Mục đích: phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao.
Đối tượng: Các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng.
Phân lập: Lấy 20 ml dung dịch nước thải + 180 ml nước cất ( Pha loãng 10-1 )
cho vào bình tam giác thủy tinh. Lắc đều.
Tiến hành pha loãng mẫu dung dịch trên theo trình tự độ pha loãng sau: 10-2, 10-3. Mỗi độ pha loãng lấy 1 ml trải lên đĩa petri có chứa môi trường Meat extract-
Pepton có bổ sung 2% Agar (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24h.
Tiếp tục cấy phân lập lần thứ 2 để chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau.
Cấy chuyển: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa riêng có chứa môi trường Meat Extract-
Pepton-Agar, sau đó đem ủ ở 30oC. Cứ tiếp tục cấy chuyển đến khi khuẩn lạc đồng
nhất về hình dạng, kích thước rồi kiểm tra độ ròng của vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Lưu ý: Tất cả các thao tác đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển đều phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Nuôi tăng sinh: vi khuẩn đã phân lập ròng được nuôi tăng sinh trong môi trường Luria Bertani (LB).
3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập phân lập
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn khử đạm khác nhau ta tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng: quan sát hình thể tế bào, nhuộm Gram, thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Protease, Thử nghiệm tính di động.
3.2.3.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học
Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc
Hình dạng
Màu sắc
Bề mặt
Đo kích thước tế bào vi khuẩn
Đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).
Đặt thước trắc vi vật kính (được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10 m) vào bán kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ hình ảnh của thước.
Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính (là một miếng kính tròn trên đó có chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho hai thước song song và gần sát nhau
Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và vạch thứ hai nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.
Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thước sau:
x = (N/n)* 10 m
Trong đó:
x: Trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính. N: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, N=6. n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n=35. Ta có: x=(6/35)*10 m
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.3.2. Xác định Gram của vi khuẩn
Nhuộm Gram:
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
Lấy 10μL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin.
Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
3.2.3.3. Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
H2O2 H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide)
Cách tiến hành:
- Nhỏ trực tiếp 1-2 giọt H2O2 30% tiếp lên khuẩn lạc ròng của vi khuẩn được nuôi trên môi trường đĩa thạch.
- Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
3.2.3.5. Khả năng di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Cách tiến hành:
- Cấy sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).
- Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. - Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
3.2.3.6. Khảo sát hoạt tính enzyme protease
- Môi trường: MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5 µl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có bổ sung sữa gầy (2%) và ủ ở 30oC. Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn.