri có chứa môi trường Meat extract-
Pepton có bổ sung 2% Agar (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24h.
Tiếp tục cấy phân lập lần thứ 2 để chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau.
Cấy chuyển: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa riêng có chứa môi trường Meat Extract-
Pepton-Agar, sau đó đem ủ ở 30oC. Cứ tiếp tục cấy chuyển đến khi khuẩn lạc đồng
nhất về hình dạng, kích thước rồi kiểm tra độ ròng của vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Lưu ý: Tất cả các thao tác đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển đều phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Nuôi tăng sinh: vi khuẩn đã phân lập ròng được nuôi tăng sinh trong môi trường Luria Bertani (LB).
3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập phân lập
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn khử đạm khác nhau ta tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng: quan sát hình thể tế bào, nhuộm Gram, thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Protease, Thử nghiệm tính di động.
3.2.3.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học
Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc
Hình dạng
Màu sắc
Bề mặt
Đo kích thước tế bào vi khuẩn
Đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).
Đặt thước trắc vi vật kính (được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10 m) vào bán kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ hình ảnh của thước.
Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính (là một miếng kính tròn trên đó có chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho hai thước song song và gần sát nhau
Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và vạch thứ hai nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.
Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thước sau:
x = (N/n)* 10 m
Trong đó:
x: Trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính. N: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, N=6. n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n=35. Ta có: x=(6/35)*10 m
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.3.2. Xác định Gram của vi khuẩn
Nhuộm Gram:
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
Lấy 10μL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin.
Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
3.2.3.3. Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
H2O2 H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide)
Cách tiến hành:
- Nhỏ trực tiếp 1-2 giọt H2O2 30% tiếp lên khuẩn lạc ròng của vi khuẩn được nuôi trên môi trường đĩa thạch.
- Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
3.2.3.5. Khả năng di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Cách tiến hành:
- Cấy sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).
- Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. - Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
3.2.3.6. Khảo sát hoạt tính enzyme protease
- Môi trường: MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5 µl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%) và ủ ở 30oC. Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn.
3.2.4. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn phân giải đạm
Phương pháp đường chuẩn:
- Đặc điểm của phương pháp:
+ Phương pháp đường chuẩn áp dụng thuận tiện cho phép phân tích hàng loạt mẫu và cho phép tính kết quả nhanh.
+ Điều kiện áp dụng: Xác định nồng độ nằm trong khoảng tuân theo định luật Bia.
+ Pha chế một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ NH4+ tăng dần, còn lượng thuốc thử và các điều kiện khác như nhau (pH, dung môi, lực ion, bước sóng…). Đo mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn và xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(C) xử lý bằng toán học thống kê, đường chuẩn thu được phải có dạng:
A = (a ± εa) + (b ± εb).C (*)
+ Nếu đường chuẩn thu được có những điểm đầu hoặc điểm cuối (nồng độ) bị lệch khỏi đường thẳng của (*) trên đồ thị thì phải loại bỏ các giá trị đó. Tiến hành xây dựng lại phương trình đường chuẩn (nếu cần).
+ Pha chế dung dịch phân tích trong các điều kiện như trên rồi đem đo mật độ quang (Ax). Thay Ax vào (*) ta sẽ tính được Cx.
Hóa chất:
Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl vào trong 100ml nước cất.
Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ
lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được
dung dịch 2 µg/ml
Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong
nước được 0.5 lít.
Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5 lít.
Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Lewis lỏng
Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5 lít.
Pha buffer: cho 15ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5 ml H2O : 0 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4 ml H2O: 1 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3 ml H2O: 2 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2 ml H2O: 3 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1 ml H2O: 4 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
Hút 1ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf (3 lần lặp lại). Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 0.5ml dịch vi khuẩn đã ly tâm vào 4ml H2O, 5ml buffer, sau đó cho 5ml thuốc thử.
Cách tiến hành:
Trước tiên nuôi các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường LB lỏng trong 12h, lấy 2ml dung dịch vi khuẩn cho vào tube enpendoft 2,5 đem ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trường ở trên rồi rửa lại với 1,5 ml nước muối sinh lý 8,5‰ tiếp tục đem ly tâm, sau đó đổ bỏ phần dung dịch làm như vậy với 2 lần nước cất khử trùng, sau đó chủng vi khuẩn vào môi trường Lewis lỏng nuôi trên máy lắc, tiến hành đo mỗi 4h trong 3 ngày liên tiếp (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012).
3.2.5. Định danh bằng kỹ thuật PCR
Chọn một số dòng vi khuẩn khử đam mạnh có được từ kết quả của thí nghiệm
trên, tiến hành nhận diện bằng phương pháp PCR và giải trình tự.
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải đạm, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải đạm tốt để nhận diện bằng phương pháp PCR sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau:
Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Quy trình trích DNA:
Nuôi vi khuẩn trong 6ml môi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml.
Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa.
Hòa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định
trong môi trường, không bị biến tính).
Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hoàn toàn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn).
Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch.
Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phóng ADN). Ủ ở 65oCtrong 20 phút.
Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần không phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa có tạo màng protein ngăn cách).
Trộn đều và ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml
Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN không biến tính và
bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút.
Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hoá chất đã dùng trước đó hay tạp chất còn lẫn), ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng trong 1-2h hoặc sấy khô bằng máy ly tâm chân không.
Trữ ở 20oC.
Điện di sản phẩm trên agarose gel Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di Sau khi điện di, tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận diện các dòng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rõ nét chọn ra các dòng vi khuẩn giải trình tự. Mẫu được gởi giải trình tự tại Công ty TBR, Tp Hồ Chí Minh.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
4.1.1. Kết quả phân lập và địa điểm của các dòng vi khuẩn
Từ 2 mẫu nước thải thu từ 2 cơ sở sản xuất Bánh Pía Tân Huê Viên và Mỹ Trân. Sau quá trình phân lập tách ròng trên môi trường Meat extract – Pepton – Agar (MPA) đã phân lập được tất cả 18 dòng vi khuẩn. (Bảng 4.1)
Bảng 4.1: Nguồn gốc vi khuẩn đã phân lập
STT Dòng vi khuẩn Địa điểm phân lập
1 M1.1 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
2 M1.2 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
3 M2 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
4 M2.1 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
5 M3 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
6 M4 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
7 M5 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
8 M6 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
9 M8 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
10 M9 Mỹ Trân, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng
11 T1.1 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
12 T1.2 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
13 T2 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
14 T4 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
15 T5 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
16 T6 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
17 T8 Tân Huê Viên, Huyện Châu Thành, Tỉnh Sóc Trăng
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Từ mẫu cấy trải trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar(MPA) có bổ sung chất kháng nấm chọn ra những khuẩn lạc khác nhau cấy phân lập qua từng đĩa môi trường MPA.
Hình 4.1: Mẫu cấy trải vi khuẩn trên môi trường Meat extract-Pepton-Agar
A : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-1 B : Nước thải của lò bánh Pía Tân Huê Viên ở nồng độ pha loãng 10-3 C : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-1 D : Nước thải của lò bánh Pía Mỹ Trân ở nồng độ pha loãng 10-3
A C
Sau khi phân lập ròng tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này lên đĩa petri có chứa